CN107557355A - 建构环状模板和检测dna分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种建构环状模板的方法，其包含制备部分双链线性DNA分子，且将部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。检测DNA分子的方法包含以下步骤。用探针分离靶DNA分子以形成部分双链线性DNA分子。将部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。通过使用探针作为引物来进行部分双链环状DNA分子的环状测序。

Description

建构环状模板和检测DNA分子的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年7月1日提交的美国临时申请第62/357,382号的优先权权益。上述专利申请的全部内容特此通过引用结合在此，且成为说明书的一部分。
技术领域
本发明涉及建构DNA的方法和检测DNA的方法，尤其是建构环状模板的方法和检测DNA分子的方法，其中DNA分子优选为片段化DNA分子，如游离DNA分子。
背景技术
随着精准医学的发展和个体化医学的重要性，基因测序技术将被广泛地使用。通过比较和分析个体和数据库的基因信息以检测个体的基因序列是否具有有害的基因突变，如罕见的肿瘤衍生突变。因此，可预防或在早期治疗疾病。
然而，当前基因库的建构和测序方法为劳动密集型和高成本的且可能产生偏差，如扩增偏差。因此，研发新的基因测序方法以实现较高准确度、快速反应或较低成本的目的为当前急待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种建构环状模板的方法以产生用于环状扩增或环状测序的部分双链环状DNA分子。
本发明提供一种检测DNA分子的方法，其中DNA分子优选为片段化DNA分子，如游离DNA分子。本发明所提供的方法具有较高准确度、快速反应、较低成本和较小偏差的优点。本发明所提供的方法可检测一个样品中的单链和双链DNA两者。
本发明提供一种建构环状模板的方法且方法包含以下步骤。制备部分双链线性DNA分子，且部分双链线性DNA分子在相同链上的两端处包含单链突出部分。部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。
在本发明的一个实施例中，制备部分双链线性DNA分子的方法包含提供单链线性DNA分子且使探针与单链线性DNA分子杂交。
在本发明的一个实施例中，单链线性DNA分子包含40个核苷酸到500个核苷酸长。
在本发明的一个实施例中，探针包含20个核苷酸到120个核苷酸长。
在本发明的一个实施例中，探针包含生物素化探针。
在本发明的一个实施例中，在使探针与单链线性DNA分子杂交之后，通过抗生蛋白链菌素珠粒提取部分双链线性DNA分子。
在本发明的一个实施例中，制备部分双链线性DNA分子的方法包含以下步骤。提供双链线性DNA分子。提供第一衔接子和第二衔接子，其中第一衔接子和第二衔接子具有双链部分和在一端处的单链突出部分。第一衔接子连接到双链线性DNA分子的一端且第二衔接子连接到另一端以形成部分双链线性DNA分子。第一衔接子的单链突出部分和第二衔接子的单链突出部分在部分双链线性DNA分子的相同链上。
在本发明的一个实施例中，第一衔接子和第二衔接子在一端处包含至少20个核苷酸的单链突出部分。
在本发明的一个实施例中，使第一衔接子或第二衔接子与生物素化标记结合，且随后通过抗生蛋白链菌素珠粒提取部分双链线性DNA分子。
在本发明的一个实施例中，进一步包含去除不与探针杂交的单链DNA分子的步骤。
在本发明的一个实施例中，部分双链线性DNA分子在两端处包含至少10个核苷酸的单链突出部分。
在本发明的一个实施例中，连接酶为单链DNA连接酶。
本发明另提供一种检测DNA分子的方法且方法包含以下步骤。用探针分离靶DNA分子以形成部分双链线性DNA分子。部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。通过使用探针作为引物来进行部分双链环状DNA分子的环状测序。
在本发明的一个实施例中，探针为生物素化探针，且用探针分离靶DNA分子的方法包含以下步骤。提供多种寡核苷酸。使寡核苷酸连接到靶DNA分子，其中靶DNA分子为单链线性DNA分子。使靶DNA分子扩增。使生物素化探针与靶DNA分子杂交。
在本发明的一个实施例中，靶DNA分子从包含液体活检体或大便的临床样本提取。
在本发明的一个实施例中，液体活检体包含血浆、唾液或尿液。
基于上述，本发明提供一种建构环状模板的方法以用于测序，其包含提供部分双链线性DNA分子且通过使用单链DNA连接酶以产生部分双链环状DNA分子。本发明还提供一种检测DNA分子的方法，其包含使探针与各DNA分子的感兴趣区域杂交，通过使用连接酶，尤其是单链DNA连接酶，以产生部分双链环状DNA分子，且进行环状测序。本发明中所提供的建构环状模板的方法和检测DNA分子的方法具有较高准确度、快速反应或较低成本的优点。
为了使得本发明的前述特征和优点为更可理解的，下文详细描述实施例。
附图说明
包含附图以提供对本发明的进一步理解，且附图并入在本说明书中且构成本说明书的一部分。附图说明本发明的实施例，且与描述内容一起用来解释本发明的原理。
图1A-1D说明根据本发明的实施例的一种建构环状模板的方法。
图2A-2E说明根据本发明的另一实施例的一种建构环状模板的方法。
图3A-3C说明根据本发明的另一实施例的一种建构环状模板的方法。
图4A-4E说明根据本发明的另一实施例的一种建构环状模板的方法。
图5A-5E说明根据本发明的实施例的一种检测DNA分子的方法。
附图标号说明
110：单链线性DNA分子；
110a：单链环状DNA分子；
114：单链环状DNA分子；
120：探针；
122：生物素化探针；
130：抗生蛋白链菌素珠粒；
132：珠粒；
134：抗生蛋白链菌素；
140：游离DNA分子；
140'：扩增子；
141：靶DNA分子；
142：游离DNA分子；
142'：扩增子；
150：寡核苷酸；
200a：部分双链线性DNA分子；
200b：部分双链线性DNA分子；
200c：部分双链线性DNA分子；
200d：部分双链线性DNA分子；
200e：部分双链线性DNA分子；
200f：部分双链线性DNA分子；
200g：部分双链线性DNA分子；
202：单链突出部分；
210a：部分双链环状DNA分子；
210b：部分双链环状DNA分子；
210c：部分双链环状DNA分子；
210d：部分双链环状DNA分子；
210f：部分双链环状DNA分子；
300：双链线性DNA；
400：衔接子；
420：衔接子；
440：衔接子。
具体实施方式
本发明提供一种用于建构环状模板的方法和一种用于检测DNA分子的方法。为了有助于理解本发明的实施方式，提供以下定义。
“环状测序”是使用环状模板的测序反应。环状测序例如包括由BGI采用的DNA纳米球测序，或由Pacific Biosciences采用的SMRT测序。
“连接”为在如寡核苷酸或聚核苷酸的两个核酸的末端之间形成磷酸二酯键或键联的作用。可通过酶，如DNA连接酶进行连接。
“杂交(Hybridization/hybridizing)”为使如DNA或RNA的寡核苷酸或聚核苷酸黏着到与其互补的寡核苷酸或聚核苷酸的反应。
“引物”为具有约10-100个核苷酸长度的短聚核苷酸。引物通过与靶标杂交结合到靶聚核苷酸或“模板”。引物优选地提供用于与靶标互补的聚核苷酸的DNA合成的起始点，其可在DNA聚合酶存在下进行。典型地添加DNA聚合酶且在引物的3′端延伸新的核苷酸。引物的3′端还作为DNA连接酶的受质。
“DNA测序”为测定DNA的核苷酸的反应。举例来说，反应典型地包含黏着、延伸和检测的一组循环；序列特异性引物用于黏着；经DNA聚合酶和荧光信号标记的核苷酸用于延伸；且作为指示物的荧光信号用作检测。
“生物素-抗生蛋白链菌素相互作用”用于多种核酸和蛋白质纯化方法中。生物素较小且对经生物素标记的分子的干扰极少。抗生蛋白链菌素展现较高特异性和亲和性以结合生物素，使得抗生蛋白链菌素结合的珠粒典型地用于从混合物中分离和纯化经生物素标记的分子。
图1A-1D说明根据本发明的实施例的一种建构环状模板的方法。
参看图1A，提供单链线性DNA分子110和探针120。单链线性DNA分子110例如包含40个核苷酸到500个核苷酸长。在一些实施例中，单链线性DNA分子110例如包含40个核苷酸到200个核苷酸长。探针120例如包含20个核苷酸到120个核苷酸长。在一些实施例中，探针120包含20、40、60、80、100或120个核苷酸。在一些实施例中，单链线性DNA分子为100个核苷酸长，且探针为20、40、60、80、100或120个核苷酸长。
参看图1B，使探针120与单链线性DNA分子110杂交以形成部分双链线性DNA分子200a。在一些实施例中，部分双链线性DNA分子200a在相同链上的两端处包含单链突出部分202。换句话说，双链线性DNA在一个链的两端处具有突起的单链突出部分202。在一些实施例中，每一个单链突出部分202包含至少5个核苷酸，或是包含至少10个核苷酸，例如优选至少15个或20个核苷酸。部分双链线性DNA分子200a的长度等于或小于500个核苷酸。在一些实施例中，部分双链线性DNA分子200a的长度等于或小于200个核苷酸。在一些实施例中，在杂交反应之后，存在不与探针120杂交的一些残余的单链线性DNA分子110。换句话说，部分双链线性DNA分子200a和残余的单链线性DNA分子110可在杂交反应之后共同存在。在替代实施例中，如果需要，可在杂交之后去除残余的单链线性DNA分子110。
参看图1C，将部分双链线性DNA分子200a与连接酶反应。在一些实施例中，残余的单链线性DNA分子110还会与连接酶反应。连接酶能够进行分子内连接以连接单链DNA分子，即，单链DNA分子为连接酶的受质。在一些实施例中，连接酶为单链DNA连接酶，如环化连接酶(CircLigase)(例如环化连接酶I和II)。连接酶用于连接部分双链线性DNA分子200a的单链突出部分以产生部分双链环状DNA分子210a。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210a包含由单链线性DNA分子110形成的单链环状DNA分子110a和作为探针120的单链线性DNA分子。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210a等于或小于500个核苷酸。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210a等于或小于200个核苷酸。应注意，连接酶还会连接残余的单链线性DNA分子110以产生单链环状DNA分子114。然而，如图1C中所示，可能仍存在未连接和残余的一些单链线性DNA分子110，但本发明不限于此。
参看图1D，对部分双链环状DNA分子210a进行测序。在一些实施例中，探针120直接用作测序引物。在一些实施例中，如果需要，使用核酸外切酶去除未连接的单链线性DNA分子110。
在一些实施例中，通过形成包含单链线性DNA分子110和探针120的部分双链环状DNA分子210a且对部分双链环状DNA分子210a进行测序以测定单链线性DNA分子110的序列。因为探针120可直接充当引物，不需要额外引发步骤。因此，本发明提供具有较低反应时间和成本的一种建构和测序环状模板的方法。
图2A-2E说明根据本发明的另一实施例的一种建构环状模板的方法。图2A-2E的方法类似于图1A-1D的方法，且因此通过相同参考标号标记相同组分。图2A-2E的方法与图1A-1D的方法之间的主要差异为图2A-2E的方法使用生物素化探针和抗生蛋白链菌素珠粒，且使用核酸外切酶的步骤是可选的。
参看图2A，提供单链线性DNA分子110和生物素化探针122。生物素化探针122为用生物素标记的探针。
参看图2B，使生物素化探针122与单链线性DNA分子110杂交以形成部分双链线性DNA分子200b。部分双链线性DNA分子200b在两端处包含单链突出部分202。在一些实施例中，在杂交反应之后，存在不与生物素化探针122杂交的一些残余的单链线性DNA分子110。换句话说，部分双链线性DNA分子200b和残余的单链线性DNA分子110可在杂交反应之后共同存在。在替代实施例中，如果需要，可在杂交之后去除残余的单链线性DNA分子110。
参看图2C，抗生蛋白链菌素珠粒130用于提取包含生物素化探针122的部分双链线性DNA分子200b。在一些实施例中，抗生蛋白链菌素珠粒130为与抗生蛋白链菌素134结合的珠粒132，且抗生蛋白链菌素珠粒130例如为抗生蛋白链菌素磁珠。在提取期间，部分双链线性DNA分子200b通过生物素化探针122与抗生蛋白链菌素珠粒130相互作用，且去除不与抗生蛋白链菌素珠粒130相互作用的残余的单链线性DNA分子110。残余的单链线性DNA分子110的去除方法包含缓冲液洗涤。
参看图2D，在提取之后，部分双链线性DNA分子200b从抗生蛋白链菌素珠粒130分离。在一些实施例中，分离方法例如为加热过程。
参看图2E，连接酶用于连接部分双链线性DNA分子200b的单链突出部分202以产生部分双链环状DNA分子210b。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210b包含由单链线性DNA分子110形成的单链环状DNA分子110a和作为生物素化探针122的单链线性DNA分子。因为残余的单链线性DNA分子110在前一步骤中已去除，所以使用核酸外切酶去除单链DNA分子110是可选的步骤。
随后，对部分双链环状DNA分子210b进行测序。在一些实施例中，生物素化探针122直接用作测序引物。
在一些实施例中，通过形成包含单链线性DNA分子110和生物素化探针122的部分双链环状DNA分子210b且对部分双链环状DNA分子210b进行测序以测定单链线性DNA分子110的序列。因为生物素化探针122可直接充当引物，不需要额外引发步骤。因此，建构环状模板的方法具有较低反应时间和成本。应注意，在一些实施例中，虽然生物素用作标记靶分子，但本发明不限于此。
图3A-3C说明根据本发明的另一实施例的一种建构环状模板的方法。
参看图3A，提供双链线性DNA 300和衔接子(400、420)。在一些实施例中，分别将A尾添加到双链线性DNA的两端以产生具有A尾的双链线性DNA 300。即，通过分别将至少一种腺嘌呤核苷酸添加到双链线性DNA的两个3'端以形成A尾。衔接子(400、420)具有双链部分和在一端处的单链突出部分。在一些实施例中，每一个衔接子(400、420)例如为在一端处具有T尾的双链DNA和在另一端处的单链突出部分。在一些实施例中，可通过将至少一种胸腺嘧啶核苷酸添加到衔接子(400、420)的两个3'端中的一个以形成T尾。衔接子(400、420)的单链突出部分可包含至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸。
在一些实施例中，衔接子400例如为在双链DNA的相同链中具有5'单链突出部分和3'T尾。衔接子420例如为在双链DNA的一个链中具有3'单链突出部分和在双链DNA的另一链中具有3'T尾。然而，本发明不限于此。
参看图3B，将衔接子(400、420)连接到双链线性DNA 300的两端以形成部分双链线性DNA分子(200c、200d、200e)。在一些实施例中，一个衔接子(400、420)连接到双链线性DNA300的一端，且另一衔接子(400、420)连接到双链线性DNA 300的另一端。在一些实施例中，部分双链线性DNA分子(200c、200d、200e)在两端处包含单链突出部分202。在一些实施例中，每一个单链突出部分202包含至少5个核苷酸，或是包含至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸。在一些实施例中，部分双链线性DNA分子(200c、200d、200e)的长度等于或小于500个核苷酸。在一些实施例中，部分双链线性DNA分子(200c、200d、200e)的长度等于或小于200个核苷酸。
在一些实施例中，形成不同部分双链线性DNA分子(200c、200d、200e)。详细地说，通过将衔接子400连接到双链线性DNA 300的一端且将衔接子420连接到双链线性DNA 300的另一端以形成部分双链线性DNA分子200c。通过将第一衔接子400连接到双链线性DNA300的两端以形成部分双链线性DNA分子200d。通过将第二衔接子420连接到双链线性DNA300的两端以形成部分双链线性DNA分子200e。
在部分双链线性DNA分子(200c、200d、200e)中，部分双链线性DNA分子200c在相同链上的两端处包含单链突出部分202，即，部分双链线性DNA分子200c在两端处具有长于另一链的一个链。因此，部分双链线性DNA分子200c可为单链DNA连接酶的受质，所述连接酶如环化连接酶，其能够进行分子内连接以连接单链DNA。
参看图3C，连接酶用于连接部分双链线性DNA分子200c的单链突出部分202以产生部分双链环状DNA分子210c。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210c包含单链环状DNA和单链线性DNA，其由双链线性DNA300和衔接子(400、420)形成。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210c的长度等于或小于500个核苷酸。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210c的长度等于或小于200个核苷酸。
随后，对部分双链环状DNA分子210c进行测序。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210c的较短链直接用作测序引物。
在一些实施例中，通过形成包含双链线性DNA 300和衔接子(400、420)的部分双链环状DNA分子210c且对部分双链环状DNA分子210c进行测序以测定双链线性DNA 300的序列。因为部分双链环状DNA分子210c的较短链DNA可直接充当引物，所以不需要额外引发步骤。因此，降低反应时间和成本。
图4A-4E说明根据本发明的另一实施例的一种建构环状模板的方法。图4A-4E的方法类似于图3A-3C的方法，且因此通过相同参考标号标记相同组分。图4A-4E的方法与图3A-3C的方法之间的主要差异为图4A-4E的方法使用生物素化衔接子和抗生蛋白链菌素珠粒。
参看图4A，提供双链线性DNA 300和衔接子440。在一些实施例中，衔接子440为具有单链突出部分的部分双链DNA。详细地说，衔接子440例如为具有在3'端处的T尾和在单链突出部分的5'端处的生物素化标记，且生物素化标记连接到抗生蛋白链菌素珠粒130。
参看图4B，衔接子440连接到双链线性DNA 300的一端。在一些实施例中，衔接子440的T尾与双链线性DNA 300的A尾配对以使得衔接子440和双链线性DNA 300连接。
随后，提供另一衔接子420。在一些实施例中，衔接子420与图3A中相同，且因此省略其描述。
参看图4C，衔接子420连接到已连接衔接子440的双链线性DNA 300的另一端，以形成部分双链线性DNA分子200f。在一些实施例中，衔接子420的T尾与双链线性DNA 300中曝露的A尾配对，以使得衔接子420和双链线性DNA 300连接。换句话说，双链线性DNA 300的一端用衔接子420连接，且双链线性DNA 300的另一端用连接到抗生蛋白链菌素珠粒130的衔接子440连接。因此，产生与抗生蛋白链菌素珠粒130结合的部分双链线性DNA分子200f，且通过使用缓冲液去除未连接的衔接子420和未连接的衔接子440以提取部分双链线性DNA分子200f。
在一些实施例中(未示出)，不具有生物素化标记的衔接子400用于替换具有生物素化标记的衔接子440以连接双链线性DNA 300的一端。生物素化标记连接到例如抗生蛋白链菌素珠粒130。在单链突出部分的3'端处具有生物素化标记的衔接子420用于替换不具有生物素化标记的衔接子420以连接双链线性DNA 300的另一端。
参看图4D，部分双链线性DNA分子200f从抗生蛋白链菌素珠粒130分离。在一些实施例中，从抗生蛋白链菌素珠粒130分离部分双链线性DNA分子200f的方法包含加热过程。部分双链线性DNA分子200f在两端处包含单链突出部分202。
参看图4E，连接酶用于连接部分双链线性DNA分子200f的单链突出部分202以产生部分双链环状DNA分子210d。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210d包含单链环状DNA分子和单链线性DNA分子，其由双链线性DNA分子300和衔接子(420、440)形成。
随后，对部分双链环状DNA分子210d进行测序。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210d的线性链直接用作测序引物，因此可省略额外引发步骤。
图5A-5E说明根据本发明的实施例的检测DNA分子的方法。
参看图5A，提供DNA分子，优选片段化DNA，如游离DNA分子(140、142)和寡核苷酸150。在一些实施例中，游离DNA分子(140、142)为衍生自临床样本提取的双链DNA分子的单链线性DNA分子。临床样本可为液体活检体或大便，且液体活检体例如包含血浆、唾液或尿液。
在一些实施例中，游离DNA分子(140、142)为通过基于管柱或基于珠粒的核酸提取方法所提取的核酸样品，如齐安普(QIAamp)循环NA、AccuBioMed、NextPrep-Mag cfDNA分离套组(Bioo scientific(必欧科学公司))或Zinext。在一些实施例中，寡核苷酸150为腺苷酸化的。
参看图5B，寡核苷酸150连接到游离DNA分子(140、142)，且随后使连接的产物扩增以形成扩增子(140'、142')。在一些实施例中，寡核苷酸150连接到游离DNA分子(140、142)的3'端。在一些实施例中，例如使用与寡核苷酸150配对的引物且通过单向线性扩增方法以形成扩增子(140'、142')。扩增子(140'、142')例如包含n个拷贝的游离DNA分子(140、142)。
参看图5C，通过序列特异性探针122捕获扩增子140'的靶DNA分子141，以形成部分双链线性DNA分子200g。部分双链线性DNA分子200g在两端处包含单链突出部分202。在一些实施例中，靶DNA分子141包含感兴趣区域。在一些实施例中，序列特异性探针122例如为生物素化探针。详细地说，序列特异性探针122与扩增子140'的靶DNA分子141杂交以形成部分双链线性DNA分子200g。优选地，扩增子140'为具有40到500个核苷酸长度的单链DNA分子，且序列特异性探针122为具有20到120个核苷酸长度的单链DNA分子。在一些实施例中，扩增子140'为约100个核苷酸长的单链DNA，且序列特异性探针122为具有20、40或60个核苷酸长的单链DNA分子。
参看图5D，抗生蛋白链菌素珠粒(未示出)用于提取与生物素化探针122杂交的部分双链线性DNA分子200g。不与序列特异性探针122杂交的扩增子142'通过缓冲液洗涤去除。在提取之后，通过如加热过程的分离方法，从抗生蛋白链菌素珠粒130分离部分双链线性DNA分子200g。
参看图5E，连接酶用于连接部分双链线性DNA分子200g的单链突出部分202以产生部分双链环状DNA分子210f。在一些实施例中，可进一步扩增和/或分析部分双链环状DNA分子210f。在一些实施例中，部分双链环状DNA分子210f涉及环状测序分析。
随后，对部分双链环状DNA分子210f进行测序。在一些实施例中，序列特异性探针122可充当测序引物，且因此不需要额外引物。
总而言之，本发明提供一种建构用于测序的环状模板的方法和一种通过形成部分双链环状DNA分子检测DNA分子的方法。部分双链环状DNA分子可涉及环状扩增或环状测序。在一些实施例中，较短链DNA可直接充当引物，且因此方法具有较高准确度、快速反应和较低成本的优点。
所属领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范畴或精神的情况下，可以对本发明的结构进行各种修改和变化。鉴于前文，希望本发明涵盖对本发明的修改和变化，条件是所述修改和变化落在所附权利要求及其等效物的范畴内。

Claims (16)

1.一种建构环状模板的方法，包括：
制备部分双链线性DNA分子，其中所述部分双链线性DNA分子在相同链上的两端处包括单链突出部分；以及
将所述部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。
2.根据权利要求1所述的建构环状模板的方法，其中制备所述部分双链线性DNA分子的步骤包括：
提供单链线性DNA分子；以及
使探针与所述单链线性DNA分子杂交。
3.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，其中所述单链线性DNA分子包括40个核苷酸到500个核苷酸长。
4.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，其中所述探针包括20个核苷酸到120个核苷酸长。
5.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，其中所述探针包括生物素化探针。
6.根据权利要求5所述的建构环状模板的方法，在使所述探针与所述单链线性DNA分子杂交之后，进一步包括通过抗生蛋白链菌素珠粒提取所述部分双链线性DNA分子。
7.根据权利要求1所述的建构环状模板的方法，其中所述制备所述部分双链线性DNA分子的步骤包括：
提供双链线性DNA分子；
提供第一衔接子以及第二衔接子，其中所述第一衔接子以及所述第二衔接子具有双链部分以及在一端处的单链突出部分；以及
将所述第一衔接子连接到所述双链线性DNA分子的一端以及将所述第二衔接子连接到另一端以形成所述部分双链线性DNA分子，其中所述第一衔接子的所述单链突出部分以及所述第二衔接子的所述单链突出部分在所述部分双链线性DNA分子的相同链上。
8.根据权利要求7所述的建构环状模板的方法，其中所述第一衔接子以及所述第二衔接子在一端处包括至少20个核苷酸的单链突出部分。
9.根据权利要求7所述的建构环状模板的方法，其中所述第一衔接子或所述第二衔接子与生物素化标记结合，以及随后通过抗生蛋白链菌素珠粒提取所述部分双链线性DNA分子。
10.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，进一步包括去除不与所述探针杂交的所述单链DNA分子的步骤。
11.根据权利要求1所述的建构环状模板的方法，其中所述部分双链线性DNA分子在所述两端处包括至少10个核苷酸的单链突出部分。
12.根据权利要求1所述的建构环状模板的方法，其中所述连接酶为单链DNA连接酶。
13.一种检测DNA分子的方法，包括：
用探针分离靶DNA分子以形成部分双链线性DNA分子；
将所述部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子；以及
通过使用所述探针作为引物来进行所述部分双链环状DNA分子的环状测序。
14.根据权利要求13所述的检测DNA分子的方法，其中所述探针为生物素化探针，以及用所述探针分离所述靶DNA分子的方法包括：
提供多种寡核苷酸；
将所述寡核苷酸连接到所述靶DNA分子，其中所述靶DNA分子为单链线性DNA分子；
使所述靶DNA分子扩增；以及
使所述生物素化探针与所述靶DNA分子杂交。
15.根据权利要求13所述的检测DNA分子的方法，其中所述靶DNA分子从包括液体活检体或大便的临床样本提取。
16.根据权利要求15所述的检测DNA分子的方法，其中所述液体活检体包括血浆、唾液或尿液。
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