CN103898210B - 基因dna序列捕获探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因DNA序列捕获探针的制备方法，技术方案为：1）、设计两条部分互补的引物，经退火处理后形成一个部分双链结构的开叉形接头，与目标基因的普通PCR扩增产物（A1）进行连接反应，得到两端带有接头的目标基因（A2）；2）、针对接头序列设计相应的引物，对所述A2进行扩增，得到带有T7启动子的扩增产物（A3）；3）、对上述产物（A3）进行定量后，在一定的条件下，加入带有生物素标记的NTP(其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记)，进行体外转录反应，最终得到带有生物素标记的RNA探针（基因DNA序列捕获探针）。

Description

基因DNA序列捕获探针的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种可用于多个目标基因序列进行捕获后进行二代测序的探针制作方法。

背景技术

新一代测序技术的发展，为现代基因组学的研究打开了新的局面，使得普通实验室对整个人类基因组进行测序成为可能，然而全基因组测序的实验成本和对科研人员的分析能力的要求还是很高，而且由于大部分基因的功能还不是很清楚，对所产生的海量数据进行生物信息学分析将是一项巨大的挑战。

在新一代测序技术以前，人们对基因组大片段特定区域的研究主要通过PCRwalking后进行传统毛细管测序的方法。这种方法的问题是目标片段大于500kb时PCR和测序的成本会变得让研究人员难以承受。而传统的单基因疾病的解决方案是家系连锁定位，最后定位的区域往往是以兆（M）bp来计算的，这就为后续的研究工作带来了困难。

随着新的研究方法的产生，目标序列捕获、全外显子捕获等方法能更加经济有效的靶定基因组的相应区域。而且这些方法产生的大量DNA片段非常适合使用新一代测序平台进行测序。通过这些技术的组合，人们对于遗传疾病的研究的效率大大的提高。

分子诊断市场无比广大，但是诊断市场对成本的要求更为苛刻，至少全基因组测序在很长的一段时间内无法进入分子诊断市场，这就是目标序列捕获测序的机会。例如DMD基因，长度2500kb，由79个外显子和78个内含子构成，其突变是引起杜氏进行性肌营养不良病的原因，非常适合采用靶向测序。还有一些遗传病在表型上非常相似，但可能是目前已知基因变异的一种，这样我们也可以把这些变异区域并在一起，设计目标序列探针并捕获测序，这比传统的PCR后毛细管测序通量高，速度快，深度深。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对目标基因进行有效捕获的探针的制作方法。应用该方法能够实现对多个靶基因区域同时进行快速高效地捕获，以更快更有效地锁定致病位点。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因DNA序列捕获探针的制备方法，包括以下步骤：

一、制备接头：

1）、设计两条部分互补的引物，所述两条引物之间的互补度为30～50%（较佳为35～45%，进一步较佳为40%）；其中一条引物中含有T7启动子序列且该条引物的5’末端有一个突出的T；

2）、配制反应液进行反应：

共100μl，混匀；

反应条件为：将上述混合液进行94℃保温10分钟，然后取出进行缓慢冷却至室温（即，0.8～1.2小时内冷却至室温）实现退火；从而形成一个部分双链结构的开叉形接头；

备注说明：在本发明中，室温是指15～25℃；

二、将上述部分双链结构的开叉形接头与目标基因的普通PCR扩增产物（A1）进行连接反应，从而得到两端带有接头的目标基因（A2）；

所述反应体系为：

反应条件为16℃，1小时，从而得到两端带有接头的目标基因（A2）；

三、针对部分双链结构的开叉形接头序列设计相应的引物-----2个通用引物，对所述两端带有接头的目标基因（A2）进行扩增，得到带有T7启动子的扩增产物（A3）；

PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共15个循环；然后72℃额外延伸10分钟，将所得的带有T7启动子的扩增产物（A3）4℃保存；

四、对上述带有T7启动子的扩增产物（A3）进行定量后，加入带有生物素标记的NTP(其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记)，进行体外转录反应，最终得到基因DNA序列捕获探针（带有生物素标记的RNA探针）。

作为本发明的基因DNA序列捕获探针的制备方法的改进：

所述步骤四中：

将扩增产物（A3）定量至浓度为22.6ng/μl；

体外转录体系为：

加去离子水至总体积40μl；

混匀后于37℃，反应15小时；所得产物纯化，得基因DNA序列捕获探针。

备注说明：酶、缓冲液及带有生物素标记的NTP可以从生命技术公司（lifetechnology公司）购得，产品货号为AM1791。

其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记。

作为本发明的基因DNA序列捕获探针的制备方法的进一步改进：

所述步骤一中：

备注说明步骤一：10×缓冲液的组成为：100mMTris-HCl（pH7.5），1MNaCl，10mMEDTA，其余为去离子水，利用浓度为0.1M的HCl溶液调整pH至7.5。

将制作好的接头---部分双链结构的开叉形接头置于-20℃保存备用。

作为本发明的基因DNA序列捕获探针的制备方法的进一步改进：

所述步骤三中：

通用引物1:ACTCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGCT

通用引物2:CGGCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGC。

总体而言，本发明的技术方案是：

1）、设计两条部分互补的引物，经退火处理后形成一个部分双链结构的开叉形接头，与目标基因的普通PCR扩增产物（A1）进行连接反应，得到两端带有接头的目标基因（A2）；

2）、针对接头序列设计相应的引物，对所述A2进行扩增，得到带有T7启动子的扩增产物（A3）；

3）、对上述产物（A3）进行定量后，在一定的条件下，加入带有生物素标记的NTP(其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记)，进行体外转录反应，最终得到带有生物素标记的RNA探针。

本发明的发明点如下：

1.接头序列中含有T7序列，可以通过体外转录，从双链DNA模板合成出大量RNA，可用于后期的免疫荧光杂交，或者多个靶基因片段捕获。

2.接头序列设计成两条部分互补的开叉结构，5’末端有一个突出的T，而普通DNA聚合酶扩增后在3’末端会形成一个突出的A，从而进行DNA连接反应。此连接反应无选择性，两端都会连接上同样的接头，但开叉结构，可以利用两条不同的通用引物进行扩增。

3.通用引物扩增后的产物—A3，可以做为体外转录的模板，T7转录酶可以特异性识别T7序列，并且在体外转录过程中，我们加入了生物素标记的NTP，因此，体外转录后的RNA就带有生物素，可以很方便的用亲和素的磁珠进行纯化。并且该体外转录过程为线性扩增，有了这个模板，可以源源不断的合成无限量的RNA探针，适合于公司产业化。

综上所述，利用本发明的方法制备目标基因的捕获探针，操作步骤简练，效率高，A3的起始量为1ng仍然可以进行成功的体外转录，扩增效率可以达到1000倍。因此可以快速高效地进行目标基因捕获探针的制备，以用于多个位点的基因突变的检测，能够更快更有效地锁定致病位点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的原理图。

图2是目标基因进行PCR扩增结果图；

图2中，泳道1为100bpDNALadderMarker（购自takara公司，货号D505A，条带自下而从，分别是100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，等），泳道2-5为目标基因的PCR产物；

泳道2为A1-1，泳道3为A1-2，泳道4为A1-3，泳道5为A1-4。

图3为对A2进行PCR扩增得到的产物A3的电泳图；

图3中，泳道1为100bpDNALadderMarker（购自takara公司，货号D505A，条带自下而从，分别是100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，等），泳道2为PCR产物A3。

图4为利用Agilent2100Nano6000对所得探针大小进行检测的图谱；

图中有一个大小为15bp的Marker。

具体实施方式

实施例1：为了测试本发明所述的探针制备方法的有效性，本发明选取了一个目标基因GSTP1(NCBI数据库中的genbank号为NM_000852.3），测试对该基因进行捕获探针制备的有效性和高效性，具体地，包括以下步骤：

1、对目标基因GSTP1的编码区DNA序列设计引物进行PCR扩增：

合成引物：

Seq1F:5’-CTACACCGTGGTCTATTTCC-3’

Seq1R:5’-CAGGGTGAGGTCTCCGTC-3’

Seq2F：5’-CAAGTTCCAGGACGGAGA-3’

Seq2R：5’-CGCCTCATAGTTGGTGTAGAT-3’

Seq3F：5’-CATCTCCCTCATCTACACCAA-3’

Seq3R：5’-CTCATGGATCAGCAGCAAGT-3’

Seq4F：5’-CTTCGCTGACTACAACCTG-3’

Seq4R：5’-ACTGTTTCCCGTTGCCATT-3’；

目的片段大小均为180bp，扩增产物命名为A1-1,A1-2,A1-3,A1-4，扩增结果见图2。

2、接头的制备，依次包括以下步骤：

1）、设计两条引物序列，分别命名为Oligo1和Oligo2，可委托生命技术公司(LifeTechnologies公司)进行合成；

序列具体如下：

其中方框部分为T7启动子序列，T7转录酶可以特异性识别这段序列，进行体外转录。下划线部分是两条序列互补区域，从而退火形成一个部分为双链的开叉结构的接头。5’末端有一个突出的T，可以与PCR产物3’末端的A进行DNA连接反应。

2）、用去离子水将两条引物稀释至0.1nmol/μl；

3）、配制反应液获得所需的接头，反应液的组成如下：

共100μl，混匀。

10×缓冲液的组成为：100mMTris-HCl（pH7.5），1MNaCl，10mMEDTA，其余为去离子水，利用浓度为0.1M的HCl溶液调整pH至7.5。

4）、反应条件：将上述混合液进行94℃10分钟，然后取出进行缓慢冷却至室温（约1小时），即实现退火。

5）、将制作好的接头---部分双链结构的开叉形接头置于-20℃保存备用。

3、连接反应

将步骤1中的4个扩增产物混合（等量混合），命名为A1，与步骤2中的接头（部分双链结构的开叉形接头）进行连接反应，反应液的组成如下：

T4DNA连接酶和10×连接酶缓冲液购自NEB公司，货号为M0202L。

反应条件为16℃，1小时，得到的产物为A2，然后对产物A2利用快而精公司的DNA纯化试剂盒（Qiagen公司，货号28106）进行纯化。

备注说明：可通过后续的PCR扩增是否成功来确认，加上接头后可以被扩增，没有接头的DNA不能被扩增。

4.PCR反应

PCR反应体系如下：

DNA聚合酶和5×缓冲液均可从takara公司购得，货号R001A

通用引物1:ACTCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGCT

通用引物2:CGGCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGC。

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共15个循环；然后72℃额外延伸10分钟，4℃保存。

得到的PCR产物A3进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图3。其中，泳道1为100bpDNALadderMarker（购自takara公司，货号D505A，条带自下而从，分别是100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，等），泳道2为PCR产物A3。

5.体外转录得到基因捕获探针

将步骤4得到的产物A3进行纯化，然后用NanoDrop1000进行定量，浓度为22.6ng/μl。

备注说明：上述“纯化”利用快而精公司的DNA纯化试剂盒（Qiagen公司，货号28106）进行纯化。

体外转录体系如下（A3模板的起始量为5ng）：

加去离子水至总体积40μl。

备注说明：酶、缓冲液及标记的NTP可以从生命技术公司（lifetechnology公司）购得，产品货号为AM1791。

其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记。

上述反应物混匀后于37℃，反应15小时。

15小时后将产物利用快而精公司的RNA纯化试剂盒（Qiagen公司，货号为74104）进行纯化，得到目标基因的捕获探针，测得以5ng起始时所得到的有生物素标记的RNA探针的总量为5μg，扩增效率为1000倍。

6.探针检测

利用Agilent2100Nano6000试剂盒（步骤中所有试剂均可从安捷伦公司购得，货号1511－6012）进行探针（即，有生物素标记的RNA探针）的检测，见图4，结果显示，扩增后的探针在210nt左右，比原PCR产物多了一端的接头，说明结果真实有效（成功地将目的基因扩增出来）。

利用该方法可以制备得到所需的探针，可按照常规技术用于靶基因的捕获、荧光原位杂交等后续实验或产业化。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，如其他外显子等靶基因片段的捕获探针制备，均应认为是本发明的保护范围。

<110>绍兴锐创生物科技有限公司

<120>基因DNA序列捕获探针的制备方法

<160>4

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1

<400>1

actcttaatacgactcactatagggatcgct31

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物2

<400>2

gcgatccctatagtgagtcgtattaagccg30

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用引物1

<400>3

actcttaatacgactcactatagggatcgct31

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通用引物2

<400>4

cggcttaatacgactcactatagggatcgc30

Claims (2)

1.基因DNA序列捕获探针的制备方法，其特征是包括以下步骤：

一、制备接头：

1)、设计两条部分互补的引物，所述两条引物之间的互补度为30～50％；其中一条引物中含有T7启动子序列---且该条引物的5’末端有一个突出的T；

两条部分互补的引物为：

引物1:ACTCT ATCGCT

引物2:GCGATCCCTATAGTGAGTCGTATTAAGCCG；

2)、配制反应液进行反应：

反应条件为：将上述混合液进行94℃保温10分钟，然后取出进行缓慢冷却至室温实现退火；从而形成一个部分双链结构的开叉形接头；

二、将上述部分双链结构的开叉形接头与目标基因的普通PCR扩增产物(A1)进行连接反应，从而得到两端带有接头的目标基因(A2)；

所述反应体系为：

反应条件为16℃，1小时，从而得到两端带有接头的目标基因(A2)；

三、针对部分双链结构的开叉形接头序列设计相应的引物-----2个通用引物，对所述两端带有接头的目标基因(A2)进行扩增，得到带有T7启动子的扩增产物(A3)；

2个通用引物为：

通用引物1:ACTCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGCT

通用引物2:CGGCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGC；

PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共15个循环；然后72℃额外延伸10分钟，将所得的带有T7启动子的扩增产物(A3)4℃保存；

四、对上述带有T7启动子的扩增产物(A3)进行定量后，加入带有生物素标记的NTP，进行体外转录反应，最终得到基因DNA序列捕获探针；

所述NTP中，UTP上标记生物素，ATP、CTP、GTP不标记。

2.根据权利要求1所述的基因DNA序列捕获探针的制备方法，其特征是：

所述步骤四中：

将扩增产物(A3)定量至浓度为22.6ng/μl；

体外转录体系为：

混匀后于37℃，反应15小时；所得产物纯化，得基因DNA序列捕获探针。