CN109371032B - 雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积pmel17基因及遗传标记方法 - Google Patents

雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积pmel17基因及遗传标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种跨膜转运糖蛋白pmel17基因及用作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的遗传标记，通过筛选雪峰乌骨鸡pmel17基因多态性，并测定了雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量，然后将pmel17基因多态性与黑色素性状关联分析，发现在雪峰乌骨鸡pmel17基因如序列表SEQ ID NO：1所示，在222bp处存一个在G/A碱基突变，GG基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量显著高于其他基因型。本发明为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的标记辅助选择提供了分子标记。

Description

雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积pmel17基因及遗传标记方法
技术领域
本发明属于雪峰乌骨鸡分子生物技术及育种领域，主要是测定与胸肌黑色素沉积相关的遗传标记，具体地说是，是测定pmel17基因中的多态性，即与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关前黑色素小体蛋白17(pmel17)基因的单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，缩写为SNP)的存在。
技术背景
雪峰乌骨鸡是湖南珍贵的地方乌骨鸡品种，其肉质鲜嫩，营养丰富，具有保健功效。乌骨鸡药用价值与黑色素相关，《本草纲目》就有“其颜色愈黑者，入药愈佳”的记载，消费者也更倾向选购乌色较深的乌鸡。而雪峰乌骨鸡机体黑色素沉积个体间差异较大，乌度不均一，常规选育进程缓慢。随着生物分子技术的发展，使得我们能够从DNA水平寻找与雪峰乌骨鸡黑色素沉积相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，提高选育效率，获得更大更快的育种进展效应和经济效益。
前黑素小体蛋白17(pre-melanosomal prtein17，pmel17)是一种在内质网中合成的Ⅰ型跨膜转运糖蛋白，被转运到黑素小体内，促进黑素小体结构的形成，保障黑色素的顺利合成。人类白癜风患者机体存在自身pmel17抗体，导致pmel17功能失常，阻碍了黑素小体的形成，从而影响黑色素形成。研究发现小鼠pmel17基因一个终止密码子突变，以及一个单核苷酸插入造成额外12个氨基酸的突变都可产生银色毛表现型。马pmel17基因p.Arg618Cys突变也可产生银色毛表型；鸡pmel17基因包含了11个外显子和10个内含子，鸡pmel17基因p.R618C突变产生红褐色羽毛表型，第10外显子一个9bp插入点产生显性白色羽毛表型。由此可见pmel17基因功能与黑色素沉积密切相关。
雪峰乌骨鸡DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，关于雪峰乌骨鸡黑色素沉积相关的遗传标记尚未见报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，提供一种pmel17基因及其作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状遗传标记的用途；同时筛选与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在雪峰乌骨鸡标记辅助选择中的应用。
本发明实施例是这样实现的，一种pmel17基因，所述基因为与表示雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关的基因。
进一步，所述基因pmel17序列第222bp有一处碱基突变G→A。
进一步，克隆包括pmel17基因外显子2至外显子6全部序列所用引物如下：
正向引物：5’-ATCGCATCCCCGTCCCTTATC-3’
反向引物：5’-GGACCCAACCATCCCCTTGC-3’
本发明实施例的另一目的在于提供一种用pmel17基因作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关遗传标记的方法，该包括如下步骤：
(1)根据GenBank中鸡pmel17基因的序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列；
(2)以上述雪峰乌骨鸡基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(3)鉴定该基因上述所得序列第222bp处是否存在多态性。
进一步，所述方法选择雪峰乌骨鸡作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关基因，其步骤如下：
(1)选择相同批次健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验；
(2)根据pmel17基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；
(3)筛选与胸肌黑色素沉积相关的SNP。基因突变位点的测序峰图，如图1。
本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出pmel17基因为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积的相关基因，继而从雪峰乌骨鸡pmel17基因上筛选到与性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定pmel17基因为黑色素沉积相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的雪峰乌骨鸡pmel17基因的SNP可作为雪峰乌骨鸡辅助选择的遗传标记，从而培育出黑色素沉积更多，乌色更深的雪峰乌骨鸡，具有极其重大的应用价值和经济效益。
选择相同日龄的健康雪峰乌骨鸡100至200只进行饲养试验。对该些雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量进行测定，并从高黑色素含量和低黑色素含量样本中分别提取其基因组DNA。
根据GenBank中鸡pmel17基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列，引物序列为：5’-ATCGCATCCCCGTCCCTTATC-3’(正向)，5’-GGACCCAACCATCCCCTTGC-3’(反向)，用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组DNA进行扩增。
PCR：20μl反应体系：2×Master mix 12μl，上下游引物(10μmol/L))各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。
PCR扩增程序：95℃5分钟预变性后34个PCR循环参数为：95℃30秒，62.6℃30秒，72℃30秒，最后72℃5分钟。
取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，PCR产物的长度为1718bp。
取PCR扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了PCR产物是pmel17基因，序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。
上述实验结果表明，从雪峰乌骨鸡胸肌提取的黑色素性状相关基因为pmel17基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌黑色素沉积有关的SNP，证明这就是影响雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的遗传原因。
与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有关的SNP在生产实践中的验证
选择相同日龄及相同饲养管理条件的健康雪峰乌骨鸡40～80只进行饲养试验。所有供试雪峰乌骨鸡于120日龄进行屠宰，测定胸肌黑色素含量。
用提取的雪峰乌骨鸡胸肌组织样基因组DNA，根据GenBank中鸡pmel17基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列，引物序列为：
5’-ATCGCATCCCCGTCCCTTATC-3’(正向)，5’-GGACCCAACCATCCCCTTGC
Figure BDA0001877385690000032
3’(反向)，用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组DNA进行扩增，然后检测其SNP。
1、PCR
PCR反应体系如下表所示：
表1PCR反应体系
Figure BDA0001877385690000031
PCR循环参数如下：
34个循环：95℃，5min；95℃，30s；62.6℃，30s，72℃，30s；72℃，5min
2、pmel17基因SNP位点基因型频率分析
通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于Hardy-Weinberg平衡中(P>0.05)。
表2SNP位点基因型和基因频率
Figure BDA0001877385690000041
3、pmel17基因与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的相关分析
分析不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的影响，结果见表3，从下表3中可见：不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有显著影响；其中GG基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量高GA型个体107.24％，差异达到极显著水平(P<0.01)。
表3不同基因型胸肌黑色素含量比较
Figure BDA0001877385690000042
注：同一列肩注不同大写字母为差异极显著(P＜0.01)。
附图说明：
图1为pmel17基因突变位点的测序峰图
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1雪峰乌骨鸡相关基因SNP筛选
选择相同日龄的健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验。对该些雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量进行测定，并从高黑色素含量和低黑色素含量样本中分别提取其基因组DNA。
根据GenBank中鸡pmel17基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列，引物序列为：5’-ATCGCATCCCCGTCCCTTATC-3’(正向)，
5’-GGACCCAACCATCCCCTTGC-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组DNA进行扩增。
PCR：20μl反应体系：2×Master mix 12μl，上下游引物(10μmol/L))各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。
PCR扩增程序：95℃5分钟预变性后34个PCR循环参数为：95℃30秒，62.6℃30秒，72℃30秒，最后72℃5分钟。
取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，PCR产物的长度为1718bp。
取PCR扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了PCR产物是pmel17基因，序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。
上述实验结果表明，从雪峰乌骨鸡胸肌提取的黑色素性状相关基因为pmel17基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌黑色素沉积有关的SNP，证明这就是影响雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的遗传原因。
实施例2与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有关的SNP在生产实践中的验证
选择相同日龄及相同饲养管理条件的健康雪峰乌骨鸡44只进行饲养试验。所有供试雪峰乌骨鸡于120日龄进行屠宰，测定胸肌黑色素含量。
用提取的44只雪峰乌骨鸡胸肌组织样基因组DNA，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其SNP。
2、PCR
PCR反应体系如下表所示：
表1PCR反应体系
Figure BDA0001877385690000051
PCR循环参数如下：
34个循环：95℃，5min；95℃，30s；62.6℃，30s，72℃，30s；72℃，5min
2、pmel17基因SNP位点基因型频率分析
通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于Hardy-Weinberg平衡中(P>0.05)。
表2SNP位点基因型和基因频率
Figure BDA0001877385690000052
Figure BDA0001877385690000061
3、pmel17基因与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的相关分析
分析不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的影响，结果见表3，从下表3中可见：不同SNP基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有显著影响；其中GG基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量高GA型个体107.24％，差异达到极显著水平(P<0.01)。
表3不同基因型胸肌黑色素含量比较
Figure BDA0001877385690000062
注：同一列肩注不同大写字母为差异极显著(P＜0.01)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积pmel17基因及遗传标记方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> 鸡(chicken)
<220>
<221> mutation
<222> (222)
<223> r＝g或a
<400> 1
tgctgacgtc cccgtgtccc catgctgatg atgtccccac gtcccccaga ccaggtgccc 60
attgcggtgg atgtgacaca gctggaggtg gcagcggggg acggcgggag cttcgtgcgc 120
aaccgccccg tggccttcaa cgtgaggctg cacgacccca gccattacct gcgtgatgct 180
gacatctcct attcgtggga cttcggggac cggagcggca crctcatctc ccgcagcccc 240
accgtcaccc acacctacct gcaggctggt tcctttgctg cccgcctggt gctgcaggca 300
gccatcccgc tcagctcctg cggcacctcc gcaccccctg ttgtggaccc caccactggg 360
ccggtgccct ccttgggacc cacggccaca cagcctgtgg gacccaccgg atccggcact 420
gccatggcac ccagcaacct cacgggatcc ggtactgctg cagcacccgg aaccactgca 480
gcacccagag cctccggggc accagcagaa cccacggggg tctcagtggc tgtgctatca 540
gacagcgctg ccactgagcc cctccc 566

Claims (2)

1.一种SNP分子标记在检测雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记在SEQ ID NO.1所示序列的第222位bp处有G→A的突变，该SNP分子标记可通过如下引物扩增得到：正向引物：5’-ATCGCATCCCCGTCCCTTATC-3’，反向引物：5’-GGACCCAACCATCCCCTTGC-3’。
2.一种检测雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测雪峰乌骨鸡胸肌组织样的基因组DNA；
2)以待测雪峰乌骨鸡胸肌组织样的基因组DNA为模板，利用正向引物：5’-ATCGCATCCCCGTCCCTTATC-3’和反向引物：5’-GGACCCAACCATCCCCTTGC-3’进行PCR扩增；
3)检测PCR扩增产物第222bp处是否存在突变，若基因型为GG，则判定待测雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量高，若基因型为GA，则判定待测雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量低。
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