CN115786539A

CN115786539A - 一种湘佳黑凤鸡tyr隐性白羽基因鉴定用引物及其鉴定方法

Info

Publication number: CN115786539A
Application number: CN202211515103.2A
Authority: CN
Inventors: 贺喜; 张海涵; 宋泽和; 杨文菊; 闫至垚; 肖健
Original assignee: Hunan Xiang Jia Husbandry Ltd By Share Ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Xiang Jia Husbandry Ltd By Share Ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-03-14

Abstract

一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物及其鉴定方法，其引物包括由上游引物F1、F2和下游引物R组成的2对引物，上游引物F1与下游引物R为TYR基因ALV插入序列引物，上游引物F2与下游引物R为TYR基因非插入序列引物，其中，上游引物F1、上游引物F2与下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示。该湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定方法，采用特定的引物对待测鸡血的DNA进行PCR扩增，再凝胶电泳并显影判断，进行快速判定待测物是含隐性白羽基因还是非隐性白羽基因。该鉴定方法可以快速、准确的鉴别湘佳黑凤鸡隐性白羽纯合和非隐性白羽纯合，同时验证了TYR基因隐性白羽基因型cc和非隐性白羽基因型CC能够作为湘佳黑凤鸡隐性白羽和非隐性白羽的有效分子遗传标记。

Description

一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及基因分子鉴定技术领域，尤其是涉及一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物及其鉴定方法。

背景技术

动物机体中的颜色来源基本为色素细胞，而色素细胞存在于动物的眼睛、皮肤、羽毛等组织器官中，这些颜色产生与基因有关。目前鸡白羽的产生主要有：红眼白、隐性白和常染色体白化这三种。隐性白羽基因aa定位在鸡的1号染色体上的酪氨酸酶基因(TYR)。TYR基因第4内含子上一段约7.7kb ALV病毒的插入导致TYR基因转录本缺少第5外显子编码的跨膜结构域，使得TYR基因失去正常功能活性，导致黑色素无法正常合成，从而产生隐性白羽。

隐性白羽鸡体质健壮，性情温顺。在生产中，隐性白羽鸡在优质鸡配套上的应用对我国优质鸡产业的发展起到了巨大的推动作用。但是通常对于TYR隐性白羽基因的鉴定有两种方法，一种是通过侧交判断，另一种是分子检测，现有的分子检测鉴定方法因鸡的品种和养殖环境不同存在较大差异，如CN 101696452 A公开的一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法、CN 108977550 A公开的一种鉴定香炉山鸡隐性白羽和有色羽纯合的引物及其应用、CN 110295237 A一种改进的鸡隐性白羽基因型的分子鉴定方法，上述方法中采用的引物各不相同，且有的提取鸡血的DNA，有的采用的是鸡全血。

湘佳黑凤鸡公鸡脖子背部羽毛、腹部羽毛黑色、尾巴羽毛七彩黑，油亮发光，母鸡羽毛全黑，带一点黑麻点，有部分颈部有麻色环圈，油亮发光，性成熟早、产能高。湘佳黑凤鸡是中国国家地理标志产品，其肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚，营养丰富，具有高蛋白、低脂肪、滋补性强的特点。为了更好的筛选品质优良的湘佳黑凤鸡，并加快实际生产中的育种进程，在现有技术的基础上研究一种适用于湘佳黑凤鸡的TYR隐性白羽基因用引物，并利用该引物对湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，具有显著意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种成本低、操作简易的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物，及利用该引物进行鉴定的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物，包括由上游引物F1、F2和下游引物R组成的2对引物，上游引物F1与下游引物R为TYR基因ALV插入序列引物，上游引物F2与下游引物R为TYR基因非插入序列引物，其中，上游引物F1、上游引物F2与下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示。

本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：

一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，包括以下步骤：

1)待测鸡血的DNA提取；

2)特异性PCR扩增：以待检测鸡血的基因组DNA为模板，采用湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物进行PCR扩增；

3)凝胶电泳并显影判断：琼脂糖凝胶/聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶在波长254nm的紫外灯下显影，得到电泳图谱，与Marker对比判断：电泳出现345bp的条带，则待测鸡的等位基因型为TYR基因突变型产物，隐性白羽；电泳出现481bp的条带，则待测鸡的等位基因型为TYR基因野生型产物，非隐性白羽。

步骤1)中，所述DNA的浓度大于10ng/l，且OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.7～2.0。提取的DNA浓度将会影响后续显影效果，如果DNA浓度小于10ng/l，在后续的PCR扩增中相应片段扩增效果不好，会出现误判的情况。

步骤1)中，待测鸡血的DNA提取的具体操作为：

(1)采用翅下静脉采血(2ml紫色真空采血管含EDTA)，直接匀浆，或将鸡全血于-20℃保存，使用时再鸡全血在冰上解冻，解冻后先匀浆；

(2)取10μl匀浆后的全血；

(3)加入180μl Buffer Digestion和20μl Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴40min(每10min颠倒混匀一次)至细胞完全裂解；

(4)加入60μl Buffer PR，充分颠倒混匀或涡旋振荡，-20℃冰箱放置5min；

(5)室温10000rmp离心两次，每次5min，将上清(约200μl)转移至新的1.5ml离心管中；

(6)加入等体积异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10000rmp离心5min，弃上清；

(7)加入1ml75％乙醇，颠倒漂洗1～3次，10000rmp离心2min，弃上清；

(8)重复上一步骤一次；

(9)开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发(若有挂壁则再次短暂离心，用移液枪移出残液，并开盖室温放置至残留乙醇完全挥发)；

(10)得到的DNA用50μl TE Buffer溶解，可用涡旋振荡，并用EppendorfBioSpectrometer紫外分光光度计检测提取的DNA样品，确定其浓度大于10ng/l。

所述鸡血的DNA提取还可以采用常规的苯酚-氯仿粗提法/CTAB法提取。

在某一示范实施例中，步骤2)中，PCR扩增采用的PCR反应体系为：每50μl体系中，含Template 4μl，上下游引物各2μl，2×MasterMix 25μl和ddH2O17μl。

在某一示范实施例中，步骤2)中，PCR扩增的条件为:94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸500-2000bp/min，30个循环；72℃延伸5min。

步骤1)中，所述鸡血为翅下静脉血。

步骤3)中，所述琼脂糖凝胶电泳的具体操作为：

(1)制胶：1.5％的琼脂糖凝胶80ml；

(2)上样：按照Marker、待测隐性白羽DNA、待测非隐性白羽DNA的顺序，取5μL PCR产物进行加样；

(3)电泳：琼脂糖凝胶120V电泳15min。

本发明一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物及其鉴定方法的有益效果：

本发明通过引物设计合成的2对3条引物进行多重PCR扩增，对TYR基因白羽等位基因与非隐性白羽等位基因进行扩增，从实验中得到鸡TYR基因隐性白羽纯合与非隐性白羽纯合，并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物进行鉴定待测鸡TYR基因隐性白羽纯合和非隐性白羽纯合。本申请设计的鉴定引物具有独立的特性，与现有技术中其他用于鸡隐性白羽鉴定的分子引物不同，且能对TYR基因进行有效识别，该鉴定方法可以快速、准确的鉴别湘佳黑凤鸡隐性白羽纯合和非隐性白羽纯合。因此，TYR基因隐性白羽基因型cc和非隐性白羽基因型CC能够作为湘佳黑凤鸡隐性白羽和非隐性白羽的有效分子遗传标记，能有效促进湘佳黑凤鸡优良品种的选育。

附图说明

图1—为实施例1中一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定方法得到的琼脂糖凝胶电泳图；

图2—为实施例2中一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物方法得到的琼脂糖凝胶电泳图(一)；

图3—为实施例2中一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物方法得到的琼脂糖凝胶电泳图(二)。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明，需要理解的是，本发明并不仅仅局限于下述实施例。

实施例1

参照图1，本实施例一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，包括以下步骤：

1)湘佳黑凤鸡血液收集：(1)采集湖南湘佳牧业股份有限公司养鸡场养殖的湘佳黑凤鸡隐性白和湘佳黑凤鸡样品各4只，翅下静脉采血(2ml紫色真空采血管含EDTA)，于-20℃保存；

(2)，使用时再鸡全血在冰上解冻，解冻后先匀浆，再取10μl匀浆后的全血；

(8)重复上一步骤一次；

(10)得到的DNA用50μl TE Buffer溶解，可用涡旋振荡，并用EppendorfBioSpectrometer紫外分光光度计检测提取的DNA样品，确定其浓度大于10ng/，备用；

2)特异性PCR扩增：

(1)引物设计及稀释：引物设计如下所示，并用ddH₂O稀释至10μM；

上游引物：F1 5'AGTCGTCTGGCTCTATTCGACTACAC

F2 5'TAGCAATACCATAAATAGCACTGGTAA

下游引物：R 5'ATGTTGAGATACTCGAGGTCATTAGAA

(2)配制50l PCR反应体系：PCR反应体系的具体成分与组成如下表所示。

试剂	浓度/用量
		Template	4μl
Primer1(10μM)	2μl
		Primer2(10μM)	2μl
2×MasterMix	25μl
		ddH2O	17μl

(3)将上述试剂加入PCR管中，涡旋振荡30s混匀，放置在Applied Biosystems PCR仪中按照下表所示的循环程序进行实时荧光PCR检测：PCR检测操作如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸500-2000bp/min，30个循环；72℃延伸5min；反应结束后，可将反应产物存于4℃冰箱保存。

3)凝胶电泳并显影判断：

(1)制胶：1.5％的琼脂糖凝胶80ml；

(2)上样：按照Marker、待测隐性白羽DNA、非隐性白羽DNA的顺序，取5lPCR产物进行加样；

(3)电泳：琼脂糖凝胶120V电泳15min。

(4)紫外显影：在波长254nm的长波长紫外灯下观察、拍照显影，得到电泳图谱，如图1所示；

(5)判断：与Marker对比判断：待测样品1-4的电泳明显出现345bp的条带，即，待测样品1-4的等位基因型为TYR基因突变型产物，隐性白羽；黑羽样品5-8的电泳明显出现481bp的条带，即，黑羽样品5-8的等位基因型为TYR基因野生型产物，非隐性白羽。

实施例2

参照图2，本实施例的一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定方法，与实施例1相比，存在以下不同：

步骤1)中，采集湖南湘佳牧业股份有限公司养鸡场养殖的湘佳黑凤鸡隐性白21只(对应样品1～21、25～45)和湘佳黑凤鸡样品3只(对应样品22～24、46～48)。

步骤3)中，

(4)紫外显影：在波长254nm的长波长紫外灯下观察、拍照显影，得到电泳图谱，如图2和3所示；

(5)判断：与Marker对比判断：待测样品1-21和待测样品25-45的电泳明显出现345bp的条带，即，湘佳黑凤鸡隐性白样品1-21和25-45的等位基因型为TYR基因突变型产物，隐性白羽；湘佳黑凤鸡样品25-28和46-48的电泳明显出现481bp的条带，即，黑羽样品25-28和46-48的等位基因型为TYR基因野生型产物，非隐性白羽。

由上可知，本发明的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法所设计的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定引物能有效对湘佳黑凤鸡中的TYR基因进行分子检测，进而便于快速鉴定鸡场中湘佳黑凤鸡的白羽基因是隐性还是非隐性，便于后续优良品种的选育。

在本发明的描述中，需要理解的是，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

Claims

1.一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物，其特征在于，包括由上游引物F1、F2和下游引物R组成的2对引物，上游引物F1与下游引物R为TYR基因ALV插入序列引物，上游引物F2与下游引物R为TYR基因非插入序列引物，其中，上游引物F1、上游引物F2与下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:3所示。

2.一种湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：

1)待测鸡血的DNA提取；

2)特异性PCR扩增：以待检测鸡血的基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因鉴定用引物进行PCR扩增；

3.如权利要求2所述的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，所述DNA的浓度大于10ng/l，且OD260/OD280值为1.7～2.0。

4.如权利要求3所述的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，其特征在于，步骤1)中，待测鸡血的DNA提取的具体操作为：

(2)取10μl匀浆后的全血；

(8)重复上一步骤一次；

5.如权利要求2或3所述的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增采用的PCR反应体系为：每50μl体系中，含Template 4μl，上下游引物各2μl，2×MasterMix 25μl和ddH2O 17μl。

6.如权利要求2或3所述的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增的条件为:94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸500-2000bp/min，30个循环；72℃延伸5min。

7.如权利要求2或3所述的湘佳黑凤鸡TYR隐性白羽基因的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述琼脂糖凝胶电泳的具体操作为：

(1)制胶：1.5％的琼脂糖凝胶80ml；

(3)电泳：琼脂糖凝胶120V电泳15min。