CN107810275A - 用于鉴定病毒性出血败血症病毒的区域特异性基因型的探针及其用途 - Google Patents
用于鉴定病毒性出血败血症病毒的区域特异性基因型的探针及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于检测其中VHSV已分离的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNP)，涉及用于鉴定该SNP的PNA，以及通过使用该PNA来鉴定用于检测其中VHSV已分离的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的方法，并且更具体地，涉及PNA以及通过使用包含序列号1的核苷酸序列的PNA能够检测VHSV G蛋白的C755A和A756G的单核苷酸多态性突变。本发明通过使用对DNA具有高结合亲和力的PNA以使各基因型显示不同熔解温度，从而能够以简单、快速和准确的方式鉴定其中VHSV已分离的区域特异性基因型。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴定作为鱼病原病毒的病毒性出血败血症病毒(VHSV)的地理起源的探针以及使用该探针来鉴定VHSV的地理起源的方法，更具体地，涉及以简单、快速和准确的方式鉴定VHSV的地理起源的方法，其中，对含有VHSV G蛋白的C755A和A756G单核苷酸多态性(SNP)的DNA(根据VHSV的地理起源而出现的基因型)具有高结合亲和力的PNA用于根据基因型显示不同的熔解温度。
背景技术
病毒性出血败血症病毒(VHSV)已知为感染淡水鲑鱼类(包括虹鳟(Oncorhynchusmykiss))的病原体，从而引起严重的病毒性疾病。与其它鱼类病毒(传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)和牙鲆弹状病病毒(HIRRV))一起，VHSV是属于弹状病毒科家族弹状病毒属的约11000bp的负链RNA病毒，其包含6个基因，即按照3’-N-P-M-G-NV-L-5’顺序的核衣壳蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)，非病毒颗粒蛋白(NV)和聚合酶(L)(Schutze等，1999；van Regenmortel等，2000；Trdo等，2005)。
由于VHSV在1963年首次从丹麦的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中分离出来(Jensen，1965；Wolf，1988)，它已经从大西洋和北海的大西洋鳕鱼(Gadus morhua)(Jensen等，1979)，大菱鲆(Scophthalmus maximus)(Schlotfeldt等，1991)，大西洋鲱鱼(Clupeaharengus)(Dixon等，1997)，牙鳕(Merlangius merlangus)(Mortensen等，1999)等中分离出来。VHSV已知为在淡水和海水鱼类中引起疾病的病原体。VHSV不仅在欧洲地区，而且在20世纪80年代后期从北美洲西部海岸的海水鱼类和溯河产卵的鲑鱼中分离出来，表明病毒在海洋环境中广泛分布(Hopper，1989；Meyers和Winton，1995)。
在东亚地区，VHSV首先在日本若狭湾的野生牙鲆(Paralichthys olivaceus)中检测到(Takano等，2000)，之后还报道了VHSV对培养的牙鲆(Paralichthys olivaceus)的损害(Isshiki等，2001)。在韩国，培养的牙鲆(Paralichthys olivaceus)中的弹状病毒疾病在相似的时间流行。检测了引起弹状病毒疾病的病毒，结果发现该病毒具有与从北美地区和日本分离的VHSV相同的基因型(Kim等，2003)。从那时起，VHSV已经从各种海水鱼类和淡水鱼类中分离出来，据报道VHSV是一种每年导致培养的牙鲆(Paralichthys olivaceus)死亡的病原体(Kim等，2004；Kim等，2009；Cho等，2012)。
目前，VHSV被世界动物卫生组织(OIE)的“水生动物卫生法典”列为法定传染病(OIE，2013)。在韩国，VHSV是水生生物疾病防治法第2条所述的传染性水生生物疾病，包括在经历预防措施的疾病中，当检测到VHSV传染和疾病爆发时，限制运动和消毒措施是必要的。近年来，由于各种水生生物疾病的爆发和消费者对食品安全的需求增加，全球范围内水生动物疾病控制、监督和监测的重要性日益增加。此外，不仅国家监督和控制措施，以及区域和区划水生生物疾病的监督和监测结果的分析，都在提供水生生物疾病和疾病控制的流行病学调查所需的有用数据中发挥非常重要的作用，而且在相应国家展示没有特定疾病的区域(FAO，2004年)中也发挥非常重要的作用。因此，与从其它国家分离的VHSV分离株的序列比较继续研究韩国VHSV分离株的序列突变以及继续监测VHSV变得更加重要。
将全世界范围内鉴定的VHSV分离株的N和G基因的核苷酸序列在系统发生学上进行了比较。结果发现这些基因含有四种基因型(I-IV)以及基因型I(Ia-Ie)和基因型IV(IVa和IVb)的几个亚型(Snow等，1999；Einer-Jensen等，2004；Lumsden等，2007)。基因型I包括从欧洲各种淡水和海水鱼类分离的VHSV分离株，还包括从波罗的海，斯卡格拉克海峡(Skagerrak)，卡特加特海峡(Kattegat)和英吉利海峡的海水鱼类中分离的许多VHSV分离株(Dixon等，1997；Thiery等，2002；Einer-Jensen等，2004；Snow等，2004)。基因型II包括从波罗的海海水鱼类中分离的VHSV分离株(Snow等，2004)，基因型III包括从英格兰和爱尔兰的北海和北大西洋分离的VHSV分离株和从挪威西部的虹鳟鱼分离的VHSV分离株(Einer-Jensen等，2004；Snow等，2004；Lopez-Vazquez等，2006；Dale等，2009)。基因型IV包括不仅从北美太平洋沿岸和大西洋沿岸以及从北美的大湖地区和亚洲地区分离的VHSV分离株，((Nishizawa等，2002；Kim等，2003；Elsayed等，2006；Gagne等，2007；Lumsden等，2007)。因此，VHSV的遗传距离分析结果和VHSV的系统发生分析结果似乎与地理位置的相关性高于寄主鱼类。
已经开发了各种分析细菌基因型的方法，并且使用了Sanger测序、随机扩增多态性DNA(RAPD)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术等。然而，这些方法仍存在分析时间长、分析过程复杂的问题。此外，需要开发表明致病性的基因型和遗传标记。此外，为了根据基因型分析致病性以确定它们之间的相关性，需要开发用于快速方便分析的基因型和遗传标记以及能够容易地识别遗传标记的方法。
在先前的研究中，本发明人进行了从亚洲分离的VHSV分离株的系统发生比较(J.Fish Pathol.,26(3):149-161)。研究结果显示，韩国VHSV分离株在VHSV G蛋白基因的核苷酸序列中的残基755处具有C到A的突变。然而，在上述研究中，扩增了VHSV分离株G蛋白的所有全长开放阅读框，然后克隆扩增产物，并对纯化的质粒DNA进行测序。因此，存在需要大量时间和材料的缺点。
通常，肽核酸(PNA)是具有通过肽键而不是磷酸键连接的核酸核苷酸的DNA类似物，并且首次由Nielsen等(1991)合成。PNA在自然界中找不到，其是通过化学方法人工合成的。PNA通过与具有与其互补的核苷酸序列的天然核酸杂交而形成双链体。当它们的长度相等时，PNA/DNA双链体比DNA/DNA双链体更稳定，并且PNA/RNA双链体比DNA/RNA双链体更稳定。此外，由于PNA具有单一碱基错配使得双链体不稳定，所以PNA检测SNP(单核苷酸多态性)的能力优于天然核酸。PNA是化学稳定的，并且因为它不被核酸酶或蛋白酶降解，所以也是生物稳定的。此外，PNA是识别基因的物质(如LNA(锁核酸)或MNA(吗啉核酸))之一，并具有由聚酰胺组成的骨架。PNA具有非常高的亲和力和选择性，且热稳定性和化学稳定性较高，从而易于储存且不易降解。
因此，本发明人已经通过分析在韩国从培养的牙鲆(Paralichthys olivaceus)分离的VHSV分离株的糖蛋白(G)的核苷酸序列，并通过将韩国VHSV分离株与先前报道的日本和中国的VHSV分离株系统发生学比较而进行了广泛的努力来鉴定韩国特异性核苷酸序列，从而为分区水生生物疾病的监督、遗传多样性分析、分子动态表征、监测和控制提供有用的数据。结果是，本发明人发现，当使用用于确定VHSV的区域特异性基因型的遗传标记和与遗传标记DNA具有高结合亲和力的肽核酸(PNA)以便显示取决于区域特异性基因型的不同熔解温度时，可以以简单、快速和准确的方式确定VHSV的区域特异性基因型，由此完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种能够确定VHSV靶基因的区域特异性基因型的探针和包含连接到探针两端的报告基因或猝灭剂的PNA探针。
本发明的另一个目的是提供一种用于分析VHSV核苷酸多态性的试剂盒，其中，该试剂盒包含上述探针或PNA。
本发明的另一目的是提供一种用于确定VHSV的区域特异性基因型的方法，该方法包含使用上述探针或PNA的步骤。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于确定病毒性出血败血症病毒(VHSV)的区域特异性基因型的探针，其中，所述探针能够在严格条件下与VHSV G蛋白序列中含有C755A和A756G单核苷酸多态性突变的序列片段杂交。
本发明还提供了用于确定VHSV的区域特异性基因型的PNA探针，该PNA探针包含连接到上述探针两端的报告基因或猝灭剂。
本发明还提供了用于检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的试剂盒，其中，该试剂盒包含上述探针或PNA。
本发明还提供了通过使用PNA来检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的方法，该方法包含以下步骤：(a)从VHSV中分离靶DNA；(b)使靶DNA与上述探针杂交；(c)获得温度依赖性熔解曲线，同时增加步骤(b)产生的杂交产物的温度；以及(d)分析所获得的熔解曲线。
附图说明
图1是说明根据本发明一种优选实施方式的使用PNA来检测能确定VHSV分离的区域的单核苷酸多态性(SNPs)的熔解曲线分析的技术特征的概念图。
图2是说明根据本发明一种优选实施方式的使用PNA确定针对VHSV分离的每个区域进行鉴定的基因型的方法中的杂交步骤和获得熔解曲线的步骤的示意图。
图3是说明根据本发明的PNA结合位点和进行G蛋白测序的结果以确定针对VHSV分离的每个区域进行鉴定的基因型的序列图。
图4是说明根据本发明的确定针对VHSV分离的每个区域进行鉴定的基因型的G蛋白基因的PNA中包含的核苷酸突变区的实施例的基因位置图。
图5是表示根据本发明的根据基因型和根据每个VHSV分离区域确定基因型的PNA的G蛋白结合位置来检测针对每个探针的不同杂交程度的方法的实施例的示意图。
图6示出了根据本发明的用于检测能确定针对VHSV分离的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的实时PCR反应条件。
图7是表示根据本发明的分析每个基因型的用于检测能确定针对VHSV分离的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)结果的曲线图。
图8是将从各种基因型的PNA探针的熔解曲线图获得的熔解温度(Tm)总结为遗传密码的表。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。通常，本文使用的术语和下面将要描述的实验方法是本领域中公知和常用的。
在本发明中，为了快速方便地分析VHSV的地理基因型，选择用于确定病毒性出血败血症病毒(VHSV)基因型的单核苷酸多态性标记。
具体而言，为了确定各国从水生生物中分离的VHSV分离株的区域特异性序列，对VHSV G蛋白进行测序。结果显示，韩国VHSV分离株在第755个碱基对处指示A，在第756个碱基对处指示G，而从美国、加拿大和日本的水生生物中分离的VHSV分离株在第755个碱基对处指示C，并且在第756个碱基对处指示G，并且欧洲VHSV分离株在第755个碱基对处指示C且在第756个碱基对处指示A(图1和3)。
换句话说，当使用比DNA-DNA结合更强的PNA-DNA结合时，即使在一个核苷酸错配的情况下，PNA也显示出约10至15℃的熔解温度(Tm)差异。使用该特征发现可以检测到VHSV的插入缺失突变(In/Del)中的单核苷酸多态性(SNP)突变和核苷酸变化(图2和4)。
因此，一方面，本发明涉及一种用于确定VHSV的区域特异性基因型的探针，其中，所述探针能够在严格条件下与病毒性出血败血症病毒(VHSV)的G蛋白序列中含有C755A和A756G单核苷酸多态性突变的序列片段杂交。
在本发明中，所述探针可以由5-20个核苷酸组成。
在本发明中，所述探针可以在8和9位置处具有对应于能确定VHSV的区域特异性基因型的G蛋白单核苷酸多态性(SNP)位点的序列。
在本发明中，所述探针可以由序列号1表示。
另一方面，本发明涉及具有连接到上述探针两端的报告基因和猝灭剂的PNA探针。换句话说，根据本发明的PNA探针可以具有能够猝灭连接到两端的报告基因的荧光的报告基因和荧光猝灭剂。在本发明中，报告基因可以是选自由FAM(6-羧基荧光素)，德克萨斯红，HEX(2',4',5',7',-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)，JOE，Cy3和Cy5组成的组中的一种或多种。猝灭剂可以是选自由TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)，BHQ1，BHQ2和4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(Dabcyl)组成的组中的一种或多种，但并不限于此，优选4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(Dabcyl)可用作猝灭剂。
此外，可以使用与用于分析TaqMan探针的水解方法不同的杂交方法分析PNA，并且具有相似功能的探针包括分子信标探针、蝎型探针等。
图1是说明根据本发明一种优选实施方式的用于检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的PNA的技术特征的概念图。如其中所示，根据本发明的PNA在与靶核酸杂交后可以产生荧光信号。随着温度升高，PNA在其合适的熔解温度(Tm)处从靶核酸迅速熔解，从而将荧光信号淬灭。根据本发明，通过基于根据该温度变化从荧光信号获得的熔解曲线的高分辨率荧光熔解曲线分析(FMCA)，可以检测靶核酸中核苷酸突变的存在或缺少。如果根据本发明的PNA与靶核酸的核苷酸序列完全匹配，则然后其显示预期的熔解温度(Tm)值，但是如果PNA与其中存在核苷酸突变的靶核酸错配，它表现出低于预期值的熔解温度(Tm)值。
本发明人比较分析了能确定对VHSV起源的每个区域鉴定的基因型的遗传位点，从而构建了包含由序列号1所示的核苷酸序列的PNA。使用该PNA，从VHSV DNA样品获得熔解曲线，并从熔解曲线分析探针的熔解温度(Tm)。结果是，如下面的实施例中所述，对于能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)，可以获得不同的结果。根据本发明，使用对DNA具有高结合亲和力的PNA，以便根据能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)表现出不同的熔解温度(Tm)，因此能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNP)可以以简单、快速和准确的方式检测到。
在本发明中，虽然对PNA的核苷酸序列的长度没有特别的限制，但PNA可以被构建为具有5-20个碱基的长度以便含有能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNP)。
在本发明中，通过调整PNA的长度可以构建探针以具有期望的Tm值，并且即使在具有相同长度的PNAs的情况下，也可以通过改变核苷酸序列来调整Tm值。此外，由于PNA具有比DNA探针更高的结合亲和力，因此，通常具有更高的Tm值。因此，可以将PNA构建为具有比DNA探针更短的长度，从而可以检测甚至相邻的SNPs。在传统的HRM(高分辨率熔解)方法中，与靶核酸的Tm值的差异低至约0.5℃，因此，需要附加的分析程序或温度的微小变化或校正，为此，当出现两个或多个SNPs时，难以进行分析。然而，根据本发明的PNA不受探针序列和SNPs的影响，因此，能够以简单方便的方式进行分析。
另外，对于与具有核苷酸突变的靶核酸的熔解温度(Tm)的差异，根据本发明的PNA优选被设计为使得靶核酸中的核苷酸突变的位置对应于靶核酸的中心位置。当核苷酸突变位于探针的中心位置时，探针在结构上与靶核酸不同，并且PNA在形成环的同时与靶核酸结合。由于这种结构差异，探针在熔解温度(Tm)上显示出很大的差异。
为此，当根据本发明的PNA包含16至17个核苷酸时，其在第8和第9位置的一个或多个位置处优选具有对应于单核苷酸多态性(SNP)位点的序列。该PNA可以通过在其中心位置处含有对应于能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的序列来进行结构修饰，由此进一步增加与探针完全匹配的靶核酸的熔解温度(Tm)的差异。
此外，根据本发明的用于检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的PNA显示出取决于与其结合的核苷酸序列(或SNP)的不同的熔解温度(Tm)。因此，可以用一个PNA(或探针)检测两个或更多个核苷酸序列，并且两个或更多个PNAs可以包含在一个管中以供使用。
根据本发明的PNA涉及用于确定VHSV的区域特异性基因型的技术。具体地，通过将本发明的PNA与VHSV的靶核酸杂交，并分析由杂交产生的熔解曲线(图2)，可以简单、快速和准确地检测VHSV中的单核苷酸多态性。
因此，另一方面，本发明涉及通过使用PNA来检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的方法，该方法包含以下步骤：(a)从VHSV中分离靶DNA；(b)使靶DNA与上述探针杂交；(c)获得温度依赖性熔解曲线，同时增加步骤(b)产生的杂交产物的温度；以及(d)分析所获得的熔解曲线。
另外，本发明涉及通过使用PNA来检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的方法，该方法包含以下步骤：(a)从VHSV中分离靶DNA；(b)使靶DNA与上述PNA杂交；(c)获得温度依赖性熔解曲线，同时增加步骤(b)产生的杂交产物的温度；以及(d)分析所获得的熔解曲线。
使靶DNA杂交的步骤(b)包括使根据本发明的PNA与VHSV的DNA反应。该步骤可以包括PCR过程，并且可以使用用于PCR的正向/反向引物组。该杂交步骤和PCR条件可以包括本领域普通技术人员公知的所有各种方法(以下称为“PHOSITA”)。另外，该杂交步骤可以包括完成PCR之后的熔解过程。
在本发明中，从VHSV分离的靶DNA可以含有G蛋白基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点。通常，在VHSV表面上表达的G蛋白编码基因具有能够进行物种鉴别和区域鉴别的基因型，因此作为确定病毒起源的区域的标记是有效的。
此外，进行获得温度依赖性熔解曲线的步骤以获得VHSV DNA样品的熔解温度(Tm)。具体地，通过在提高杂交产物温度的同时测量荧光强度，可以获得荧光强度的温度依赖性变化作为温度依赖性熔解曲线。即作为杂交分析方法，可以使用FMCA(荧光熔解曲线分析)。FMCA是通过Tm分析PCR产物和添加的探针之间的结合亲和力的差异的方法。例如，可以通过使用常规实时PCR系统测量荧光强度，同时每次将温度升高1℃，以获得Tm值。
然后，检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的步骤是基于所获得的熔解曲线的熔解温度，检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的步骤。例如，可以将获得的熔解曲线的熔解温度与能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的先前已知的熔解温度进行比较，从而检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)。使用根据本发明的PNA获得的熔解曲线具有取决于能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的不同熔解温度(Tm)(图8)。使用熔解温度的这种差异，能够检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)。
图7是表示通过使用根据本发明的PNA用于检测单核苷酸多态性(SNPs)的方法中由熔解曲线而获得熔解峰曲线的步骤的曲线图，该单核苷酸多态性可以确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型。如其中所示，使用熔解曲线的斜率值，可以获得温度依赖性熔解峰曲线。该熔解峰曲线使得易于掌握能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的熔解温度(Tm)。为此，基于所获得的熔解峰曲线的熔解温度，获得温度依赖性熔解曲线的步骤包括从获得的温度依赖性熔解曲线获得温度依赖性熔解峰曲线的步骤，并且检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的步骤能够检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)。
另一方面，本发明涉及用于检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的试剂盒，该试剂盒包含上述探针或PNA。
在本发明中，该试剂盒是用于分析多个靶DNA或单个靶DNA的核苷酸多态性的试剂盒。
在本发明中，该试剂盒的探针可以是PNA。
本发明的试剂盒可以任选地包括进行靶核酸扩增反应(例如PCR反应)所需的试剂，例如缓冲液、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。另外，本发明的试剂盒还可以包含各种多核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。
当使用试剂盒时，通过分析使用PNA获得的熔解曲线，可以有效地检测单核苷酸突变和由靶核酸中的核苷酸缺失或插入引起的突变，由此检测能确定对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)。
实施例
在下文中，将参照实施例进一步详细描述本发明。对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅仅是说明性的目的，而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型所特异性的单核苷酸多态性(SNP)标记的研发
为了确定不同国家从水生生物中分离的VHSV分离株的区域特异性序列，使用设计的VHSVG-ORF-F1(5’-ATGGAATGGAATACTTTTTTCTTGGTG-3’)和VHSV-G-ORF-R1(5’-TCAGACCGTCTGACTTCTGGAGAACTGC-3’)的引物组，通过PCR扩增具有高度序列突变的G基因的全长开放阅读框(ORFs)序列，从而获得1524bp的PCR产物。使用Easy载体(Promega，USA)克隆PCR扩增产物并使用ExprepTM质粒SV DNA制备试剂盒(GeneAllBiotechnology Co.，Ltd.，Korea)纯化，并对纯化的质粒DNA进行测序。
将从各个区域分离的VHSVs的G蛋白序列进行比对，并确定在韩国VHSV分离株中特异性存在的基因序列。已经显示，使得有可能检测韩国VHSV分离株的核苷酸是VHSV G蛋白基因的755bp和756bp处的核苷酸。具体地，韩国VHSV分离株中的核苷酸为A(755bp)和G(756bp)，分离自美国、加拿大和日本的VHSV分离株中的C(755bp)和G(756bp)，以及欧洲VHSV分离株中的C和A。
实施例2：用于测定VHSV的区域特异性基因型的PNA的制备
从VHSV提取的RNA被逆转录以合成cDNA。为了使用cDNA作为模板进行PCR，制备了G蛋白引物对。
具体地，对VHSV的G蛋白基因进行测序，并且将核苷酸序列彼此比较以鉴定对于VHSV发生的每个区域显示的显著性SNP。基于SNPs，选择区域特异性序列。
图4显示了根据本发明的VHSV G蛋白基因的部分和SNP的核苷酸序列和由其衍生的PNA探针的实施例，图5示出了表明PNA探针与VHSV G蛋白基因上的结合序列之间的结合亲和力以及根据此的PNA探针的结合亲和力的基因多样性。在图5中，PNA探针与作为区域特异性遗传位点的755和756位置处残基的结合程度表示为“匹配”和“错配”。如图5所示，错配的数量使区域鉴别成为可能。因此，将在其中心位置处具有的核苷酸序列(序列号1)构建为根据本发明的PNA探针的核苷酸序列。
如上所述，确定了根据本发明的PNA探针的核苷酸序列。该核苷酸序列如下表1所示。
[表1]
| 序列号 | 名称 | 序列(5'→3') | 备注 |
| 序列号1 | VHSV-1 | Dabcyl-GCATGCAAGGTGAC-O-K(HEX) | PNA |
在表1中，O代表连接子，K代表赖氨酸。
为了使测量PNA探针的荧光成为可能，将HEX连接到PNA探针上。
接下来，如上表1所示，使用核苷酸序列，报告基因和猝灭剂构建根据本发明的PNA探针。PNA探针是使用PNA探针设计器(Appliedbiosystems，USA)设计的。所有用于本发明的PNA探针都是使用Panagene(Korea)的HPLC纯化方法合成的。通过质谱分析所有合成的探针的纯度，避免探针的不必要的二级结构与靶核酸的有效结合。
实施例3：VHSV样品的熔解曲线分析
使用根据以上实施例1和2构建的PNA探针，获得从每个区域分离的VHSV的cDNA样品的熔解曲线，并分析以检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)。
使用CFX96TM实时系统(Bio-Rad Laboratories Inc.，USA)在不对称PCR条件下进行PCR以产生单链靶核酸。不对称PCR条件如下。将三个探针(0.5μL实施例1中构建的PNA探针，0.05μM正向引物和0.5μM反向引物(不对称PCR，表2))和0.5μL海豚球菌DNA加入到1XSeaSunBio实时FMCATM缓冲液(SeasunBio，韩国)，2.5mM MgCl2，200μM dNTPs和1.0U Taq聚合酶中至总体积为20μl，然后进行实时PCR。
[表2]
| 序列号 | 引物名称 | 序列(5'→3') |
| 序列号2 | VHSV-F1 | GATCACAGGGTGGTCAAGGCAA |
| 序列号3 | VHSV-R1 | TCCCCCAGGTCGGTCTTGATC |
图6是显示根据本发明的实施例的扩增VHSV cDNA样品的G蛋白区域的过程中的温度和时间条件，将根据实施例1和2构建的PNA探针与扩增产物杂交并提高杂交产物温度的表。如图6所示，实时PCR过程在以下条件下进行：在95℃变性5分钟，然后重复40个循环，每个循环由95℃30秒，56℃45秒和74℃30秒。在以下条件下进行熔解曲线分析：95℃变性5分钟，然后从85℃至25℃开始进行逐步杂交，随后进行荧光测量，同时温度以1℃的速度从25℃升高至85℃。每个步骤之间停止状态保持10秒。
如图7中所示，在一个管中测量熔解曲线，并且每个熔解曲线的曲线数目代表不同样品的测量值。从其中可以看出，使用根据本发明的PNA获得的熔解曲线具有根据VHSV分离的区域的不同熔解温度(Tm)。
图8是比较来自温度依赖性熔解曲线图的结果和作为分析单核苷酸多态性的标准方法的测序结果的表。
如本文所示，根据本发明的PNA探针的使用显示了一致的取决于VHSV分离的区域的熔解温度，表明使用根据本发明的PNA探针使得有可能检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)。
当使用根据本发明的PNA探针来鉴别未知的VHSV cDNA样品种类时，可以预置和使用如图8所示的熔解温度依赖性类型。
具体地，如实施例2中所述通过进行熔解曲线分析而获得的Tm值中约69℃的峰被认为是完全匹配的，约58℃的峰被认为是单个错配，并且约49℃的峰被认为是双重错配。根据分析结果，将韩国VHSV分离株编码为完全匹配，将美国，加拿大，日本和中国VHSV分离株编码为单个错配，并将欧洲VHSV分离株编码为双重错配，使得每个分离株具有特征值。
工业适用性
根据本发明的对DNA具有高结合亲和力的PNA探针可以用于表现出取决于对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型的不同熔解温度，由此对VHSV起源的每个区域进行鉴定的基因型标记能够以简单、快速和准确的方式而确定。
另外，根据本发明的用于确定VHSV的区域特异性基因型的PNA可以具有通过在其中心位置处包含对应于能确定用于VHSV来源的每个区域的基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的序列的结构修饰，由此可以进一步提高与PNA完全匹配的靶核酸的熔解温度(Tm)的差异。
此外，根据本发明的用于检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的PNA显示出取决于与其结合的核苷酸序列(或SNP)的不同熔解温度(Tm)。因此，可以用一个PNA(或探针)检测两个或更多个核苷酸序列，并且两个或更多个PNAs可以包含在一个管中以供使用。
序列目录(自由文本)
附上其电子版本。
序列表
<110> 大韩民国（国立水产科学院）
<120> 用于鉴定病毒性出血败血症病毒(VHSV)的地理分布和分子流行病学的探针及其应用
<130> PF-B1918
<140> PCT/KR2016/008830
<141> 2016-08-11
<150> 10-2015-0116166
<151> 2015-08-18
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VHSV-1
<400> 1
gcatgcaagg tgac 14
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VHSV-F1
<400> 2
gatcacaggg tggtcaaggc aa 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VHSV-R1
<400> 3
tcccccaggt cggtcttgat c 21
Claims (11)
1.一种用于鉴定病毒性出血败血症病毒(VHSV)的区域特异性基因型的探针，其中，所述探针能够在严格条件下与VHSV G蛋白序列中具有C755A和A756G单核苷酸多态性突变的序列片段杂交。
2.根据权利要求1所述的探针，其中，所述探针由5至20个核苷酸组成。
3.根据权利要求1所述的探针，其中，所述探针在第8和第9位置处具有对应于能确定VHSV的区域特异性基因型的G蛋白单核苷酸多态性(SNP)位点的序列。
4.根据权利要求1所述的探针，其中，所述探针由序列号1表示。
5.一种用于确定病毒性出血败血症病毒(VHSV)的区域特异性基因型的PNA探针，其中，该PNA探针包含连接到权利要求1-4中任一项所述的探针两端的报告基因或猝灭剂。
6.根据权利要求5所述的PNA探针，其中，所述报告基因是选自由FAM(6-羧基荧光素)、德克萨斯红、HEX(2',4',5',7',-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)、JOE、Cy3和Cy5组成的组中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的PNA探针，其中，所述猝灭剂是选自由TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、BHQ1、BHQ2和4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(Dabcyl)组成的组中的一种或多种。
8.一种用于检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的试剂盒，其中，该试剂盒包含权利要求1-4中任一项所述的探针。
9.一种用于检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的试剂盒，其中，该试剂盒包含权利要求5所述的PNA探针。
10.一种检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的方法，该方法包含以下步骤：
(a)从VHSV中分离靶DNA；
(b)使所述靶DNA与权利要求1-4中任一项所述的探针杂交；
(c)获得温度依赖性熔解曲线，同时增加步骤(b)产生的杂交产物的温度；
以及(d)分析所获得的熔解曲线。
11.一种通过使用PNA来检测能确定VHSV的区域特异性基因型的单核苷酸多态性(SNPs)的方法，该方法包含以下步骤：
(a)从VHSV中分离靶DNA；
(b)使所述靶DNA与权利要求5所述的PNA探针杂交；
(c)获得温度依赖性熔解曲线，同时增加步骤(b)产生的杂交产物的温度；
以及(d)分析所获得的熔解曲线。
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