KR100367123B1

KR100367123B1 - 피씨알-알에프엘피 유전자-이용 한우육 판별방법

Info

Publication number: KR100367123B1
Application number: KR10-2000-0034292A
Authority: KR
Inventors: 정의룡; 김우태; 김연수
Original assignee: 정의룡
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2003-01-09
Also published as: KR20020000091A

Abstract

본 발명은 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 모색관련 MC1-R 유전자의 돌연변이 영역을 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 기술로 증폭시킨 후 PCR 증폭산물(739bp)을 Bse 118 I 또는 Msp I으로 절단하고, 전기영동법으로 품종 특이적인 RFLP 유전자형의 DNA 밴드를 검출하여 소의 품종을 확인할 수 있는 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면 종래의 RAPD 또는 SCAR 표지를 이용한 한우 품종 판별 기술에 비하여 훨씬 안정적이고 100%에 가까운 재현성과 정확성을 보장할 수 있을 뿐만 아니라, 신속 간편하여 효율성과 실용성을 극대화할 수 있는 효과가 있다.

Description

피씨알-알에프엘피 유전자-이용 한우육 판별방법{Method of Detecting Korean Cattle Meat Based on PCR-RFLP}

본 발명은 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 모색관련 MC1-R 유전자의 돌연변이 영역을 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 기술로 증폭시킨 후 PCR 증폭산물(739bp)을 Bse 118 I 또는 Msp I으로 절단하고, 전기영동법으로 품종 특이적인 RFLP 유전자형의 DNA 밴드를 검출하여 소의 품종을 확인할 수 있는 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법에 관한 것이다.

일반적으로, 소의 품종구별은 외형적 특징인 모색이나 체형 등에 의존하는 것이 현재의 유일한 방법이지만 표현형으로 구별되는 소 품종이라 할지라도 도축하여 쇠고기 형태로 전환되면 소 품종 식별은 거의 불가능하게 된다. 특히, 국민소득 증대와 식생활 개선으로 쇠고기 수요가 양적으로 급증할 뿐만 아니라 최근에는 질적으로 우수한 고품질 쇠고기를 선호하는 경향을 보이고 있으며, 한 예로 한우육의 경우 유통과정에서 수입육과 국내산 젖소육이 한우고기로 둔갑 판매되는 부정육 유통 부조리 사례가 성행하여 소비자 및 양축농가의 막대한 손실과 피해는 물론 한우 산업의 경쟁력을 약화시키는 원인으로 지적되어 왔다. 게다가, UR 협상 타결 이후 지난 95년부터 외국산 수입쇠고기가 국내시장에 진출한 이래 매년 그 수입물량이 지속적으로 확대되어가고 있으며, 다가오는 2001년에는 쇠고기 수입 전면 개방화가 이루어질 예정이다. 따라서, 축산물 수입개방에 대비한 우리나라 한우산업의 국제 경쟁력 강화 및 고품질 한우고기 생산을 유도하기 위해서는 수입쇠고기 또는 국내산 젖소고기와의 차별화 전략이 매우 중요하며, 이들간을 명확히 구별할 수 있는 한우육 판별 기술 개발은 한우 둔갑육 유통을 근본적으로 차단하고 한우 사육농가 및 쇠고기 시장보호를 위해 반드시 해결해야 할 과제이다.

그동안 축육자원의 축종판별을 위한 기술로서 면역 효소 측정법(ELISA)(Patterson 등, 1984; Jones 와 Patterson, 1985)과 등전점 전기영동법(IEF)(King과 Kurth, 1982) 등이 비교적 정확도가 높은 방법으로 사용되어져 왔다. 이들 면역학적 및 전기영동 방법은 축종간에 단백질 조성 및 구조의 차이에 따른 종 특이적 단백질(species-specific protein)을 검출함으로써 축종식별이 가능하였다. 그러나, 종 특이적 단백질은 종내에서는 동일하기 때문에 동종내 품종간의 판별에 이용은 사실상 불가능하다.

최근에 분자 유전학 및 유전자 분석기술의 발달로 DNA 분자수준에서 종 특이적인 DNA 염기서열 차이에 따른 축종 판별은 물론 동종내 품종판별의 가능성이 제기되었다. 특히, PCR을 이용하는 DNA 다형 분석기법으로서 RAPD(random amplified polymorphic DNA)기법은 random primer를 사용하여 genome 내 DNA 염기서열 부위를 임의로 증폭시켜 품종 특이적인 DNA 표지인자를 탐색하는 기술(Williams 등, 1990; Welsh와 McClelland, 1990)로서 각종 동물의 유전분석 및 종 또는 품종식별에 폭 넓게 응용되어 왔다(Kemp와 Teale, 1994; Bailey와 Lear, 1994; Gwakisa 등, 1994; Appa Rao 등, 1996; Cushwa와 Medrano, 1996; Smith 등, 1996). 국내의 경우도 그동안 우리나라 고유의 유전자원인 한우를 타품종과 식별하기 위하여 RAPD 기법을 이용한 한우 품종판별에 관한 연구가 여러 연구자들에 의해 수행되었다. 이 등(1994)과 조와 한(1994)은 한우 품종에 특이적인 RAPD 표지를 각각 보고한 바 있고, 그 후 민 등(1995, 1996)은 쇠고기 품종구별 및 각종 육류의 축종판별에 RAPD를 이용하였고, 정 등(1995)도 한우와 구별될 수 있는 홀스타인 젖소품종의 특이적인 RAPD 표지를 검출한 바 있다. 그러나, 이 RAPD 기법은 10bp의 짧은 RAPD 표지를 사용하기 때문에 기술의 특성상 실험자, 시료 DNA, PCR 반응액 조성, PCR 증폭조건(반응온도 및 cycle 수)등 많은 실험요인에 대한 민감성이 매우 높고 결과의 재현성과 정확성에 대한 신뢰도가 낮기 때문에(Yu와 Pauls, 1992; Ellsworth 등, 1993; MacPherson 등, 1993; Meunier와 Grimont 등, 1993) 실용화에는 문제점이 많은 것으로 지적되어 왔다. 최근에는 RAPD 표지의 재현성을 개선하고자 RAPD 프라이머의 염기서열을 일부 신장시킨 SCAR(sequence characterized amplified regions) primer의 제작을 통하여 한우육 판별을 시도한 바 있다(홍 등, 1998). 그러나, 이 SCAR 표지를 이용하는 방법 또한 10bp의 RAPD 프라이머보다 긴 약 20bp 프라이머를 사용하므로써 RAPD 표지에 비해 재현성을 개선할 수 있으나, 이 방법 역시 기본적으로 PCR-RAPD 기술을 이용하는 것으로 아직까지 한우고기 판별용 SCAR 표지에 대한 충분한 연구와 검증이 이루어지지 않은 상태로서 실용화에는 이르지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 이상에서와 같은 RAPD 표지 또는 SCAR 표지를 이용한 분자 유전학 및 유전자 분석 품종 판별 기술은 PCR 증폭조건에 대한 민감성이 매우 높고 분석결과의 재현성과 정확성에 대한 신뢰도가 낮아 실제의 검사 업무 수행 등 실용화에 문제점이 많은 것으로 지적되어 이에 대한 개선의 필요성이 절실히 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 예의 연구노력한 결과, 모색관련 MC1-R 유전자의 돌연변이 영역을 특이적 푸라이머를 이용하여PCR 기술로 증폭시킨 후 PCR 증폭산물(739bp)을 Bse 118 I 또는 Msp I으로 절단하고 전기영동법으로 품종 특이적인 RFLP 유전자형을 확인하여 한우육과 국내산 젖소고기 및 수입육을 판별함으로써, 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머에 의해 증폭된 MC1-R 유전자 산물에 Base118 I 또는 Msp I의 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법을 제공하는 것이다.

도 1은 PCR-RFLP 기법을 이용한 한우육 감별기술의 체계도를 나타낸 것이다.

도 2는 PCR-RFLP 기법에 의한 한우육 판별기술의 개요를 나타낸 것이다.

도 3은 PCR 시험용 소 MC1-R 유전자의 증폭된 부위조각의 좌위를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 4는 제한효소 Bse118 I를 처리한 PCR 산물을 13% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)상에서 전기영동한 후의 MC1-R 유전자의 RFLP 형태를 나타낸 것이다.

도 5는 제한효소 Msp I를 처리한 PCR 산물을 2% 아가로스겔(agarose gel)(A) 및 13% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)(B)상에서 전기영동한 후의 MC1-R 유전자의 RFLP 형태를 나타낸 것이다.

도 6은 한우, 홀스타인 및 앵거스 종의 MC1-R 유전자형에서의 돌연변이 및 아미노산서열을 나타낸다.

이하, 본 발명의 PCR-RFLP 유전-이용 한우육 판별방법에 대하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

포유동물의 프로피오멜라노코틴(proopiomelanocortin)으로부터 유도된 멜라노코틴(melanocortin; MC)은 부신피질 세포에서 스테로이드 합성을 자극하는 아드레노코르티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone; ACTH)과 멜라닌 세포에서 멜라닌(melanin) 형성에 관여하는 멜라닌세포-자극호르몬(melanocyte-stimulating hormone; MSH)으로 구성되어 있으며, 기능 및 생리적 활성도에 따라 5가지(MC1 ∼ MC5) 서브형태로 분류된다(Takeuchi와 Takahashi, 1998). 특히, 멜라닌세포-자극호르몬 수용체(melanocyte-stimulating hormone receptor; MSHR) 또는 멜라노코틴 1 수용체(melanocortin 1 receptor; MC1 R)는 멜라닌의 확산 및 합성을 자극하는 호르몬 수용체로서 멜라닌 세포 내에 두 종류의 색소 즉, 적색에 관여하는 페오멜라닌(phaeomelanin)과 갈색 또는 흑색에 관여하는 유멜라닌(eumelanin)의 색소합성 조절에 중요한 역할을 담당한다(Cone 등, 1996;Vage 등, 1999). 체내에서 멜라닌형성은 타이로시나제(tyrosinase) 효소농도에 따라 페오멜라닌(phaeomelanin)과 유멜라닌(eumelanin) 생성이 달리 발현되며 타이로시나제(tyrosinase) 활성은 확장(extension; E) 좌위를 지정하는 α-MSH와 MC1-R에 의해 조절된다(Klungland 등, 1995; Cone 등, 1996). 포유동물에서 MC1-R 돌연변이가 모색변이를 일으킨다는 사실이 규명됨에 따라 색소합성에 관여하는 MC1-R 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 방법으로 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석방법을 이용하여 소(Klungland 등, 1995), 말(Marklund 등, 1996), 돼지(Kijas 등, 1998) 및 면양(Vage 등, 1999) 등의 축종을 대상으로 모색변이에 관한 연구가 진행되어 왔다.

이에, 본 발명은 RAPD 또는 SCAR 표지를 이용하는 기존의 방법과는 달리 보다 정확하고 재현성있는 한우육 판별기술을 개발하고자 축우의 모색발현에 관여하는 MC1-R 유전자의 RFLP 표지를 이용하여 한우육을 국내산 젖소육 및 수입우육과 판별하기 위하여 축우의 모색발현을 조절하는 MC1-R 유전자를 이용한 한우육 판별기술을 개발하고자 PCR-RFLP 기법으로 MC1-R 좌위의 대립유전자를 검출하고 각 품종간 RFLP 유전자형 빈도와 MC1-R 유전자의 염기서열상의 구조적 차이를 비교 분석한다. 즉, 다음 도 1에 요약한 바와 같이, 한우와 홀스타인 종 젖소 그리고 수입육우 3품종[앵거스(Angus), 헤레폴드(Hereford) 및 샤롤레스(Charolais)]의 근육조직과 혈액에서 게놈 DNA를 분리한 후 MC1-R 유전자의 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 후, 증폭산물을 Bse118 I 또는 Msp I 제한효소를 이용하여 절단하고 전기영동법으로 RFLP 유전자형을 검출한다. 그 결과, MC1-R 유전자 좌위는 E와 e 두 개의 대립유전자에 의해 지배되는 E/E, E/e 및 e/e 3종류의 유전자형이 검출되는데, 우선 Bse118 I 제한효소를 처리하는 경우 한우육은 739bp 크기의 단일 밴드만이 검출되고 홀스타인육과 앵거스 종에서는 531bp와 208bp 크기의 2개 밴드가 각각 검출되어 한우와 홀스타인 및 앵거스 두 품종간에 명확한 차이를 보이는 품종 특이적 RFLP 표지가 확인된다. 또한, Msp I 제한효소 처리에서도 한우육은 535와 174bp 크기의 2개 밴드가 검출되나 홀스타인과 앵거스 종은 328, 207 및 174bp 크기의 3개 밴드가 검출되어 한우와 홀스타인 및 앵거스 종간의 RFLP 밴드 양상에 확실한 차이가 있다. MC1-R의 RFLP 유전자형 빈도에서 한우는 e/e형이 93%로 압도적으로 그 출현율이 높고, E/e 형은 7%로 출현빈도가 매우 낮으며, E/E형은 출현되지 않았다. 그러나, 홀스타인과 앵거스 종에서는 한우에서 전혀 검출되지 않은 E/E단일 유전자형만이 모두 검출되어 한우와 이들 두 품종간의 MC1-R 유전자형 출현빈도에 명백한 차이가 나타난다. 따라서, 한우에 존재하는 e/e형과 홀스타인 및 앵거스 종에서만 출현하는 E/E형의 대립유전자와 유전자형을 품종 특이적 DNA 표지인자로 이용하여 한우육과 젖소육 및 앵거스 종간의 판별이 가능하게 된다. 즉, 모색관련 MC1-R 유전자의 품종 특이적 PCR-RFLP 유전자형은 한우육과 국내산 홀스타인 종 젖소육 및 앵거스 종 수입육을 식별하는데 매우 유용한 DNA 표지로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

(1) 준비재료

본 연구에 사용된 공시재료는 가락동 축협 직판장과 횡성 도축장에서 한우 60개체와 젖소 30개체로부터 각각 정육시료를 채취하였다. 또한, 축산기술연구소 대관령지소에서 사육되고 있는 한우 70두와 수입육우로서 앵거스(Angus), 헤레폴드(Hereford) 및 샤롤레스(Charolais) 3품종 각 20두 그리고 일반 목장에서 사육 관리되고 있는 홀스타인(Holstein) 종 젖소 50두를 임의로 선정하여 이들 각 공시축으로부터 혈액시료를 채취하였다.

(2) 게놈(Genomic) DNA의 분리 및 정제

혈액(5ml)과 근육조직(10g)으로부터 게놈 DNA의 추출 및 정제는 밀러[Miller 등(1989)]의 방법을 일부 보완하여 실시한 후 수집된 DNA는 TE 버퍼(10mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA)에 용해하였다. 추출한 DNA 농도는 스펙트로포토메터(spectrophotometor)로 260nm의 UV 흡착에 의해 측정하여 확인하였다.

(3) MC1-R 프라이머의 설계 및 합성

MC1-R 유전자는 GenBank(S71017)에 등록된 소 G 단백질-쌍 수용체[bovine G protein-coupled receptor(BDF3; Vanetti et al., 1994)]를 지정하는 cDNA 영역의E-좌위가 포함된 228에서 966번째 염기서열 부위의 739bp 단편을 증폭하기 위한 프라이머로서 순방향 프라이머는 5'-GTGCCTGGAGGTGTCCATC-3' 그리고 역방향 프라이머는 5'-GAAGTTCTTGAAGATGCAGCC-3'의 염기배열을 설계하여 합성하였으며, 다음 도 3에 요약하여 나타내었다.

(4) MC1-R 유전자의 PCR 증폭

MC1-R 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응조건은 진앰프 PCR 시스템 9600[GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer Cetus, USA)]을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, 반응액은 0.5㎖ 튜브에 주형(template) DNA 50-80ng, 프라이머 각 0.5μM, dNTP 각 200μM, 10×PCR 버퍼, 그리고 Taq DNA 중합효소 1 단위(unit)를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조정하였다. PCR 사이클은 최초 94℃에서 5분간 예비가열 후 94℃에서 1분, 63℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분간의 사이클을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료했다.

(5) 제한효소 처리에 의한 DNA 절단 및 전기영동

PCR 종료 후 MC1-R 유전자의 제한효소 처리는 5㎕의 증폭산물에 Bse118 I과 Msp I 2종류의 제한효소를 각각 이용하였다. 우선, 총 양(volume)을 15㎕로 조정한 후 Bse118 I 제한효소 처리는 65℃에서 3시간 이상 반응하여 절단했다. 그 결과는 다음 도 4에 나타내었으며, Bse118 I 제한효소(G/A CCGG T/C)로 절단하였을 때 인지부위에 따라 E/E유전자형은 531bp와 208bp의 2개 단편이 분리되었고 e/e 유전자형은 104번 아미노산을 결정하는 codon에서 G 단일 염기의 결실로 인하여 제한효소 인지부위가 소실되어 739bp의 단일 밴드만이 검출되었다. 그리고 E/e 헤테로형은 E와 e 대립유전자의 양쪽 밴드를 모두 공유하고 있는 739, 531 및 208bp 3개의 단편으로 분리되었다. 그리고, Msp I 제한효소로 절단하는 경우에는 우선, Msp I 제한효소를 37℃에서 3시간 이상 반응하여 절단했으며, 이때 얻어진 DNA 단편을 확인하기 위해 TBE 버퍼(90mM tris-borate, 2mM EDTA, pH 8.0)가 함유된 2% 아가로스 겔로 전기영동하여 분리한 후 ETBR 용액으로 염색하여 UV 상에 발현된 DNA 밴드를 검출하였다. 또한, 소량의 DNA 시료 분석과 저분자량의 DNA 밴드 검출을 목적으로 13% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 200V 정전압으로 약 4시간 이상 전기영동한 후 실버 염색(silver staining)으로 DNA 밴드를 발현시켜 각 시료별 유전자형을 판정하였으며, 그 결과는 다음 도 5에 나타내었다. 그 결과, 도 5에서와 같이 제한효소 인지부위의 수에 따라 E/E 호모형의 경우 이론적으로는 328, 207, 174, 18 및 12bp 크기의 5개 절편이 생성되나, 이 가운데 분자량이 매우 작은 18bp와 12bp 단편은 가시적으로 검출이 안되었고 328, 207 및 174bp 3개의 band만이 확인되었다. 한편, e/e 호모형에서도 104번 아미노산 영역의 제한효소 인지부위가 결여되어 535, 174, 18 및 12bp 4개 절편이 분리되었으나 분자량이 작은 18bp와 12bp 단편은 검출되지 않았다. 그리고 E/e 헤테로형에서는 535, 328, 207, 174, 18 및 12bp의 6개 절편이 이론적으로 분리가 가능하나 역시 18bp와 12bp를 제외한 4개의 절편이 확인되었다.

이상과 같이 Bse 118 I과 Msp I 2 종류의 제한효소를 이용하여 검출한MC1-R 유전자의 PCR-RFLP 유전자형은 한우육과 젖소육 및 수입육 육우 품종간에 비교한 결과 도 4에서 보는 바와 같이 Bse118 I 제한효소로 절단하였을 때 한우육은 739bp 크기의 단일 밴드만이 검출되었고, 홀스타인 육과 앵거스 종에서는 531bp와 208bp 크기의 2개 밴드가 각각 검출되어 한우와 홀스타인 및 앵거스 품종간에 명확한 차이를 보이는 품종 특이적인 RFLP 표지가 확인되었다. 또한, 도 5와 같이 Msp I 제한효소로 절단된 증폭산물에서도 한우육은 535와 174bp 크기의 2개 밴드가 검출되었으나 홀스타인과 앵거스 종은 328, 207 및 174bp 크기의 3개 밴드가 각각 검출되어 한우와 홀스타인 및 앵거스 종간에 확실한 차이를 보이는 품종 특이적인 RFLP 유전자형이 확인되었다.

(6) MC1-R 유전자의 사이클 시퀀싱(Cycle Sequencing)

한편, GenBank(S71017)에 등록된 소 염기서열을 기초로 하여 축우 품종간의 MC1-R 유전자 염기서열상의 구조적 차이를 비교 검토하기 위하여 ABI Prism^TMDNA 시퀀싱 키트(sequencing kit)를 사용하여 한우, 홀스타인 및 앵거스 종의 MC1-R 유전자 염기서열을 분석하였다. 즉, 정제된 PCR 산물 DNA 약 30ng에 터미네이터 레디 리액션 믹스(Terminator Ready Reaction Mix) 4㎕와 프라이머 3.0pmol을 첨가하여 총 10㎕로 조정한 후 95℃에서 30초, 50℃에서 15초, 60℃에서 4분간의 사이클을 총 25회 수행하였다. PCR 증폭 DNA의 염기서열 결정은 ABI Prism 310 (Perkin-Elmer Cetus, USA)의 DNA 시퀀서(sequencer)를 사용하여 분석하였고, 그 결과를 다음 도 6에 요약하여 나타내었다. 즉, 한우와 홀스타인 및 앵거스 종의MC1-R 유전자 염기서열을 비교한 결과 104번 아미노산을 결정하는 코돈에서 홀스타인과 앵거스 종은 GGT(Gly)의 염기서열로 이루어져 있으나, 한우는 GGTGTG로 두 번째 G 염기 하나가 결실됨으로써 GlyVal 아미노산으로 전환된 것을 확인하였다.이러한 한우와 홀스타인 및 앵거스 종간에 단일 염기서열 차이는 Bse118 I과 Msp I 제한효소의 염기서열상의 인지부위 차이를 가져와 RFLP 밴드의 발현 양상에 따른 품종간 구별이 가능한 것으로 해석되었다. 한편, 앵거스 종은 99번 염기서열에서 단일 염기의 치환(TC)으로 CTG(Leu)가 CCT(Pro)로 전환된 것으로 확인되었다.

(7) 품종별 인자형 구분

이상과 같은 각 품종별 RFLP 형태를 기초로 하여 한우 100두와 홀스타인 종 젖소 80두, 그리고 앵거스, 헤레폴드 및 샤롤레스 육우 3품종 각 20두를 대상으로 MC1-R 유전자 좌위의 RFLP 유전자형 출현빈도를 분석하였고, 그 결과는 다음 표 1에 요약하여 나타내었다.

한우, 홀스타인 및 수입소고기에서의 MC1-R 유전자 인자형 분포

종	샘플수	MCI-R 인자형(백분율)
종	샘플수	E/E	E/e	e/e
한우홀스타인앵거스헤레폴드샤롤레스	13080202020	80(1.00)^*20(1.00)	9(0.07)5(0.25)	121(0.93)15(0.75)20(1.00)
합계	270	100(0.37)	14(0.05)	156(0.58)

이상에서와 같이, 한우는 E/e와 e/e 2종류의 유전자형이 확인되었으나 e/e형이 전체의 93%로 매우 높은 출현율을 보인 반면 E/e 형은 7%로 출현빈도가 매우 낮았다. 또한, 헤레폴드(Hereford) 종에서도 한우와 마찬가지로 E/e와 e/e 두 종류의 유전자형이 검출되었으나, 이들의 출현율은 각각 25%와 75%로서 한우의 유전자형 출현율과 다소의 차이를 보였고, 샤롤레스(Charolais) 종은 분석한 전체두수 모두 e/e 유전자형만이 검출되었다. 그러나, 흑반점의 모색을 지닌 홀스타인(Holstein) 종과 전신 흑모 단일색의 앵거스(Angus) 종에서는 한우에는 존재하지 않는 E/E의 단일 유전자형만이 검출되어 한우의 유전자형 발현양상과 명백한 차이가 인정되었다. 따라서, 본 연구에서 개발한 품종 특이적인 MC1-R 유전자의 RFLP 유전자형은 한우육을 국내산 및 수입산 젖소고기와 앵거스 수입육을 감별하는데 유용한 DNA 표지로써 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법에 관한 것으로, 각 품종에 따라 MC1-R 유전자의 RFLP 유전자형이 서로 상이함을 알 수 있었고, 이를 이용함으로써 보다 용이하게 소의 품종을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면 종래의 RAPD 또는 SCAR 표지를 이용한 한우 품종 판별 기술에 비하여 훨씬 안정적이고 100%에 가까운 재현성과 정확성을 보장할 수 있을 뿐만 아니라, 신속 간편하여 효율성과 실용성을 극대화할 수 있는 효과가 있다.

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머에 의해 증폭된 MC1-R 유전자 산물에 Base118 I 또는 Msp I의 제한효소를 처리하는 과정을 포함하는 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법.
제 1 항에 있어서, 추가적으로 전기영동을 수행하는 것을 특징으로 하는 PCR-RFLP 유전자-이용 한우육 판별방법.