CN116426654B - 一种不同类型乌骨鸡分子生物学鉴定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种不同类型乌骨鸡分子生物学鉴定方法及应用，所述分子标记为丝羽乌骨鸡327bp或/和473bp品种优势等位基因，含有327bp或/和473bp的等位基因为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。本专利的方法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种不同类型乌骨鸡分子生物学鉴定方法及应用。
背景技术
丝羽乌骨鸡是我国最古老鸡品种之一，有史料记载可追溯到13世纪，也是我国少数被列为国际标准品种之一。丝羽乌骨鸡外貌与其他鸡种明显不同，具有“桑葚冠、樱头、绿耳、胡须、丝羽、五爪、毛脚、乌皮、乌骨和乌肉”等标准的“十全”特征，具有重要的的观赏功能。同时丝羽乌骨鸡还具有药用功能，是中医医治妇科病药“乌鸡白凤丸”的主要原料。
除了丝羽乌骨鸡品种，我国还有许多其他乌骨鸡品种，比如：东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和德化黑鸡等。近年由于受禽流感、COVID-19等的影响，多地纷纷取缔活禽交易。国家提出来了家禽业发展“规模养殖、集中屠宰、冷链运输、冷鲜上市”的16字方针，屠宰之前丝羽乌骨鸡可以通过外观与其他品种进行区分。屠宰以后，其他乌骨鸡品种也可以假冒丝羽乌骨鸡。因此亟需一种快速、准确而又易于操作的技术鉴别丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡品种，保证乌骨鸡行业有序、健康、稳定发展，满足人民多元化的家禽产品需求。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术不足，提供一种不同类型乌骨鸡分子生物学鉴定方法。
本发明的目的之二在于提供用于检测上述分子标记的引物。
本发明的目的之三在于提供上述分子标记的用途。
本发明的目的之四在于提供利用上述分子标记的检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种鉴别丝羽乌骨鸡分子标记，所述分子标记为丝羽乌骨鸡327bp或/和473bp品种优势等位基因，含有327bp或/和473bp的等位基因为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。
本发明还提供一种鉴别丝羽乌骨鸡的分子标记的引物对，其中：
正向引物(SEQ ID NO.1)：5'-AGGGAAACACGCAGCAGAAC-3'
反向引物(SEQ ID NO.2)：5'-ATTCAGGCTCATTTTGAGGTG-3'。
一种鉴别丝羽乌骨鸡的方法，为提取待检测乌骨鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含有327bp或/和473bp的等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。
一种筛选丝羽乌骨鸡的方法，为提取待检测乌骨鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含有327bp或/和473bp的等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。
本发明还提供含有上述引物对的用于鉴别不同类型乌骨鸡基因型的试剂盒。
本发明还提供上述分子标记或引物或试剂盒对在鉴别或筛选丝羽乌骨鸡和其他品种乌骨鸡中的应用。
本发明还提供一种鉴别丝羽乌骨鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2扩增待检测乌骨鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，当含有327bp或/和473bp的等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。
本发明还提供一种筛选丝羽乌骨鸡的方法，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2扩增待检测乌骨鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，当含有327bp或/和473bp的等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。
在一种具体的实施方式中，本发明还提供更具体的丝羽乌骨鸡的鉴定方法，包括以下步骤:
1)提取待测乌骨鸡的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板(上述一丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡品种)，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)反应结束后，PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型分型，当含有327bp或/和473bp的等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327bp和473bp的等位基因为其他乌骨鸡品种。
本发明步骤2)中PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
本发明步骤2)中PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃60s)35循环，72℃10min。
本发明待检测品种鸡基因组DNA的提取可以采用常用方式进行提取待鉴定鸡的基因组DNA，提取位置可以为本领域常用的位置，例如包括但不限于鸡的血液、鸡肉、羽毛、组织或鸡蛋等。
本发明待检测的丝羽乌骨鸡和其他品种乌骨鸡可以通过含327bp或/和473bp等位基因有无进行区分，然后通过本发明所述的方法进行丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡具体品种的鉴定。
有益效果：
本发明利用等位基因的比例差异鉴别丝羽乌骨鸡和其他品种乌骨鸡，优点在于能够快速、准确鉴别丝羽乌骨鸡和和其他品种乌骨鸡，可用于市场上不同档次乌骨鸡的鉴别，打击以次充好的不良商家。并且该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
图1含327bp等位基因的个体峰图。
图2含473bp等位基因的个体峰图。
图3同时含327bp和473bp等位基因的个体峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡品种鉴定
1.1样品采集
丝羽乌骨鸡群体1(n＝30)、东乡绿壳蛋鸡(n＝30)来自国家级地方鸡种基因库(江苏)，丝羽乌骨鸡群体2(n＝42)样品来自江西省泰和县泰和鸡原种场，余干乌骨鸡样品(n＝36)来自江西上饶市余干乌骨鸡保种场，德化黑鸡(n＝45)来自福建省德化黑鸡保种场。
1.2PCR扩增
使用本发明设计引物扩增微卫星位点。
正向引物：5'-AGGGAAACACGCAGCAGAAC-3'；5'端加上FAM荧光标记。
反向引物：5'-ATTCAGGCTCATTTTGAGGTG-3'。
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s)35循环，72℃10min。
1.3毛细管电泳检测
反应结束后，PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型分型，不同基因型如图1-图3所示。
1.4等位基因统计
统计含的个体比例，纯种丝羽乌骨鸡含有327bp或473bp其中一种或者两种等位基因，其他乌骨鸡品种不含327bp和473bp等位基因，验证了本发明所述的标志物能够可靠地鉴别丝羽乌骨鸡和其他品种乌骨鸡(如表1所示)。
表1利用本发明的分子标记检测的丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡品种等位基因分布情况。
| 等位基因 | 丝羽乌骨鸡1 | 丝羽乌骨鸡2 | 东乡绿壳蛋鸡 | 余干乌骨鸡 | 德化黑鸡 |
| 只含327bp的个体 | 24 | 29 | 0 | 0 | 0 |
| 只含473bp的个体 | 2 | 4 | 0 | 0 | 0 |
| 同时含327bp和473bp的个体 | 4 | 9 | 0 | 0 | 0 |
| 不含327bp/473bp的个体 | 0 | 0 | 30 | 36 | 45 |
| 含327bp和/或473bp比例/％ | 100 | 100 | 0 | 0 | 0 |
注：毛细管电泳有“滑移”，1b属于正常误差范围，结果可能会出现328bp或474bp峰图，以327bp或473bp统计。
Claims (5)
1.一种鉴别丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡品种的方法，其特征在于，所述其他乌骨鸡品种为东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和德化黑鸡，所述方法在丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和德化黑鸡中进行鉴别，通过引物对SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2扩增待检测乌骨鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含有327 bp或/和473 bp等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327 bp和473 bp等位基因的为其他乌骨鸡品种。
2.一种筛选丝羽乌骨鸡和其他乌骨鸡品种的方法，其特征在于，所述其他乌骨鸡品种为东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和德化黑鸡，所述方法在丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、余干乌骨鸡和德化黑鸡中进行筛选，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增待检测乌骨鸡基因组DNA，用毛细管电泳检测等位基因，含有327 bp或/和473 bp等位基因的为丝羽乌骨鸡，不含327 bp和473 bp等位基因的为其他乌骨鸡品种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增的PCR反应体系为：2×PCRMix 25 μL，10 μmol/L正向和反向引物各1 μL，50-100 μg/ml模板DNA 2 μL，超纯水21 μL。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增的PCR反应程序为：
。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待检测乌骨鸡基因组DNA取自鸡的血液、鸡肉或羽毛。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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