CN112094921B - 一种鉴定丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记及应用。所述分子标记为位于线粒体基因组14945bp处的SNP位点，其存在A/G多态性，当该位置碱基为A时，为竹丝鸡，当该位置碱基为G时，为丝羽乌骨鸡。利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对含有所述分子的基因片段进行扩增，然后用限制性内切酶HpaI酶切扩增产物，获得一条690bp扩增片段的为竹丝鸡，获得540bp和150bp两条扩增片段的为丝羽乌骨鸡。本方法操作简便，结果可靠。采用本发明的方法能够快速、准确鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡，该法易于操作，费用低，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种鉴定丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴定丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记及应用。
背景技术
丝羽乌骨鸡是我国最古老鸡品种之一，有史料记载可追溯到13世纪，也是我国少数被列为国际标准品种之一。丝羽乌骨鸡外貌与其他鸡种明显不同，具有“桑葚冠、樱头、绿耳、胡须、丝羽、五爪、毛脚、乌皮、乌骨和乌肉”等标准的“十全”特征，具有重要的的观赏功能。同时丝羽乌骨鸡还具有药用功能，是中医医治妇科病药“乌鸡白凤丸”的主要原料。
由于丝羽乌骨鸡生长速度很慢，90天只能达到1.0kg左右，每年产蛋不到100枚，因此相关产品价格很高。竹丝鸡是在丝羽乌骨鸡基础上，导入外血，进行杂交，培育而成，体型外貌与丝羽乌骨鸡相似，90天可达1.7kg以上，同时父母代母鸡产蛋也大大提高，66周龄产蛋，由纯种丝羽乌骨鸡100枚不到提高到180枚以上，因此苗鸡成本也大大降低。由于苗鸡成本和生长速度等优势，造成最终上市的竹丝鸡的价格要比丝羽乌骨鸡低很多。
丝羽乌骨鸡和竹丝鸡，虽然外形相似，品质还是存在一定的差异，一般消费者仅仅靠外观，难以分辨真假。“一种鉴定泰和乌骨鸡特异性的分子标记”(201610748925.3)，虽然可以区分丝羽乌骨鸡和其他非丝羽乌骨鸡，但是不能区分含有丝羽乌骨鸡血缘的竹丝鸡。因此亟需一种快速、准确而又易于操作的技术鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡，保证我国丝羽乌骨鸡行业有序、健康、稳定发展，满足人民多元化的家禽产品需求。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。由于SNP具有高密度性、兼容性好、通量高、速度快、成本低与表型性状关联度高等优点，因此作为一类农作物和家养动物的分子标记，SNP在品种DNA身份鉴定中得到了广泛的应用。迄今为止，未见利用SNP分子标记方法对丝羽乌骨鸡和竹丝鸡进行鉴定的研究报道。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术不足，提供一种鉴定丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记。
本发明的目的之二在于提供用于检测上述分子标记的引物。
本发明的目的之三在于提供上述分子标记的用途。
本发明的目的之四在于提供利用上述分子标记的检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡分子标记，所述分子标记为位于线粒体基因组14945bp处的SNP位点，其存在A/G多态性，当该位置碱基为A时，为竹丝鸡，当该位置碱基为G时，为丝羽乌骨鸡。
一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的方法，为提取待检测品种鸡(血液、鸡肉、羽毛、组织、鸡蛋等均可)基因组DNA，检测线粒体基因组14945bp处的碱基序列，当该位置碱基为A时，为竹丝鸡，当该位置碱基为G为丝羽乌骨鸡。
一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的方法，线粒体基因组14945bp处的碱基为G时，可以形成GTT/AAC的HpaI内切酶的酶切位点，碱基为A时ATTAAC无法被HpaI内切酶酶切。
本发明还提供一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记，通过引物对SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2扩增丝羽乌骨鸡和竹丝鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶HpaI酶切扩增产物，获得一条690bp扩增片段的为竹丝鸡，获得540bp和150bp两条扩增片段的为丝羽乌骨鸡。
本发明还提供一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记的引物对，其中：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-TAACCAAAATCTCAAC-3'
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-GATAGTAATACCTGCG-3'。
本发明还提供含有上述引物对的用于鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡基因型的试剂盒。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在筛选丝羽乌骨鸡中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在筛选竹丝鸡中的应用。
本发明还提供一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2扩增鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶HpaI酶切扩增产物，获得一条690bp扩增片段的为竹丝鸡，获得540bp和150bp两条扩增片段的为丝羽乌骨鸡。
在一种具体的实施方式中，本发明还提供丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的基因型快速鉴定方法，包括以下步骤:
1)提取待测鸡肉中的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板(上述一丝羽乌骨鸡和竹丝鸡)，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)步骤2)中PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL；
4)步骤2)中PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃60s)35循环，72℃10min；
5)用限制性内切酶HpaI酶切扩增产物，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果呈现2条带的为丝羽乌骨鸡，仅为1条带的为竹丝鸡。
6)步骤5)中酶切反应体系为：反应体系为PCR产物43μL，10×缓冲液5μL，HpaI酶(5U)2μL，将样品混合均匀后离心，置于PCR仪37℃孵育1h。
本发明待检测的丝羽乌骨鸡和竹丝鸡可以通过肉眼方法先与其他鸡的品种进行区分，然后通过本发明所述的方法进行丝羽乌骨鸡和竹丝鸡具体品种的鉴定。
有益效果：
本发明利用线粒体序列的差异鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡，优点在于能够快速、准确鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡，可用于市场上不同档次乌骨鸡的鉴别，打击以次充好的不良商家。并且该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
图1丝羽乌骨鸡和竹丝鸡分子鉴定PCR扩增片段电泳结果。
图2碱基突变位置处测序峰图。
图3 HpaI酶切后琼脂糖电泳结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1丝羽乌骨鸡和竹丝鸡分子检测方法的建立
1.1引物设计
申请人对丝羽乌骨鸡群体和竹丝鸡群体线粒体基因组进行全长测序，发现两个群体在14945bp处存在变异，设计引物扩增该候选位点。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-TAACCAAAATCTCAAC-3'
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-GATAGTAATACCTGCG-3'
1.2 PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃60s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
PCR产物经1.3％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。检测结果显示PCR产物均为特异的一条690bp的片段，将PCR产物送苏州金唯智生物有限公司测序，对测序序列进行比对筛选变异位点，在148bp处发现(A-G)变异位点，测序峰图见图2，其中上述扩增片段148bp处变异位点在鸡线粒体基因组上的位置是14945bp(参考序列为NC_007235)，并且仅当该位点碱基是G时，可以形成GTT/AAC的HpaI内切酶的酶切位点，为丝羽乌骨鸡；碱基为A时ATTAAC无法被HpaI内切酶酶切，为竹丝鸡。即丝羽乌骨鸡和竹丝鸡为单基因位点控制，可利用此处变异位点可以区分丝羽乌骨鸡和竹丝鸡。
由于线粒体基因组序列不发生同源重组，因此无杂合子基因型，该位点碱基是A时是无酶切位点的AA纯合型，该位点碱基是G时为有酶切位点的GG纯合型。用HpaI酶切上述PCR产物，反应体系为PCR产物43μL，10×缓冲液5μL，HpaI酶(5U)2μL将样品混合均匀后离心，置于PCR仪37℃孵育1h。反应结束后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。AA型电泳检测只有一条690bp的条带，GG型为有酶切位点的纯合型，电泳检测时有540bp和150bp的两条带，见结果如图3(其中1～3为丝羽乌骨鸡，4～6为竹丝鸡)。
实施例2
本实施例利用本发明所述的分子标记对丝羽乌骨鸡和竹丝鸡进行扩大群体验证。丝羽乌骨鸡来自国家级地方鸡种基因库(江苏)，竹丝鸡来自某大型养殖企业。每个品种30只，总数为60只。所述分子标记在丝羽乌骨鸡中全部为GG型，在竹丝鸡中全部为AA型。进一步验证了该处SNP位点能有效、可靠地鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡(如表1所示)。
表1是利用本发明的分子标记检测的丝羽乌骨鸡和竹丝鸡基因型分布情况。
Figure BDA0002706690020000041
同时在整个线粒体基因组中只发现了此1处SNP位点为丝羽乌骨鸡所独有，并且该位点位于线粒体基因组非高变区，能够稳定遗传。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种鉴定丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaccaaaat ctcaac 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatagtaata cctgcg 16

Claims (1)

1.一种鉴别丝羽乌骨鸡和竹丝鸡的方法，其特征在于，通过引物对SEQ ID NO.1/ SEQID NO.2扩增鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶HpaI酶切扩增产物，获得一条690 bp扩增片段的为竹丝鸡，获得540 bp和150 bp两条扩增片段的为丝羽乌骨鸡。
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