CN100415884C - 一种用于研究鱼类遗传关系的dna分子标记方法 - Google Patents
一种用于研究鱼类遗传关系的dna分子标记方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及鱼类的DNA分子标记技术。本发明选择Sox基因族的HMG(High mobilitygroup)保守区域为分子克隆的目标，设计独特简并引物，应用PCR、琼脂糖凝胶电泳等方法获得在数目和种类上有差异的Sox基因的DNA片段，用这些特殊的DNA分子来判断和分析不同鱼类的遗传特性和遗传关系。该方法可以快速准确分析鱼类的遗传关系，也能应用于其他动物的遗传关系分析。
Description
技术领域
本发明涉及利用分子遗传标记来分析鱼类之间的分子遗传关系，具体涉及用DNA分子标记来判断和分析不同鱼类的遗传特性和遗传关系。
背景技术
对生物遗传变异的分析，一是直接测序，一是借助分子遗传标记。目前大规模全基因组测序发展迅猛，但对生物界所有物种测序是不现实的。分子遗传标记仍然是个体水平和群体水平上分析生物遗传多样性及其变化规律的主要手段，广泛应用于群体遗传学、系统学、进化生物学、遗传作图等理论研究及保护生物学、动植物遗传育种、疾病诊断等实践领域。
目前，DNA分子标记主要有以下五种：(1)线粒体DNA(mtDNA)分子标记；(2)基于Southern杂交分子标记，如限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)，荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)和单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)；(3)基于PCR的分子标记技术，如随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)，扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和单链构象多态-DNA聚合酶链式反应(Single-Strand ConformationPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，SSCP-PCR)；(4)基于重复序列的分子标记，如微卫星DNA和小卫星DNA；(5)基于mRNA的分子标记，如逆转录PCR(Polymerase ChainReaction)和差异显示逆转录PCR。
1990年，Sinclair等人在人类和小鼠中克隆了睾丸决定因子SRY/Sry(Sexdetermining region on Y chromosome)基因，进一步研究发现Sry基因编码的蛋白质产物中含有一段具有高度保守性且具有结合DNA功能的区域(称为：highmobility group，HMG)。Sox基因族编码的蛋白质中都含有HMG区域，每个Sox基因的HMG序列与Sry基因的HMG序列至少具有60％的同源性。目前，已在进化位置明显不同的各类物种如哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及昆虫中克隆出了40多个Sox基因，对其序列和功能进行了研究，迄今发现的所有Sox基因，按其HMG-box盒的同源性程度，可划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个不同的亚族。如C组的Sox4基因参与心脏管腔发育，E组的Sox9基因参与睾丸的发育，F组中的Sox18基因参与血管的发育。但是目前还没有利用Sox基因族的DNA片段作为分子遗传标记来判断不同鱼类的遗传特性和分析它们的遗传关系的报道。
发明内容
本发明旨在应用扩增获得的DNA片段作为分子遗传标记分析不同鱼类之间的遗传关系。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的：用Sox基因族的HMG-box的保守序列设计简并引物，通过PCR、琼脂糖凝胶电泳获得Sox基因的DNA片段，根据扩增片段在数目和种类上的共同性和差异性分析不同鱼类之间的遗传关系，简并引物序列为：
上游引物：5’TGAAGCGACCCATGAA(C/T)G 3’；
下游引物：5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3’。
下面结合附图进一步详述本发明。
附图说明
图1 部分鱼种Sox基因HMG-box DNA片段的扩增图。
其中M 200bp分子梯度标记；1.红鲫；2.鲤鱼；3.鲫鲤F1；4.鲫鲤F2；5.异源四倍体鲫鲤；6.雄核发育二倍体鲫鲤；7.雌核发育二倍体鲫鲤第一代(G1)；8.雌核发育二倍体鲫鲤第一代(G2)；9.日本白鲫；10.雌核发育日本白鲫；11.三倍体湘云鲫(日本白鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂))；12.三倍体鲫鱼(红色双尾金鱼(♀)×四倍体鲫鲤(♂))；13.异源四倍体鲫鲤；14.红色双尾金鱼；15珍珠双尾金鱼；16.黑色双尾墨龙金鱼；17.本地鲫鱼；18.彭泽鲫。
图2部分鱼种Sox基因HMG-box DNA片段的扩增图。
其中M 200bp分子梯度标记：1.雌核发育二倍体鲫鲤；2.异源四倍体鲫鲤；3.雌核发育二倍体鲫鲤(G1)(♀)×四倍体鲫鲤(4n)(♂)；4.单尾红鲫；5.双尾红鲫；6.灰色鲤鱼；7.白色鲫鱼。
引物设计
参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列，用Primer Premier 5.0软件和Jellyfish1.4软件设计独特的简并引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下：上游引物：5’TGAAGCGACCCATGAA(C/T)G 3’；下游引物：5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)T T3’。
实验材料
红鲫(Carassius carassius red var.，2n＝100)和鲤鱼(Cyprinus carpio L.，2n＝100)及其二倍体杂交后代鲫鲤F1-F2，异源四倍体鲫鲤(人工鲫鲤杂交产生的四倍体鱼)，雄核发育二倍体鲫鲤，雌核发育二倍体鲫鲤第一代(G1)、第二代(G2)，日本白鲫(Carassius auratus cuvieri)，雌核发育日本白鲫，三倍体湘云鲫(日本白鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂))，三倍体金鱼(红色双尾金鱼(♀)×四倍体鲫鲤(♂))，黑色双尾墨龙金鱼，珍珠双尾金鱼，红色双尾金鱼，雌核发育二倍体鲫鲤第一代G1(♀)×异源四倍体鲫鲤4n(♂)自交后代分离出的单尾红鲫，双尾红鲫，灰色鲤鱼，白色鲫鱼，本地鲫鱼，彭泽鲫(Carassius auratus varpengze)。
基因组DNA的提取
血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒进行。提取的DNA用紫外分光光度计检测其浓度，-20℃保存。
PCR扩增和克隆
PCR反应在美国Applied Biosystems公司生产的
PCR System 2700热循环仪上进行，每个扩增反应总体积为25μl，其中模板基因组DNA 80ng，每种dNTP200μmol.l-1，每种引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反应液在94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35个循环，最后在72℃延伸10min。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳中分离，用上海Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段，纯化方法参照产品手册进行。将回收的DNA片段克隆于载体pMD18-T(TakaRa公司)，连接反应及细菌转化按pMD18-T载体试剂盒说明书进行操作。
测序和序列分析
选取阳性克隆菌落，提取重组质粒pMD18-T，经过菌落PCR和酶切鉴定后，由上海Sangon公司对阳性克隆进行测序，采用Blast软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较，根据其与查询序列的最高相似性而命名所得克隆。
本研究根据Sox基因家族HMG保守区设计独特简并引物，通过PCR扩增不同鱼类基因组DNA片段并对一些DNA片段的序列进行了测序。结果表明，不同鱼类中Sox基因的DNA片段扩增产物在数目、大小和种类方面存在共同性和差异性，通过这些差异性和共同性可以确定它们各自的遗传特性和分析它们的遗传关系。本发明基于Sox基因组DNA片段的数目、大小和种类的分子标记技术可以快速、准确、特异、敏感地确定不同鱼类的分子遗传特性并分析它们的分子遗传关系。
具体实施方式
现以红鲫(Carassius carassius red var.)为例具体介绍本发明。按活体解剖确定红鲫性别，选择性成熟红鲫个体。用一次性注射器从红鲫背动脉取血，血液DNA的提取按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒进行。提取的DNA用紫外分光光度计检测其浓度，-20℃保存。
参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列，用Primer Premier 5.0软件和Jellyfish1.4软件设计独特的简并引物，由上海Sangon公司合成。其序列如下：上游引物：5’TGAAGCGACCCATGAA(C/T)G 3’；下游引物：5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3’。以红鲫基因组DNA为模板，设计PCR体系扩增其Sox基因。具体步骤如下：PCR反应在美国Applied Biosystems公司生产的
PCR System 2700热循环仪上进行，每个扩增反应总体积为25μl，其中红鲫基因组DNA 80ng，每种dNTP 200μmol.l-1，每种独特的简并引物各0.25μmol.l-1，TaqDNA聚合酶1.25U，反应液在94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸80s，共35个循环，最后在72℃延伸10min。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳中分离，用凝胶成像扫描仪拍照，结果见图1中1号样品所示，可见清晰的三条扩增带，大小分别约为200、600和1900bp。
其它实验鱼Sox基因的扩增和克隆方法与红鲫基本一致，结果见图1图2。从图1可知，二倍体鲫鲤F1-F2(3、4号样品)以及异源四倍体鲫鲤(在鲫鲤F3中形成四倍体鲫鲤，目前繁殖到F15，证明鲫鲤F3-F15都是四倍体鱼)(5号样品)中有四条大小分别约为200、600、900和1900bp的DNA扩增带，而在其原始母本-红鲫(1号样品)只有3条带和原始父本-鲤鱼中(2号样品)只有2条扩增带，大小分别约为200、600、1900bp和200、900bp。这些结果表明二倍体鲫鲤F1-F2和四倍体鲫鲤都既兼有其原始亲本共有的200bp扩增带，又有区别于鲤鱼，红鲫特有的600，1900bp扩增带和区别于红鲫，鲤鱼特有的900bp扩增带。通过这些扩增带特征，我们能很容易的区分红鲫和鲤鱼及它们的二倍体和四倍体杂交后代。四倍体鲫鲤产生的二倍体精子通过无需染色体加倍的雄核发育过程发育成为二倍体雄核发育杂交后代(6号样品)，本实验结果表明它们具有同鲫鲤F1-F2、四倍体鲫鲤同样大小的四条带，从分子水平证明了它们的异源性，同样本实验结果也证明四倍体鲫鲤产生的二倍体卵子通过雌核发育过程形成的雌核发育后代(G1和G2)(7、8号样品)也具有类似的四条带，显示出异源性，证明它们是一个杂交克隆体系。
日本白鲫(9号样品)和雌核发育白鲫(10号样品)具有相同的大小分别约为200和640bp的2条带，说明雌核发育白鲫的遗传组成中与其母本的遗传组成是一致的，没有检测到父本(团头鲂，Megalobrama amblycephala)的遗传物质。这两条带特别是640bp这条带的特征可作为区分白鲫与红鲫、鲤鱼、金鱼、本地鲫鱼以及彭泽鲫的分子遗传标记。三倍体湘云鲫(11号样品)具有5条带(大小分别约为200、600、620、900和1900bp)，兼有父母本的带，这五条带可作为区分红鲫、鲤鱼、白鲫、四倍体鲫鲤等鱼的分子遗传标记。而由红色双尾金鱼作为母本制备的三倍体鲫鱼(12号样品)只具有四条带，以此可以把此三倍体鲫鱼与三倍体湘云鲫区分出来。红色双尾金鱼(14号样品)，珍珠双尾金鱼(15号样品)，黑色双尾墨龙金鱼(16号样品)，都只具有2条大小分别为200和600bp的带，说明这三种金鱼虽然在体色和形态方面都存在差异，但是在遗传组成方面它们是非常相似的并与白鲫的遗传组成很接近。本地鲫鱼(17号样品)与金鱼、日本白鲫很接近都只具有2条带，但是与彭泽鲫(18号样品)有显著的差异(彭泽鲫具有4条带)，这说明彭泽鲫比本地鲫鱼、日本白鲫和金鱼具有更复杂的遗传组成。
从图2可知，雌核发育二倍体鲫鲤(G1)(♀)×四倍体鲫鲤(4n)(♂)(3号样品)具有与亲本(1和2号样品)完全相同的扩增带，说明G1(♀)×4n(♂)具有红鲫和鲤鱼两种遗传成分，单尾红鲫(4号样品)，双尾红鲫(5号样品)，灰色鲤鱼(6号样品)和白色鲫鱼(7号样品)是一些特殊的G1(♀)×4n(♂)后代通过自交的方式产生的具有分离性状的不同类型的鱼，其中红色单尾红鲫，双尾红鲫，白色鲫鱼都是类似红鲫的鲫鱼，其外形特征偏向于它们的原始母本红鲫，其共同的基本特征就是它们都没有须。本研究结果显示它们具有3条同样大小的DNA带，说明它们的遗传组成与红鲫是一致的；分离后代中的灰色鲤鱼与普通鲤鱼的外形是完全一致，本实验结果表明它们都具有不相同的DNA带，说明它们的遗传组成是不一致的。该实验结果为证明雌核发育效应可以导致异源四倍体鲫鲤的自交后代出现分离提供了重要的分子遗传标记证据。
为了进一步确定红鲫这三条扩增带的性质，用一次性刀片分别切取这三条扩增带，经Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段，纯化方法参照产品手册进行。将回收的三个不同大小的DNA片段分别克隆于载体pMD18-T(TakaRa公司)，连接反应及细菌转化按pMD18-T载体试剂盒说明书进行操作。
从三个不同平板上选取阳性克隆菌落，分别提取重组质粒pMD18-T，经过菌落PCR和酶切鉴定后，由上海Sangon公司对三种不同阳性克隆进行测序，采用Blast软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较，并根据其与查询序列的最高相似性而命名所得克隆。
对四倍体鲫、鲤的4条扩增带(5号)进行测序，测序结果表明：四倍体鲫鲤中的200bpDNA片段属于Sox18基因，600bpDNA片段属于Sox9a基因，900bpDNA片段属于Sox9b基因，1900bpDNA片段属于Sox4基因。该结果表明四倍体鲫鲤兼有其原始父母本的遗传基因，它们是异源四倍体而不是同源四倍体，研究表明异源四倍体比同源四倍体具有更多的生物学优势。
Claims (1)
1. 一种用以分析鱼类遗传特性和遗传关系的DNA分子标记方法，其特征在于用Sox基因族的HMG-box的保守序列设计简并引物，通过PCR、琼脂糖凝胶电泳获得Sox基因的DNA片段，根据扩增片段在数目和种类上的共同性和差异性分析不同鱼类之间的遗传关系，简并引物序列为：
上游引物：5’TGAAGCGACCCATGAA(C/T)G 3’；
下游引物：5’AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)TT 3’。
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