KR102368527B1

KR102368527B1 - 산동삼면 검출용 바이오 마커 조성물

Info

Publication number: KR102368527B1
Application number: KR1020200071594A
Authority: KR
Inventors: 김성완; 김기영; 김성렬; 강상국; 김수배; 박종우; 홍정원; 유정희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2022-03-02
Also published as: KR20210154504A

Abstract

본 발명은 산동삼면 검출용 바이오 마커 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하여 신규 누에의 품종 비교 분석을 통한 계통 연구 및 정보 분석이 가능하고, 본 발명의 키트를 이용하면 누에 품종 중 산동삼면만을 간편하고 신속하게 특이적으로 검출할 수 있어, 누에 품종 간 비교 분석을 통한 누에의 분자육종 및 신품종 개발을 위한 기반을 구축할 수 있다.

Description

산동삼면 검출용 바이오 마커 조성물 {Bio marker composition for detection of Bombyx mori}

본 발명은 산동삼면 검출용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.

누에는 집에서 사육되는 가잠(家蠶)과 야생에서 사육되는 야잠(野蠶)으로 분류할 수 있다. 가잠은 농번기를 피하여 여름이나 겨울에 사육하며, 뽕잎만 있으면 사육할 수 있으므로 알을 냉장해 두었다가 필요에 따라 사육하고 있다. 야잠은 그 종류가 많으나 가장 유명한 것은 작잠이고, 그 외에 천잠과 율충견이 있다.

도토리나무나 가락나무 등의 잎을 먹고 자라는 작잠(Antheraea pernyi)은 산둥성, 랴오둥반도, 인도 등지에서 다량 생산되며, 떡갈나무 잎을 먹는 천잠(Antheraea Yamamai)은 일본의 장야(長野), 광도(廣島) 등의 특산품으로 담녹황색의 고치를 지으며, 산고치견(Yamamai silk)이라고도 한다. 어스랑이라고도 불리는 율충(Caligula Japonica, 밤나무산누에나방)은 밤나무 잎을 먹으며, 회갈색의 딱딱한 고치를 짓는 누에이다.

누에는 그 시발지인 중국으로부터 세계의 여러 지역으로 전파되어 서로 다른 각 지역의 자연환경에 적응하면서 각 지역에 따른 형질적 특징을 갖게 되었다. 중국종계 누에알은 연한 녹색 기운이 도는 회색으로 일본종계보다 빛깔이 연하다. 유충은 희잠(plain)으로 성장이 비교적 빠른 편이다. 익은 누에는 푸른 빛을 띠며, 병과 환경에 대한 저항성이 강한 편이다. 고치의 형태는 타원형이고, 고치에서 나오는 견사는 가늘다.

일본종계 누에알의 색은 회갈색이며 익은 누에는 붉은빛을 띤다. 유충은 형잠(normal marking)으로 유충기간이 중국종보다 약간 길고, 고치는 땅콩형으로 짓는다. 견사는 길이가 굵고 짧은 편이다. 유럽종계 누에알의 색은 일본종계보다 연하며, 몸이 길고 다른 종보다 크고 무거운 것이 특징이다. 중국종계와는 달리 누에병과 환경에 대한 저항성이 약하여 사육하기가 어렵다. 고치는 긴 타원형이며, 실로 만들기가 가장 좋은 종자이다.

열대종계는 인도와 동남아시아가 원산지로 방추형의 작은 고치를 지으며, 고치색은 황색 또는 녹색이 대부분이다. 누에알은 작고 광택이 있으며, 유충기간은 짧지만, 매우 튼튼하다. 재래종은 19세기까지 사육되어온 우리나라의 누에로 흰색 또는 황색 고치를 짓는 삼면잠누에가 있다.

세계적으로 약 3,000여 품종의 누에가 다양한 목적에 의해서 보전되고 있는 가운데 국내에서는 340여 계통을 국가 유전자원으로 보존하고 있으며, 매년 육종을 통하여 한별누에 등 신품종을 육성하고 있다. 이들 누에 계통과 함께 삼면잠을 비롯한 5종의 우리 고유 재래종이 있으나, 실크 생산을 위한 1차 산업적인 유용성이 매우 낮아 재래종에 대한 연구 및 산업적 활용이 거의 없는 실정이다.

각 누에 유전자원은 오랜 기간 순화로 유전자원 내 고유 유전적 형질이 존재하나 국내 고유 품종을 비롯한 보존된 유전자원에 관한 비교 연구는 전무한 실정으로, 품종 구분을 위한 적절한 분자 마커의 개발이 시급하다.

한국등록특허 제10-1232878호(2013.02.06)에는, 깍지벌레류의 미토콘드리아 COⅠ유전자 DNA 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머에 관하여 개시되어 있다. 한국등록특허 제10-1955124호(2019.02.27)에는, 해선어류의 DNA 바코딩 영역인 미토콘드리아 CO1 유전자의 PCR 증폭반응과 DNA 염기서열 해독을 위한 신규 프라이머 조합과 이를 이용한 핵선서열해독방법에 관하여 개시되어 있다. 한국등록특허 제10-1913744호(2018.10.25)에는, 긴꼬리도약옆새우 서식지 판별용 단일염기다형성(SNP) 유전자마커 및 그를 이용한 서식지 판별방법에 관하여 개시되어 있다.

본 발명은 산동삼면을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종 중 산동삼면을 특이적으로 구분하기 위한 마커 조성물을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 산동삼면에 특이적인 SNP 마커 조성물 및 산동삼면 검출용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산동삼면 검출용 프라이머 세트를 및 이를 포함하는 산동삼면 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산동삼면 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 산동삼면 특이적 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 산동삼면 특이적 SNP 마커 조성물에 있어, 상기 산동삼면 특이적 SNP 마커는, 바람직하게 사이토크롬산화효소 Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ) 유전자 내 2536번째 염기서열이 구아닌(guanine)인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 사이토크롬산화효소 Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ) 유전자 내 2536 위치의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 산동삼면 검출용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 포함하는 산동삼면 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

한편, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 포함하는 산동삼면 검출용 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 포함하는 산동삼면 검출용 키트를 제공한다.

한편, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 시료를 증폭하는 단계;를 포함하는 산동삼면 검출방법을 제공한다. 이때, 본 발명의 산동삼면 검출방법은, 바람직하게 제한효소를 처리하는 단계;를 더 포함하는 것이 좋다.

본 발명의 산동삼면 검출방법에 있어, 상기 증폭은, 바람직하게 90~95℃에서 2~8분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 90~95℃에서 30초~3분, 40~60℃에서 30초~3분, 65~80℃에서 30초~3분을 한 세트로 30~40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 68~75℃, 1~10분을 한 세트로 1~3 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 좋다.

본 발명의 SNP 마커를 이용하여 신규 누에의 품종 비교 분석을 통한 계통 연구 및 정보 분석이 가능하고, 본 발명의 키트를 이용하면 누에 품종 중 산동삼면만을 간편하고 신속하게 특이적으로 검출할 수 있어, 누에 품종 간 비교 분석을 통한 누에의 분자육종 및 신품종 개발을 위한 기반을 구축할 수 있다.

도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 염기서열 분석결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 방법에 의해 검출된 산동삼면을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 1반복구 도이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 검출된 산동삼면을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 2반복구 도이다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 검출된 산동삼면을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 3반복구 도이다.
도 5는 본 발명의 방법에 의해 검출된 산동삼면을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 4반복구 도이다.
도 6은 본 발명의 방법에 의해 검출된 산동삼면을 식별할 수 있는 전기영동 결과를 나타낸 5반복구 도이다.

이에, 본 발명은 산동삼면을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종 중 산동삼면을 특이적으로 구분하기 위한 마커를 개발하여 제공하고자 한다.

구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 산동삼면 특이적 SNP 마커 조성물을 제공한다.

산동삼면은 농촌진흥청 국립농과학원 씨앗은행에 등록번호 "KE10296"로 등록되어 있다. 누에유충무늬는 형잠이고, 면성은 3면성이며, 의장체색은 갈색이다. 또한, 유충체색은 밝은파랑이고, 월년난색은 회색이며, 견색은 엷은등황색이다. 고치모양은 방추형이며, 혈색은 백색을 띤다.

본 발명에서, 용어 "마커"란 누에 품종 중 산동삼면만을 특이적으로 구분할 수 있는 특정 염기서열을 의미한다.

본 발명에서, 용어 "단염기다형성(single nucleotide polmorphism; SNP)"이란 개체간 DNA 염기서열 하나에서 나타나는 차이를 말한다. DNA 염기서열의 특정 부위에 어떤 작물이 아데닌(adenine)을 가지고 있는 반면 어떤 작물은 시토신(cytosine)을 가지고 있는 것으로, 이러한 미세한 차이에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고, 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 초형을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다.

SNP는 지금까지 알려진 DNA 다형성의 약 80%를 차지하는 것으로 알려졌다. 인간 유전체에서 SNP는 약 1kb 마다 하나씩 존재하는 것으로 알려졌으며, 벼에서는 자포니카와 인디카 품종 간 약 170bp 마다 하나씩 SNP가 나타나는 것으로 보고되었다.

이론적으로 네 종류의 뉴클레오티드 중 어느 것이든 한 위치에 존재할 수 있기 때문에 각 SNP는 네 개의 대립인자를 가질 수 있다. 작은 크기 염기의 삽입과 결실도 SNP에 포함된다. 다만, SNP는 유전체의 점 돌연변이에 의해 생기므로 대부분의 SNP는 단지 두 가지 변형으로만 존재한다.

SNP는 존재하는 위치에 따라 유전자의 프로모터(promoter) 등 전사활성조절에 관계하는 영역에 존재하는 regulatory SNP (rSNP), 유전자의 인트론(intron) 부분에 존재하는 intronic SNP (iSNP), 유전자와 유전자 사이에 존재하는 genomic SNP (gSNP) 및 유전자의 엑손(exon) 부분으로 아미노산 변이를 일으키는 영역에 존재하는 coding SNP (cSNP)로 구분할 수 있다. cSNP는 아미노산의 변경이 없는 sSNP(synonymous SNP)와 아미노산이 변경되는 nsSNP(nonsynonymous SNP) 등으로 분류된다.

유전체 상에서 SNP를 동정하는 가장 직접적인 방법은 서로 다른 개체나 종의 유전체 전체의 DNA 염기서열을 직접 비교, 분석하는 것이며, 더 효율적인 전략으로는 여러 개체의 유전체 상의 일부분의 염기서열을 확보하여 비교 분석하는 것이다.

미토콘드리아 유전체는 모계유전을 통해 다음 세대로 유전물질을 전달하는 원형분자로 13개의 단백질암호화유전자(protein coding genes), 22개의 tRNA, 2개의 rRNA 및 하나의 비암호화유전자인 A+T rich region으로 구성된다.

본 발명은 산동삼면을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종의 미토콘드리아 유전체 DNA 염기서열을 비교 분석하였고, 그 중 본 발명은 산동삼면이 사이토크롬산화효소 Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ) 유전자 내 2536번째 염기서열이 구아닌(guanine)인 것을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 SNP 마커는, 바람직하게 사이토크롬산화효소 Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ) 유전자 내 2536번째 염기서열이 구아닌(guanine)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시키기 위하여 사용되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 세트를 의미하며, 용어 "프라이머 쌍"과 호환된다.

상기 프라이머는 DNA 합성의 시발점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징이 혼입될 수 있다. 또한, 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역 화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(알칼린포스파타아제), 방사선 동위원소(예. 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예. 바이오틴) 등이 있다.

한편, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 포함하는 산동삼면 검출용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 포함하는 산동삼면 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어, 상기 키트는, 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분으로서 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 키트는 역전사 반응 및 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략하는 바이다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있다. 상기 키트는 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다.

상기 적합한 담체로는, 이에 제한되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

제한단편길이다형성(restriction fragment length polymorphism; RFLP)은 1980년 데이비드 보스테인(David Bostein)과 그의 동료들이 제한효소(restriction endonuclease)로 가계지도를 작성하던 중 처음 발견되었다. 그들은 DNA 상의 특정 부위에 점 돌연변이(point mutation)가 생겨 제한효소로 절단하였을 때 나타나는 절편들의 길이가 개인마다 다양하게 나타나는 현상을 관찰하였다.

사람의 게놈(genome-유전자의 집합) 내에서 단일 염기쌍의 변이는 상당히 빈번하게 나타나는데, 연구에 따르면 단백질을 암호화하지 않는 유전자 부위에 있어 매 100-200 염기마다 한 염기는 점 돌연변이가 생성되며 질병과는 연관이 없이 개인차를 나타내는 표지로 사용될 수 있다고 한다. 실제 인간끼리의 유전자를 분석한 결과 약 1000개의 염기서열마다 한 개씩 염기가 서로 다르다는 것을 발견하였고 이것을 단일염기다형성이라고 한다. 영어로는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)라고 약칭한다. 즉, SNP에 의해 RFLP 현상이 나타나게 되는 것이다.

이러한 점 돌연변이는 특정 제한 효소(restriction enzyme)가 인지하는 부위에 변화를 가져올 수 있고 그 결과 제한 효소로 절단된 유전자의 길이에 변화를 가져올 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 프라이머 세트에 의해 증폭된 SNP를 HpaⅠ 제한효소를 이용하여 절단함으로써 산동삼면을 특이적으로 검출할 수 있었다.

또한, 본 발명의 산동삼면 검출방법에 있어, 상기 증폭은, 바람직하게 90~95℃에서 2~8분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고, 순차적으로 90~95℃에서 30초~3분, 40~60℃에서 30초~3분, 65~80℃에서 30초~3분을 한 세트로 30~40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 68~75℃, 1~10분을 한 세트로 1~3 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것이 좋다.

상기 변성을 수행하는 과정에서 30초 미만의 반응시간에서는 변성이 원활하게 이루어지지 않으며, 3분이 초과하면 과도한 변성이 일어나 다음 단계의 증폭 반응을 수행하는데 부적합하게 된다. 상기 신장을 수행하는 과정에서 40~60℃에서 30초~3분간 반응시킨 다음, 반응 온도가 40℃ 미만이라면 충분히 원하는 서열이 증폭되지 않아 시료 내 산동삼면의 존재를 검출할 수 없게 되며, 60℃를 초과하면 과도한 증폭이 일어날 수 있다. 또한, 마지막 사이클에서 68℃, 1분 미만의 반응시간에서는 원하는 서열의 신장이 충분히 이루어지지 않으며, 75℃, 10분 초과인 경우에는 과도한 서열의 신장이 발생할 수 있다. 따라서, 상기 조건은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 혼재된 DNA 속에서 산동삼면을 증폭하여 진단, 검출하기 위한 최적의 조건인 것이다. 상기 수치 범위를 벗어나는 경우, 시료 내 산동삼면의 증폭이 원활하게 이루어지지 않아, 산동삼면의 존재를 진단하는데 어려움이 있을 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 본 발명에 따른 산동삼면 검출용 조성물의 제작]

산동삼면을 포함한 5개의 고유종 및 34개 품종의 염기서열을 분석하고, 그 중 산동삼면이 사이토크롬산화효소 Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ) 유전자 내 2536번째 염기서열이 아데닌(adenine)에서 구아닌(guanine)으로 변이된 것을 확인하고, 이를 기반으로 프라이머 세트를 제작하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다. 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1에 해당하는 사이토크롬산화효소 Ⅰ(cytochrome oxidase Ⅰ) 유전자 내 2391~2654bp(274bp)를 증폭한다.

Primer name	Sequence (5'→3')	서열번호
SD_SNP1-F	GATATTGATACACGAGCAT	2
SD_SNP1-R	TGTAAATAAAGGATATCAG	3

[ 실험예 1: 본 발명 프라이머 세트의 특이도 검증]

본 발명 프라이머의 특이도를 검증하기 위하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였고, 제한 조작길이 다형성(restinction fragment length polymorphism; RFLP)기법을 수행하였다. PCR 수행을 위한 반응 조건은 하기 표 2에 나타내었다. 또한, 제한 조작길이 다형성(RFLP)을 수행하기 위하여 제한효소는 HpaⅠ를 이용하였고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 제한효소 처리를 위한 조성은 하기 표 3에 나타내었고, 염기서열 분석결과를 도 1에 나타내었다.

실험에 사용된 누에 품종은 총 39종으로, 구체적으로 삼동삼면, Jam123, Jam124, Jam125, Jam126, Jam140, Jam143, Jam144, Jam145, Jam149, Jam150, Jam151, Jam152, Jam153, Jam154, Jam155, Jam156, Jam157, Jam158, Jam159, Jam160, Jam161, Jam162, Jam307, Jam311, Jam312, Jam313, Jam314, Jam315, Jam316, Jam317, Jam318, Jam319, Jam320, Jam321, 고려삼면, 삼면홍회백, 한삼면, 선7호가 이용되었다.

Temp. (℃)	Time	Cycle
94	4 min	1
94	1 min	35
50	1 min
72	1 min
72	7 min	1

PCR 정제 산물	10㎕
Distilled water	7㎕
1X EzBuffer Ⅳ	2㎕
제한효소(HpaⅠ)	1㎕
Total	20㎕

제한 조작길이 다형성(RFLP) 수행 후, 산물은 전기영동을 통해 확인하였다. 전기영동은 1× TBE 버퍼(buffer)를 사용하여 2% 아가로오스 겔(agarose gel)을 제작하여 사용하였고, 100V에서 25분 동안 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 2 내지 6에 나타난 바와 같이, 274bp의 크기를 보이는 다른 종과 달리, 산동삼면은 제한효소 처리 후 예상 크기인 167bp 및 145bp에 해당하는 크기를 보여 산동삼면만을 특이적으로 검출함을 확인하였다. 다만, 167bp 및 145bp은 조각의 크기가 약 20bp 밖에 차이가 나지 않아, 전기영동 결과상 두 조각의 분리는 육안으로 관찰이 불가능하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Bio marker composition for detection of Bombyx mori <130> RDA1.100P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 1 ttgtattttt attcacagta ggagggttaa caggtgtaat tttagccaat tcttctattg 60 60 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is forward primer for detection of Bombyx mori. This is named "SD_SNP1-F". <400> 2 gatattgata cacgagcat 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is reverse primer for detection of Bombyx mori. This is named "SD_SNP1-R". <400> 3 tgtaaataaa ggatatcag 19

Claims

서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 산동삼면 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커는,
서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기가 구아닌(guanine)인 것을 특징으로 하는 산동삼면 검출용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 26번째 염기의 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 산동삼면 검출용 조성물.
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 산동삼면 검출용 프라이머 세트.
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서열번호 2의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 산동삼면 검출용 키트.
서열번호 2의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 시료를 증폭하는 단계;를 포함하는 산동삼면 검출방법.
제7항에 있어서,
제한효소를 처리하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 산동삼면 검출방법.
제7항에 있어서,
상기 증폭은,
90~95℃에서 2~8분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하고,
순차적으로 90~95℃에서 30초~3분, 40~60℃에서 30초~3분, 65~80℃에서 30초~3분을 한 세트로 30~40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 68~75℃, 1~10분을 한 세트로 1~3 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것을 특징으로 하는 산동삼면 검출방법.