JP3116049B1 - Ｄｎａ配列多型による豚の品種識別法 - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 ブタの品種の識別方法の提供。 【解決手段】 ブタから抽出したDNAを少なくとも1種類
の制限酵素で処理し、得られるDNA断片について制限酵
素断片長分析を行うことを特徴とするブタの品種識別方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ブタの品種の識別
方法及び品種識別用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、豚肉の生産では一般に大ヨークシ
ャー及びランドレース（いずれも白色）と、デュロック
（茶色）とを用いた三元交雑によるものが主流である
（平成9年2月現在、肉豚全体の82％）。一方、市場には
黒豚肉としてバークシャー種の肉が販売されており（平
成9年2月現在、肉豚全体の2％）、品質の高い肉であ
る。バークシャー種などの黒豚は、大ヨークシャー又は
ランドレースなどの白色品種よりも産子数が少なく、肥
育に時間がかかるため、黒豚肉は他の豚肉と比べて高値
で取り引きされている。

【０００３】しかし、この高値に便乗し、黒豚肉として
販売されているものの中に、白豚との交雑による肉、全
く黒豚を交雑していない豚肉なども出回っている。とこ
ろで、ある遺伝子の遺伝子型を調べる方法として、制限
酵素断片長多型（Restriction fragment length polymo
rphisms :RFLP）による解析技術が知られている。RFLP
は、生物の個体間で遺伝子の構造の異なる部位に制限酵
素部位が存在すると、制限酵素切断断片のサイズが異な
ることを利用してその遺伝子の多型を解析したものであ
る。多型を示すDNA領域が特定されている場合には、そ
の領域をマーカーとすることにより、ある遺伝子が由来
する個体を特定することができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、DNA配列の
多型によるブタの品種を識別する方法を提供することを
目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、制限酵素断片長多
型による分析を行うことによりブタの品種を識別し得る
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、ハンプシャー種、バ
ークシャー種、メイシャン種、モンカイ種及びデュロッ
ク種からなるブタ有色種並びにランドレース種及び大ヨ
ークシャー種からなるブタ白色種から抽出したメラニン
細胞刺激ホルモン受容体遺伝子であって配列番号３〜６
に示される塩基配列又はその部分配列を有するものから
選択される少なくとも１つを、少なくとも1種類の制限
酵素で処理し、得られるDNA断片について制限酵素断片
長多型分析を行って、ハンプシャー種及びバークシャー
種並びに白色種からなる群と、メイシャン種及びモンカ
イ種からなる群と、デュロック種からなる群とを相互に
識別し、かつ、前記有色種及び白色種から抽出したc-KI
T遺伝子であって配列番号23〜33に示される塩基配列又
はその部分配列を有するものから選択される少なくとも
１つを、少なくとも1種類の制限酵素で処理し、得られ
るDNA断片について制限酵素断片長多型分析を行って、
白色種と有色種とを識別することにより、ハンプシャー
種及びバークシャー種からなる群と、メイシャン種及び
モンカイ種からなる群と、デュロック種からなる群と、
白色種とを識別することを特徴とするブタの品種識別方
法である。制限酵素としては、MaeII、RcaI、HhaI、Nla
III、Csp45I、DpnI、DpnII、MboI、Sau3AI、TaqI、TthH
B8I、、NspI、NspHI、EcoRV、MseI、BslI、HaeII、Cfo
I、HinPI、Aor51HI、Eco47III、BsaJI、EcoT14I、Sty
I、MnlI、BstEII、BstPI、Eco065I、HapII、HpaII、Msp
I、SmaI、XmaI、PspAI、Cfr9I、AsuI、Cfr13I、San96
I、BcnI、BstNI、Bst0I、EcoRII、HaeIII、PalI、Sfc
I、BamHI、NlaIV、AlwI、AfaI、RsaI、EcoT22I、NsiI、
SfaNI、ScrFI、MvaI、AccII、AciI、BstVI、Bsh1236I、
HinfI、TfiI、HincII、HindII、BsmI、Fnu4HI、AvaI、D
deI、ApaI、BsiCI、BstBI、NspV及びAlwNI並びにこれら
の制限酵素のイソチゾマーからなる群から選択される少
なくとも1種が挙げられる。

【０００７】さらに、本発明は、配列番号7及び8に示さ
れる塩基配列を有するプライマーセットと、制限酵素 M
aeII、RcaI、HhaI、NlaIII、AccII及びAciI並びにこれ
らの制限酵素のイソチゾマーからなる群から選択される
少なくとも1種の制限酵素とを含む、ブタの品種識別用
キットである。さらに、本発明は、配列番号34及び35に
示される塩基配列を有するプライマーセットと、制限酵
素 NlaIII、TaqI及びCsp45I並びにこれらの制限酵素の
イソチゾマーからなる群から選択される少なくとも1種
の制限酵素とを含む、ブタの品種識別用キットである。
以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の方法は、ブタから抽出し
たDNAを制限酵素処理することにより断片化し、得られ
た断片について制限酵素断片長多型（RFLP)分析にかけ
ることにより、ブタの品種を識別するものである。

【０００９】１．ブタの品種 本発明において、識別の対象となるブタの品種として
は、大ヨークシャー、ランドレース、デュロック、バー
クシャー、ハンプシャー、メイシャン、モンカイ及びユ
カタンマイクロブタよりなる群から選択される少なくと
も2種が挙げられる。ここで、上記ブタは、皮膚の色に
よって以下の通り分類される。 黒色品種：メイシャン、モンカイ、ユカタンマイクロブ
タ 六白：バークシャー 黒地に、肩から前足にわたってベルト状の白地を有する
種：ハンプシャー 茶色品種：デュロック 白色品種：大ヨークシャー、ランドレース なお、バークシャー種は身体の大半は黒いが、四肢、頭
部、尾端は白く、そのため六白ともいう。また、本発明
においては、黒地に、肩から前足にわたってベルト状の
白地を有する種を「黒地白ベルト種」ということもあ
る。

【００１０】本発明においては、識別の目的に応じて、
どの品種とどの品種を識別するのかを任意に選択するこ
とができ、特定の品種に限定されるものではない。この
場合は、RFLP分析を行うための対象となる遺伝子の種類
により、識別の対象となる品種が選択される。例えば、
メラニン細胞刺激ホルモン受容体遺伝子（MC1-R遺伝
子）を分析の対象遺伝子として採用すると、上記ブタ品
種のうち、ハンプシャー、バークシャー、ランドレース
及び大ヨークシャーから成る群（A群とする）と、メイ
シャン及びモンカイから成る群（B群とする）と、デュ
ロック（C群とする）からなる群とを相互に識別（区
別）することができる。従って、A群に属する種をB群に
属する種から識別することもでき、A群に属する種をC群
に属する種から識別することもできる。

【００１１】ここで、A群にはハンプシャーなどの黒地
白ベルト種、及びバークシャーなどの六白種並びにラン
ドレース及び大ヨークシャーなどの白色種が含まれてい
る。特に白色種とそれ以外の種（黒地白ベルト種又は六
白種などの有色種）との間では品質に差があるため、上
記A群内において有色種と白色種とを識別することは重
要である。この場合は、RFLP分析の対象となる遺伝子と
してc-KIT遺伝子を使用することにより、A群内における
有色種と白色種とを識別することができる。

【００１２】２．遺伝子の調製 本発明に使用される遺伝子としては、ブタの品種を特に
皮膚の色により識別できる点で、メラニン細胞刺激ホル
モン受容体遺伝子（MC1-R遺伝子）又はc-KIT遺伝子が挙
げられる。但し、本発明においてはこれらの遺伝子に限
定されるものではなく、ブタ由来の遺伝子であればいず
れのものも使用することができる。例えば、上記遺伝子
以外のものとして、例えばアグーチ遺伝子、チロシナー
ゼ遺伝子、ミトコンドリアDNA等が挙げられる。

【００１３】遺伝子の採取源は特に限定されるものでは
なく、例えば肉（もも肉、肩肉、ロース肉等）、血液、
加工した肉（ハム、ソーセージ等）等が挙げられる。こ
れら採取源からの遺伝子の調製は、公知のいずれかの方
法により行うことができる（文献名：J.Sambrook et a
l. (Eds.), Molecular Cloning, 2nd ed. Cold SpringH
arbor Laboratory Press, pp.9.16-9.23, 1989）。ある
いは、市販のキット（STRATAGENE, DNA Extraction Kit
(#200600)）を用いることもできる。

【００１４】得られた遺伝子は、後述のRFLP分析を容易
にするため、予め増幅しておくことが好ましい。増幅
は、例えばポリメラーゼ連鎖反応により行うことができ
る。PCR用プライマーは、増幅の目的となる遺伝子の塩
基配列に基づいて設計及び合成する。なお、プライマー
は通常の化学合成により得ることができる。上記プライ
マー及びDNAポリメラーゼを用いて、対象となるDNAをポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する。DNAポリメラ
ーゼとしてはLA Taq DNAポリメラーゼ(Takara)、Taq DN
Aポリメラーゼ、AmpliTaq Gold (Perkin Elmer)、Pfu D
NAポリメラーゼ（Stratagene社）等が挙げられるが、Am
pliTaq Goldポリメラーゼが好ましい。

【００１５】増幅の条件は、90℃〜98℃で5秒〜3分、好
ましくは94℃で30秒〜1分の変性工程、40℃〜74℃で5秒
〜3分、好ましくは55℃〜66℃で30秒〜1分のアニーリン
グ工程、及び60℃〜74℃で10秒〜15分、好ましくは66℃
〜72℃で30秒〜7分の伸長工程を１サイクルとしてこれ
を25〜50サイクル行う。但し、鋳型DNA及びプライマー
を十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に95℃
で5〜10分の変性工程を加えてもよく、また、増幅され
たDNAを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に72
℃で5〜10分の伸長工程を加えてもよい。さらに、増幅
産物の検出を直ちに行わない場合は、非特異的な増幅が
起こらないようにするために、増幅産物を4℃で保存す
る工程を加えることが好ましい。

【００１６】なお、得られた遺伝子が目的のものである
かを確認するため、適当なシークエンサーで塩基配列決
定をしておくことが好ましい。本発明においては、MC1-
R遺伝子については配列番号３〜６に示されるものが挙
げられ、c-KIT遺伝子については配列番号23〜33に示さ
れるものが挙げられる。また、上記配列の部分断片も本
発明の方法に用いることができる。部分断片は適当な目
的に応じて適当な制限酵素処理をすることにより得るこ
とができる。制限酵素は以下に示すものであても、それ
以外であってもよい。

【００１７】３．制限酵素 前記の通り抽出した遺伝子を制限酵素で消化してDNA断
片化する。本発明において使用することができる制限酵
素は、ブタの遺伝子にその制限酵素サイトが含まれてい
るものであれば特に限定されるものではなく、RFLP分析
において通常用いられるものの中から1又は複数種類を
選択して使用する。制限酵素としては、例えばMaeII、R
caI、HhaI、NlaIII、Csp45I、DpnI、DpnII、MboI、Sau3
AI、TaqI、TthHB8I、NspI、NspHI、EcoRV、MseI、Bsl
I、HaeII、CfoI、HinPI、Aor51HI、Eco47III、BsaJI、E
coT14I、StyI、MnlI、BstEII、BstPI、Eco065I、HapI
I、HpaII、MspI、SmaI、XmaI、PspAI、Cfr9I、AsuI、Cf
r13I、San96I、BcnI、BstNI、Bst0I、EcoRII、HaeIII、
PalI、SfcI、BamHI、NlaIV、AlwI、AfaI、RsaI、EcoT22
I、NsiI、SfaNI、ScrFI、MvaI、AccII、AciI、BstVI、B
sh1236I、HinfI、TfiI、HincII、HindII、BsmI、Fnu4H
I、AvaI、DdeI、ApaI、BsiCI、BstBI、NspV及びAlwNIな
どが挙げられる。

【００１８】また、上記制限酵素のイソチゾマー（isoc
hizomer)、すなわち、異なる細菌から単離された制限酵
素でありながらその認識配列が互いに一致している酵素
（イソ制限酵素ともいう）も、本発明において使用する
ことができる。本発明においては、上記制限酵素のうち
RcaI、HhaI、MaeII、NlaIII、Csp45I、 BamHI、EcoRV
、DpnI、TaqI、HaeII、StyI、 AccII、AciI、MseI、Ao
r51HI、MnlI、BstPI、HapII、SmaI、AsuI、BcnI、HapI
I、SmaI、AsuI、BcnI、EcoRII、HaeIII、NlaIV、RsaI、
NsiI、HinfI、HincII、BsmI、Fnu4HI、AvaI、DdeI、Alw
NIなどが好ましい。

【００１９】４．RFLP 上記で断片化したDNAについてRFLP分析を行う。即ち、
断片化したDNAを電気泳動にかけ、各品種ごとの検出さ
れた断片の泳動パターンを比較する。以下、メラニン細
胞刺激ホルモン受容体（MC1-R)遺伝子の多型及び優性白
色に関与するc-KIT遺伝子多型を例に説明する。

【００２０】(1) MC1-R遺伝子の多型の場合 脊椎動物において体色に関与する褐色又は黒色の色素は
メラニンであり、メラノサイトにおいてその形成が行わ
れる。メラノサイトにおけるメラニン細胞刺激ホルモン
（α-MSH)の受容体はメラニン細胞刺激ホルモン受容体
（MC1-R)であり、この遺伝子の変異によるレセプター活
性の違いがメラノサイトにおけるチロシナーゼのレベル
に変化をもたらし、そのレベルの程度により毛色が黒色
又は褐色となる。本発明においては、毛色に関連した変
異が予想されるMC1-R遺伝子の一部の配列を増幅するプ
ライマーを設計し、RFLP分析を行うことができる。

【００２１】例えば、白色種又は六白種と、デュロック
（茶色）種又は黒色種との間でMC1-R遺伝子の配列の違
いを検索すると、白色種及び六白種には制限酵素RcaI部
位が存在する（図１A）。MC1-R遺伝子をRcaIで処理する
と、白色種及び六白種由来のDNAは制限酵素による切断
を受けるのに対し、デュロック種及び黒色種由来のDNA
は制限酵素による切断を受けない。従って、電気泳動に
おける白色種及び六白種の泳動パターンは、デュロック
種及び黒色種の泳動パターンと異なり、白色種又は六白
種と、デュロック種又は黒色種とを区別することができ
る（図１A）。

【００２２】また、白色種、黒色種及び六白種は、MC1-
R遺伝子において制限酵素HhaIで認識される配列を有す
る（図1B）。これに対し、デュロック種はHhaI部位を有
さず、当該制限酵素によって認識されない。その結果、
HhaI処理により、白色種、黒色種又は六白種とデュロッ
ク種とを識別することができる。これと同様に、制限酵
素MaeII又はNlaIIIで処理した場合は、白色種、六白種
及びデュロック種と黒色種とを識別することができる
（図１C、１D）。

【００２３】(2) 優性白色に関与するc-KIT遺伝子多型
の場合 c-KIT遺伝子は、メラニン細胞の増殖、分化及び遊走に
深く関与し、大ヨークシャー（優性白色）にはこの遺伝
子が重複していることが知られている(Johansson et a
l., Mammalian Genome vol 7, pp822-830, 1996)。ま
た、重複した一方の遺伝子には、c-KIT遺伝子のゲノム
のうち第18番目のイントロン（イントロン18；他のイン
トロンについても同様に表示する）に4塩基対の欠失が
あり、さらにc-KIT遺伝子のゲノムのうち第17番目のエ
クソン（エクソン17；他のエクソンについても同様に表
示する）とイントロン17との境界の変異により、その転
写産物はエクソン17を欠くことが知られている（Marklu
nd et al., Genome Research vol 8, pp826-833, 199
8）。一方、有色品種のc-KIT遺伝子は重複していない
（図２）。

【００２４】上記重複において、エクソン17-イントロ
ン17の境界の塩基（イントロン17の最初の塩基）がGか
らAに変化すると、その境界部位は制限酵素NlaIIIによ
って認識される。したがって、当該制限酵素処理により
重複した遺伝子を切断することにより、重複遺伝子の断
片が検出され、優性白色のブタ（ランドレース、大ヨー
クシャー）を、有色のブタ品種と区別することができる
（図２）。

【００２５】日本においては、豚肉の生産では主に三元
交雑により、ランドレース（白）のメスに大ヨークシャ
ー（白）のオスを掛け合わせ、その子どものメスに、デ
ュロック（茶）のオスを掛け合わせて肉豚としている。
また、四元交雑として、ランドレースと大ヨークシャー
とを掛け合わせた子に、デュロックとハンプシャーとを
掛け合わせて得た子を交配して肉豚としている。

【００２６】上記の三元交雑により得られたブタc-KIT
遺伝子については、そのNlaIIIサイト（エクソン17-イ
ントロン17の境界の塩基）を当該制限酵素処理すること
により、また、上記四元交雑により得られたブタc-KIT
遺伝子についても、そのNlaIIIサイトを当該制限酵素処
理することにより、その多型から白色のブタの交配を確
認することができる（図３）。

【００２７】さらに、ブタ品種間におけるc-KIT遺伝子
の塩基配列を比較すると、日本イノシシに対して配列が
よく類似しているメイシャン及びバークシャーには、デ
ュロック、大ヨークシャー及びランドレースの配列と異
なる変異が多数存在する（表３）。本発明においては、
表３に示す各位置を認識することができる制限酵素を用
いることにより、メイシャン、バークシャー、デュロッ
ク、ハンプシャー、大ヨークシャー及びランドレースの
それぞれを相互に区別することができる。ここで使用さ
れる制限酵素としては、表１に記載のものが挙げられる
が、好ましくは、例えばRcaI、HhaI、MaeII、NlaIII、C
sp45I、 BamHI、EcoRV 、DpnI、TaqI、HaeII、StyI、 A
ccII、AciI、MseI、Aor51HI、MnlI、BstPI、HapII、Sma
I、AsuI、BcnI、HapII、SmaI、AsuI、EcoRII、HaeIII、
NlaIV、RsaI、NsiI、HinfI、HincII、BsmI、Fnu4HI、Av
aI、DdeI、AlwNI等が挙げられる。

【００２８】

【表１】

【００２９】

【００３０】(3) PCR及び検出 PCR用プライマーは、増幅の目的となる遺伝子の塩基配
列に基づいて設計及び合成する。なお、プライマーは通
常の化学合成により得ることができる。上記プライマー
及びDNAポリメラーゼを用いて、対象となるDNAをポリメ
ラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅する。DNAポリメラーゼ
としてはLA Taq DNAポリメラーゼ(Takara)、Taq DNAポ
リメラーゼ、AmpliTaq Gold (Perkin Elmer)、Pfu DNA
ポリメラーゼ（Stratagene社）等が挙げられるが、Ampl
iTaq Goldポリメラーゼが好ましい。

【００３１】増幅の条件は、90℃〜98℃で5秒〜3分、好
ましくは94℃で30秒〜1分の変性工程、40℃〜74℃で5秒
〜3分、好ましくは55℃〜66℃で30秒〜1分のアニーリン
グ工程、及び60℃〜74℃で10秒〜15分、好ましくは66℃
〜72℃で30秒〜7分の伸長工程を１サイクルとしてこれ
を25〜50サイクル行う。但し、鋳型DNA及びプライマー
を十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に95℃
で5〜10分の変性工程を加えてもよく、また、増幅され
たDNAを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に72
℃で5〜10分の伸長工程を加えてもよい。さらに、増幅
産物の検出を直ちに行わない場合は、非特異的な増幅が
起こらないようにするために、増幅産物を4℃で保存す
る工程を加えることが好ましい。このようにして、目的
のDNA断片を増幅することができる。

【００３２】その後は、増幅産物についてアガロースゲ
ル電気泳動を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等に
より染色し、そして増幅産物をバンドとして検出するこ
とによりブタにおけるRFLPを解析し、その品種を識別す
ることができる。なお、アガロースゲル電気泳動の代わ
りにポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいはキャピ
ラリー電気泳動を実施してもよい。また、予め蛍光色素
等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅
産物を検出することもできる。

【００３３】４．ブタの品種識別用キット 本発明に用いられる制限酵素及びプライマーは、ブタの
品種を識別するためのキットとして使用される。本発明
のキットにおいて、制限酵素は、上記列記した制限酵素
のうちのいずれか1種を、又はこれらを適宜組み合わせ
て用いることができる。一方、PCR-RFLP用のプライマー
として、例えばMR011（配列番号７）及びMR012（配列番
号８）に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
上記プライマー及び制限酵素を使用すると、MC1-R遺伝
子のRFLPに基づいてブタの品種を識別することができ
る。

【００３４】また、本発明のキットにおいては、制限酵
素NlaIII若しくはCsp45I又は両者を用いることができ、
プライマーとして例えばReKit2（配列番号34)及びReKit
4（配列番号35)を使用することができる。この場合は、
c-KIT遺伝子のRFLPに基づいてブタの品種を識別するこ
とができる。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。ただし、これら実施例により本発明の技術
的範囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕ブタゲノムDNAの調製 (1-1)ブタゲノムDNAの単離 各ブタ品種（大ヨークシャー29頭、ランドレース79頭、
デュロック17頭、メイシャン35頭、ハンプシャー１頭）
の血餅を農林水産省畜産試験場（茨城県）から入手し、
ゲノムDNAを得た。方法の概略を以下に示す。

【００３６】血餅約４〜5mlに対し、350μlのCell lysi
s NP-40バッファー (NaCl 140mM, MgCl2 1.5mM, Tris-H
Cl pH8.5 100mM, 0.5% NP-40)、4.5mlの細胞溶解 SDS
バッファー(EDTA 12mM, NaCl 120mM, SDS 1.2%)、50μl
のプロテイナーゼK 溶液 (10mg/ml)を加え、撹拌した
後、55℃でオーバーナイトのインキュベーションを行っ
た。次に70℃で10分間熱を加えることによりプロテイナ
ーゼ Kを失活させた後、20μlのRnase 溶液（10mg/ml）
を加え、２時間放置しRNAを消化した。その後、同量の
フェノール液で２回抽出し、さらにフェノール・クロロ
ホルムで1回抽出した。水層を分離し、２容のエタノー
ルと１/10容の3M酢酸ナトリウムを加え、析出したDNAを
ガラス棒でとり、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、
200μlのTE（10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA）に溶か
した。OD260nmで吸光度を測定し、DNA濃度を決定した
後、50ng/μlのDNAサンプルとして調整した。

【００３７】(1-2)ブタゲノムDNAの単離 抗凝固剤としてEDTA-2Na（血液1mlに対し、EDTA-2Naを
1.5mg使用）を用いたバークシャー種22頭の血液約10ml
を鹿児島県畜産試験場（鹿児島県）から入手し、血清と
血餅を分離した後、血餅から例１と同様にしてDNAを単
離精製した。OD260nmで吸光度を測定し、DNA濃度を決定
した後、50ng/μlのDNAサンプルとして調整した。

【００３８】(1-3)ブタゲノムDNAの単離 抗凝固剤としてヘパリンナトリウム（血液10mlに対し、
ヘパリンナトリウム90単位）を用いた各ブタ品種の血液
（バークシャー10頭；鹿児島県畜産試験場（鹿児島
県）、ユカタンマイクロ２頭；農林水産省畜産試験場
（茨城県）、ランドレース6頭；茨城県畜産試験場（茨
城県））を入手し、タカラ酒造製のDNA抽出キット、Gen
とるくん^TM（血液用)を用い、説明書に従ってDNAを抽出
した。すなわち、血液2mlに対して、10mlのGenTLE溶液I
を加え、直ちに数秒間ボルテックスを行い、室温で10分
間静置後、遠心分離を室温で12,000×g、5分間行った。
上清を除いた後、沈澱物に12mlのGenTLE溶液IIを加え、
転倒混和した後、室温において12,000×g、2分間遠心分
離を行った。上清を除いた後、沈澱物に7mlのGenTLE溶
液nIIIを加え、10秒間ボルテックスを行った。室温にお
いて12,000×g、5分間遠心分離を行った後、上清を新し
いチューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、転
倒混和してよく混合した。この時、DNAの白い沈殿が確
認できるが、それを12,000×g、5分間遠心分離により回
収後、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、200μlのTE
（10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA）に溶かした。OD260
nmで吸光度を測定し、DNA濃度を決定した後、50ng/μl
のDNAサンプルとして調整した。

【００３９】(2)日本イノシシゲノムDNAの単離 群馬県および徳島県の山中で、狩猟により採取された日
本イノシシの耳介の肉片を入手し、STRATAGENE社のDNA
抽出キット（DNA Extraction Kit; ♯200600）を用い、
説明書の手順を改変した方法によりDNAを抽出した。方
法の概略を以下に示す。群馬県の日本イノシシ16頭、徳
島県の日本イノシシ5頭の耳介の肉片約300mgをハサミで
細分化し（1〜2mm角程度）、2mlのマイクロチューブ内
に入れ、Solution 2を737μl加え、よく混ぜ合わせた
後、pronase（225mg/ml）を2.7μl加え、転倒撹拌しな
がら37℃で一晩放置した。次に氷上で10分間おいた後、
Solution3を263μl加え、5分間氷上に静置した。2,000
×gで15分間遠心後、上清を新しい2mlのマイクロチュー
ブに移し、Rnase（10mg/ml）を2μl加え37℃で15分間静
置した。その後、1容のイソプロパノールを加え、析出
したDNAをチップの先で回収した。これを70％エタノー
ルで洗浄し、乾燥させ、200μlのTE（10mM Tris-HCl pH
8.0, 1mM EDTA）に溶かした。OD260nmで吸光度を測定
し、DNA濃度を決定した後、50ng/μlのDNAサンプルとし
て調整した。

【００４０】(3) プライマーの合成：メラニン細胞刺激
ホルモン受容体（MC1-R）遺伝子について プライマーは、GeneBankに登録してある、ウシ（access
ion number;U39469）、ヒト（accession number;X6563
4）、マウス（accession number;X65635）のMC1-R遺伝
子の塩基配列をアライメントすることにより、よく保存
されている部分を用い設計した。この遺伝子において、
毛色の多型を示す変異は、７つの膜貫通領域のうちの２
番目の領域に集中していることがマウスの研究で明かと
なっているので（Robbins et al., 1993, Cell 72:827-
834）、この領域を含むようにプライマーを設計した。

【００４１】プライマーとしてMR01（forward；配列番
号１）とMR4（reverse；配列番号２）を合成した。ここ
でforwardはフォワードプライマーを、reverseはリバー
スプライマーを表す。なお、マウスのMC1-R遺伝子の配
列（accession number;X65635）の塩基番号によると、M
R01の5'側の最初の塩基は103番の塩基に相当し、MR4の
5'側の最初の塩基は766番の塩基に相当する。このプラ
イマーによってブタMC1-R遺伝子のうち、664bpの増幅産
物が得られる。

【００４２】(4) PCR PCRのためのTaqポリメラ−ゼはPERKIN ELMER製のAmpliT
aq Goldを用いた。DNA100ngを鋳型として、200μM dNT
Ps、1μM プライマー（MR01,MR4）、1×PCRバッファ
ー、20ng BSAに、2.5ユニットのAmpliTaq Goldを加え、
50μlの反応液とした。PCR機（GeneAmp PCR System 970
0; PERKIN ELMER製）を用い、熱変性94℃1分、アニ−リ
ング60℃ 1分、伸長反応72℃ 1分を1サイクルとし、こ
れを40回行った。

【００４３】(5)アガロースゲル電気泳動によるPCR産物
の確認 次に、上記のPCRによって得られた産物について電気泳
動を行った。電気泳動装置としては、コスモ・バイオ製
のミューピッドを用いた。ゲルトレーに泳動ゲル（組成
は1％アガロース；GIBCO BRL製、ultra PURE Agarose、
1×TAE（Tris-acetate-EDTA）緩衝液）を作製し、PCRの
終了したサンプルを5μl添加した。次いで100ボルトの
電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAバンドをEtBr溶
液（ethydium bromide；10μg/100ml）で染色した。そ
の後紫外線（260nm）をあて、増幅したDNAのバンドを確
認した。

【００４４】(6) DNA断片の精製 上記の方法でDNAの増幅が確認できた段階で、PCR産物を
アガロースゲルから抽出、精製した。大きめのウェル
（50μlが入る程度）を作ることができるコームを用
い、ゲルトレーに泳動ゲル（組成は1％アガロース；GIB
CO BRL製、ultra PUREアガロース、1×TAE（Tris-aceta
te-EDTA）緩衝液）を作製し、PCRによって増幅したDNA
を全量添加した。次いで100ボルトの電圧をかけて電気
泳動し、分離したDNAバンドをEtBr溶液（ethydium brom
ide；10μg/100ml）で染色し、紫外線（260nm）をあて
ることにより蛍光発色したDNAバンドをカッターナイフ
の刃で切り取り、ゲル抽出キット（キアゲン製、QIAqui
ck Gel Extraction Kit）を用い抽出、精製した。方法
の概略を以下に示す。

【００４５】増幅したDNAを含むアガロースゲル断片の
重さを計り、ゲル１容に対し３容のQGバッファーを加え
50℃で10分間加温することにより、ゲルの断片を完全に
溶かした。この溶液に、ゲル１容に対しイソプロパノー
ル１容を加えた。以下の手順は室温で行った。スピンカ
ラム（DNAトラップ用のメンブレンがある）を2mlのコレ
クションチューブ上においた後、スピンカラムに上記の
サンプル溶液を添加した。13,000rpmで１分間遠心し、
コレクションチューブにたまった液を除いた。この操作
をサンプル溶液がなくなるまで繰り返した。次にスピン
カラムに0.5mlのQGバッファーを加え、13,000rpmで１分
間遠心し、コレクションチューブにたまった液を除い
た。次にスピンカラムに0.75mlのPEバッファーを加え、
5分間静置後、13,000rpmで１分間遠心し、コレクション
チューブにたまった液を除いた。再度、遠心によりスピ
ンカラムからPEバッファーを完全に除いた後、スピンカ
ラムを1.5mlのマイクロチューブにおき、50μlのEBバッ
ファーを加え、１分間静置後、13,000rpmで１分間遠心
し、溶出したDNA溶液を回収した。

【００４６】(7)ダイレクトシークエンシングによる塩
基配列の決定 上記の方法で抽出、精製したDNAの塩基配列を、ダイレ
クトシークエンシング法により決定した。Applied Bios
ystems製のDNAシークエンサー（ABI PRISM 377DNA SEQU
ENCER）とDNAシークエンシング用試薬（BigDye Termina
tor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit）を用い
た。方法の概略を以下に示す。

【００４７】上記のゲル抽出したDNA 300ngを鋳型とし
て、8μl Terminator Ready Reaction Mix 、各3.2pmol
プライマー（MR01,MR4）に蒸留水を加え20μlの反応液
とした。PCR機（GeneAmp PCR System 9700; PERKIN ELM
ER製）を用い、熱変性96℃10秒、アニ−リング50℃5
秒、伸長反応60℃4分を1サイクルとし、これを25回行っ
た。エタノール沈殿のため、20μlの反応液に対し50μl
の100％エタノールと２μlの3M酢酸ナトリウムを加え、
氷上で10分間静置した後、4℃で14,000rpm、20分間遠心
した。沈殿を分離し、70％のエタノールを加え洗浄した
後、遠心乾燥器で乾燥した。

【００４８】乾燥した反応物に対し、4μlのローディン
グ溶液（脱イオンホルムアミド：ブルーデキストラン溶
液=５：１、ブルーデキストラン溶液は25mM EDTAにブル
ーデキストラン（50mg/ml）を溶かして作る）を加え、D
NAをよくとかした後、90℃で2分間加熱し、加熱後すぐ
にサンプルを氷上に置き急冷した。

【００４９】DNAシークエンシングは、48cmのゲル板（3
77,48cmガラスプレート；PERKIN ELMER製）と、アクリ
ルアミドゲルはバイオメイト製のDNAシーケンス分析用
ゲル調整液（Pageset Series）を用いた。室温下で2時
間以上静置し、アクリルアミドを完全にゲル化した後、
シークエンシングを行った。シークエンシングはABI PR
ISM 377 DNA SEQUENCER（Applied Biosystems製）を用
い、8時間の電気泳動を行った。塩基配列の解析には、3
77シークエンサーに付属のソフトウエア（ABI Prism 37
7 Analysis）およびソフトウエア開発株式会社製のGENE
TYX-MAC Version 8を用いた。

【００５０】(8)ダイレクトシークエンシングにより決
定したブタMC1-R遺伝子の塩基配列 各ブタ品種のMC1-R遺伝子の塩基配列決定を行った結
果、配列番号３〜６に示す塩基配列を有するDNAを得
た。これらの配列において、配列番号３に示す配列はデ
ュロック種15頭からのDNAである。配列番号４に示す塩
基配列は、大ヨークシャー種20頭、ランドレース種３
頭、バークシャー種15頭及びハンプシャー種1頭からのD
NA（ホモ型のもの）であった。ランドレース種８頭を調
べた結果、これらの個体は配列番号４および配列番号５
に示す塩基配列を有するDNAをヘテロ接合で持つもので
あった。さらに、ランドレース種４頭を調べた結果、す
べての個体のDNAが配列番号５に示す塩基配列を有する
もの（ホモ型のもの）であった。さらに、メイシャン種
１１頭とモンカイ種３頭を調べた結果、DNAはすべての
個体において配列番号６に示す塩基配列を有するもので
あった。

【００５１】配列番号３〜６に示す塩基配列を有するDN
AをソフトウエアGENETYX-MAC Version 8のマルチアライ
メント機能を用い、アライメントした結果、コドン90、
97、116、119、159、161、238において塩基置換が観察
された。このうち、コドン116は同義置換、その他の変
異は非同義置換であった。なお、同義置換とはもとのア
ミノ酸と同一のアミノ酸をコードする塩基に置換するこ
とを意味し、非同義置換とは、もとのアミノ酸とは別の
アミノ酸をコードする塩基に置換されることをいう。こ
こで、コドン番号はマウスのMC1-R遺伝子の配列（acces
sion number;X65635）の番号に倣った。これらのコドン
の塩基の変異ついては、表２に示す。

【００５２】

【表２】

【００５３】〔実施例2〕PCR-RFLP法による制限酵素断
片多型の検出 実施例１において得られた遺伝子の非同義置換の部分を
制限酵素分析することにより、ブタ品種と変異の関係を
検索した。 (1) DNA断片の調製 まずPCR法により変異を含む部分について増幅を行い、
非同義置換の部分に対応する各制限酵素によりDNAを切
断し、電気泳動によりDNA断片を確認した。以下に方法
の概略を示す。

【００５４】PCR-RFLP用のプライマーとして、MR011（f
orward；配列番号７）及びMR012（reverse；配列番号
８）を合成した。ここでforwardはフォワードプライマ
ーを、reverseはリバースプライマーを表す。なお、マ
ウスのMC1-R遺伝子の配列（accession number;X65635）
の塩基番号によると、MR011の5'側の最初の塩基は194番
の塩基に相当し、MRO12の5'側の最初の塩基は598番の塩
基に相当する。このプライマーによってブタMC1-R遺伝
子の405bpの増幅産物が得られる。

【００５５】PCRのためのTaqポリメラ−ゼはPERKIN ELM
ER製のAmpliTaq Goldを用いた。DNA100ngを鋳型とし
て、200μM dNTPs、1μM プライマー（MR011,MRO1
2）、1×PCR バッファー及び20ng BSAを含む溶液に、2.
5ユニットのAmpliTaq Goldを加え、全量50μlの反応液
とした。PCR機（GeneAmp PCR System 9700; PERKIN ELM
ER製）を用い、熱変性94℃1分、アニーリングと伸長反
応66℃1分を1サイクルとしたシャトルPCRにより、これ
を40回行った。

【００５６】次に、上記のPCRによって得られた産物を
電気泳動し、DNA断片の増幅を確認した。電気泳動装置
としては、日本ジェネティクス製のElectro-Fast 108 c
ompleteを用いた。ゲルトレーに泳動ゲル（組成は1％ア
ガロース；GIBCO BRL製、ultraPUREアガロース、1×TAE
（Tris-酢酸-EDTA）緩衝液）を作製し、PCRの終了した
サンプルを5μl添加した。次いで100ボルトの電圧をか
けて電気泳動し、分離したDNAバンドをEtBr溶液（ethyd
ium bromide；10μg/100ml）で染色した。その後紫外線
（260nm）をあて、増幅したDNAのバンドを確認した。

【００５７】増幅産物を確認した後、各サンプルにつき
１０μlを制限酵素処理した。制限酵素は４種類（RcaI:
GIBCOBRL製, NlaIII:TOYOBO製, HhaI:ニッポンジーン
製,MaeII:MBI Fermentas製）を用いた。PCR増幅済みの
反応液１０μlに対し、制限酵素0.5μl、制限酵素に添
付されている10×バッファーを2μl加え、滅菌水で20μ
lにして各酵素に至適な温度（RcaI、NlaIIIとHhaIは37
℃、MaeIIは65℃）により制限酵素処理を行った。

【００５８】制限酵素処理したDNA断片の電気泳動装置
としては、RcaIで消化した場合は日本ジェネティクス製
のElectro-Fast 108 completeを用いた。ゲルトレーに
泳動ゲル（組成は4％アガロース；FMC BioProducts製、
Nusieve 3:1 アガロース、1×TAE（Tris-酢酸-EDTA）緩
衝液）を作製し、制限酵素処理したサンプルを10μl添
加した。次いで100ボルトの電圧をかけて電気泳動し、
分離したDNAバンドをEtBr溶液（ethydium bromide；10
μg/100ml）で染色した。その後紫外線（260nm）をあ
て、増幅したDNAのバンドを確認した。

【００５９】本実施例において、制限酵素HhaI、NlaIII
とMaeIIで消化した場合には、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により泳動を行った。泳動装置はバイオクラフ
ト製のワイドミニ冷却スラブ電気泳動槽（PA-260型）を
用いた。8％のポリアクリルアミドゲルプレート（組成
は8％アクリルアミド；アクリルアミド：ビスアクリル
アミド=19：1、アムレスコ製、1×TBE（Tris-ホウ酸-ED
TA）緩衝液）を作製し、制限酵素処理したサンプルを5
μl添加した。次いで100ボルトの電圧をかけて電気泳動
し、分離したDNAバンドをEtBr溶液（ethydium bromid
e；10μg/100ml）で染色した。その後紫外線（260nm）
をあて、DNAのバンドを確認した。

【００６０】(2)制限酵素処理により生じることが期待
されるDNA断片長 配列番号３〜５に示す塩基配列を有するDNAにおいて、
プライマーMRO11とMRO12で増幅することができる405bp
の産物を、制限酵素MaeIIを用いて切断した場合、162b
p、90bp、87bp、66bpの4つのDNA断片となる。一方、配
列番号６に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プライ
マーMRO11とMRO12で増幅することができる405bpの産物
は、168bp、162bp、66bp、9bpの4つのDNA断片となる。

【００６１】制限酵素RcaIを用いた場合、配列番号４と
５に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プライマーMRO
11とMRO12で増幅することができる405bpの産物は、234b
p、171bpの2つのDNA断片となる。一方、配列番号３と６
に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プライマーMRO11
とMRO12で増幅することができる405bpの産物には、制限
酵素サイトが存在しない。

【００６２】制限酵素HhaIを用いた場合、配列番号に示
す塩基配列３を有するDNAにおいて、プライマーMRO11と
MRO12で増幅することができる405bpの産物は、138bp、1
28bp、96bp、38bp、5bpの5つのDNA断片となる。一方、
配列番号４〜６に示す塩基配列を有するDNAにおいて、
プライマーMRO11とMRO12で増幅することができる405bp
の産物は、128bp、109bp、96bp、38bp、29bp、5bpの６
つのDNA断片となる。

【００６３】制限酵素NlaIIIを用いた場合、配列番号３
〜５に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プライマーM
RO11とMRO12で増幅することができる405bpの産物は、20
6bp、141bp、34bp、24bpの4つのDNA断片となる。一方、
配列番号６に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プラ
イマーMRO11とMRO12で増幅することができる405bpの産
物は、206bp、84bp、57bp、34bp、24bpの5つのDNA断片
となる。

【００６４】(3) 結果 MC1-R遺伝子を用いた各ブタ品種のPCR-RFLP分析 大ヨークシャー種29頭、ランドレース種79頭、デュロッ
ク種17頭、メイシャン種35頭、バークシャー種32頭の計
192頭を用いて、MC1-R遺伝子の制限酵素多型を検出し、
どのような配列を保持しているかを検討した。大ヨーク
シャー種、ランドレース種およびバークシャー種では、
すべての個体で配列番号４または５に示す塩基配列を有
するDNAを保持していると考えられた。一方、デュロッ
ク種は配列番号３、メイシャン種は配列番号６に示す塩
基配列を有するDNAを保持していると考えられた。

【００６５】RFLPの結果を図4及び５に示す。図4は、MC
1-R遺伝子をHhaI、MaeII、NlaIIIの各制限酵素で消化し
たDNAの断片像である。各レーンにおいて、Lはランドレ
ース、Wは大ヨークシャー、Dはデュロック、Mはメイシ
ャン、BはバークシャーのDNAを示す。マーカーは25bpの
ラダーマーカーであり、濃いバンド（→）は125bpを示
す。

【００６６】図4において、制限酵素HhaIで消化した場
合、デュロック種のブタは138bpの位置にバンドが現れ
ているのに対し、ランドレース、大ヨークシャー、メイ
シャン、バークシャー種のブタは138bpの位置にバンド
が現れていない。従って、本発明の方法によりデュロッ
ク種と、ランドレース、大ヨークシャー、メイシャン及
びバークシャー種の群とを識別できることが分かった。

【００６７】さらに、図4において、制限酵素MaeIIで消
化した場合、ランドレース、大ヨークシャー、デュロッ
ク及びバークシャー種の群のブタは90bpと87bpの位置に
バンドが現れているのに対し、メイシャン種のブタは90
bpと87bpの位置にバンドが現れていない。従って、本発
明の方法によりメイシャン種と、ランドレース、大ヨー
クシャー、デュロック及びバークシャー種の群とを識別
できることが分かった。

【００６８】図５は、MC1-R遺伝子を制限酵素RcaIで消
化したDNAの断片像である。各レーンにおいて、Lはラン
ドレース、Wは大ヨークシャー、Dはデュロック、Mはメ
イシャン、BはバークシャーのDNAを示す。マーカーは10
0bpのラダーマーカーである。但し、525bpにもマーカー
が現れている。

【００６９】図5において、制限酵素RcaIで消化した場
合、ランドレース、大ヨークシャー及びバークシャー種
のブタは234bpと171bpの位置にバンドが現れるのに対
し、デュロック、メイシャン種のブタは234bpと171bpの
位置にバンドが現れていない（図５の「←」）。従っ
て、本発明の方法によりデュロック及びメイシャン種の
群と、ランドレース、大ヨークシャー及びバークシャー
種の群とを識別できることが分かった。

【００７０】図4において、制限酵素NlaIIIで消化した
場合、ランドレース、大ヨークシャー、デュロック及び
バークシャー種の群のブタは141bpの位置にバンドが現
れているのに対し、メイシャン種のブタは141bpの位置
にバンドが現れていないことから、本発明の方法により
メイシャン種と、ランドレース、大ヨークシャー、デュ
ロック、バークシャー種の群とを識別できることが分か
った。

【００７１】〔実施例3〕MC1-R遺伝子の制限酵素分析に
よるブタ品種の識別 ブタの品種識別の際に、毛色に関与する遺伝子を調べる
場合、品種が異なっても、毛色が同じならば同じ遺伝子
型になることが考えられる。この場合、日本における豚
肉の生産には、５つの主要な品種（大ヨークシャー（白
色）、ランドレース（白色）、デュロック（茶色）、バ
ークシャー（六白）、まれにハンプシャー（黒地白ベル
ト種））が関与する。

【００７２】上記のMC1-R遺伝子の制限酵素多型を調べ
た場合、茶色のブタ（デュロック；配列番号３）と、
白色種、六白種及び黒地白ベルト種（大ヨークシャー
種、ランドレース種、バークシャー種、ハンプシャー
種；配列番号４または５）と、黒色ブタ（メイシャン
種；配列番号６）とを、本発明の方法により互いに識別
することができた（図4、5）。

【００７３】〔実施例4〕c-KIT遺伝子の調製及び塩基配
列決定 デュロックは、その肉質がよいことから豚肉生産に広く
用いられている品種である。MC1-R遺伝子の配列を調べ
た場合、デュロック種の関与を識別できる意義は大き
い。しかし、白色種（大ヨークシャー、ランドレー
ス）、六白種（バークシャー）及び黒地白ベルト種（ハ
ンプシャー）のブタ品種は分けることができない。そこ
で、本実施例では、有色と白色を識別することができる
c-KIT遺伝子を用いて識別を行った。

【００７４】c-KIT遺伝子はマスト細胞増殖因子レセプ
ターであり、メラニン細胞の増殖、分化と遊走に深く関
与している。大ヨークシャー（優性白色）にはこの遺伝
子が重複していることが示唆されている(Johansson et
al., Mammalian Genome 7,822-830,1996)。また、重複
した一方の遺伝子には、イントロン18に4塩基対の欠失
があり、さらにエキソン17とイントロン17の境界の変異
（イントロン17の最初の塩基がGからAに変化）により、
その転写産物はエキソン17を欠くことが知られている(M
arklund et al., Genome Research 8,826-833,1998)。
この対立遺伝子は優性白色をもたらす対立遺伝子I（優
性）である。一方、有色品種のc-KIT遺伝子は重複して
いない（対立遺伝子i；劣性）。更に、白色品種の中
で、c-KIT遺伝子が重複しているものの、イントロン17
の最初の塩基がGのままの対立遺伝子が存在することが
知られている（対立遺伝子I^p）。対立遺伝子I^pがiとヘ
テロ接合になると、個体は白地に黒のパッチを示すよう
になる。

【００７５】Marklundらは、c-KIT遺伝子のcDNAの配列
をもとに解析しており、エキソン17の欠落と優性白色の
関係を明示しているが、この遺伝子のエキソン部分から
は、有色品種間の違いが分からない。また、イントロン
１７の最初の塩基を指標にした場合、優性白色の対立遺
伝子I^pと有色の対立遺伝子iで同じ塩基となり、この二
つを分けることができない。そこで本実施例では、エキ
ソン16からエキソン19までの、イントロン17を含んだ配
列約４kbpを各品種について決定した。

【００７６】(1)プライマーの合成：c-KIT遺伝子につい
て プライマーは、GeneBankに登録してあるブタc-KIT遺伝
子のcDNA配列（accession number;AJ223228）を基に合
成した。合成したプライマーはKit16N（エキソン16内に
あるもの；配列番号9）, Kit19C（エキソン19内にある
もの；配列番号10）とした。なお、ブタのc-KIT遺伝子
の配列（accession number; AJ223228）の塩基番号によ
ると、Kit16Nの5'側の最初の塩基は2292番に相当し、Ki
t19Cの5'側の最初の塩基は2698番に相当する。このプラ
イマーによってブタc-KIT遺伝子の領域、約４Kbpの増幅
産物が得られた。

【００７７】(2) LA-PCR LA-PCRのためのTaqポリメラ−ゼは宝酒造製のTaKaRa LA
Taq^TMを用いた。DNA250ngを鋳型として、400μM dNTP
s、1μM プライマー（Kit16N,Kit19C）、1×PCR バッフ
ァーIに、2.5ユニットのTaKaRa LA Taq^TMを加え、50μl
の反応液とした。PCR機（GeneAmp PCR System 9700; PE
RKIN ELMER製）を用い、熱変性98℃秒、アニ−リングと
伸長反応68℃7分を1サイクルとしたシャトルPCRで、こ
れを35サイクル行った。 (3)アガロースゲル電気泳動によるPCR産物の確認 実施例1に記述した方法と同様にしてPCR産物の確認を行
った。 (4) DNA断片の精製 実施例1に記述した方法と同様にしてDNA断片の抽出と精
製を行った。

【００７８】(5) ダイレクトシークエンシングおよびTA
クローニングによるc-KIT遺伝子の塩基配列決定 実施例1に記述した方法と同様にしてc-KIT遺伝子の塩基
配列を決定した。その結果、アガロースゲルでの増幅DN
A断片の確認では、約4Kbpであることが分かった。塩基
配列の決定のためにプライマーウォーキングを行った。
この方法はまず、プライマ−Kit16NとKit19Cを用い、ダ
イレクトシークエンシングで塩基配列を決定した後、そ
の決定した配列の先の部分にプライマーを作製し、次の
ダイレクトシークエンシングで更に先まで塩基配列を順
次決定していく方法である。この方法により、プライマ
ーを12個作製し、増幅した全塩基配列を決定した。合成
したプライマーは以下の通りである。

【００７９】 Kit1（1226番、forward）：配列番号11 Kit2（740番、reverse）：配列番号12 Kit3（578番、forward）：配列番号13 Kit4（3382番、forward）：配列番号14 Kit9（1813番、forward）：配列番号15 Kit10（2809番、reverse）：配列番号16 Kit11（173番、reverse）：配列番号17 Kit12（2228番、reverse）：配列番号18 Kit13（2403番、forward）：配列番号19 Kit22（2965番、forward）：配列番号20 Kit23（3480番、forward）：配列番号21 Kit35（1365番、reverse）：配列番号22

【００８０】カッコ内の番号は、塩基配列の確定後、最
初の塩基（プライマーKit16Nの3端塩基の次の塩基）を
１番とした場合における、各プライマーの5'端の塩基が
ハイブリダイズする位置の番号である。ダイレクトシー
クエンシングの結果、個体内で変異が存在した場合に
は、各配列の確定のためTAクローニングを行った。TAク
ローニングにはInvitrogen製のTOPO TA Cloning Kitを
用いた。以下に方法の概略を示す。

【００８１】(2)により得られたPCR産物１μl（10ng/μ
l）に１μl のPCR-TOPOベクターを加え、３μlの滅菌水
で計５μlとし、室温で５分間放置することにより、PCR
産物のベクターへのライゲーションを行った。One Shot
cell（コンピテントセル）のバイアルを氷上に置き、
コンピテントセルを解凍した後、２μlの0.5M β-メル
カプトエタノールを加え、ピペットで緩やかに混ぜ合わ
せた。このコンピテントセルに上記のライゲーションを
行ったベクターを2μl加え、氷上で30分間放置後、42℃
で30秒間ヒートショックを行った。250μlのSOC 培地を
加え、37℃で30分間培養した後、LB寒天培地（LB plat
e; 50μg/mlアンピシリン、1.6mg/プレート X-gal、1mg
/プレート IPTGを含む）に広げ、37℃でオーバーナイト
のインキュベーションを行った。

【００８２】インサートの入っている白色のコロニー
を、2mlのLB培地（Luria-Bertani 培地、50μg/mlアン
ピシリン）にピックアップし、オーバーナイトで培養し
た後、プラスミド抽出キット（GFX^TM Micro Plasmid Pr
ep Kit; amersham pharmacia biotech製）を用い、プラ
スミドを抽出した。以下に方法の概略を示す。

【００８３】培養した大腸菌を2mlのマイクロチューブ
に入れ、室温で13,000rpm、30秒間遠心することにより
集菌した。上清を捨て、大腸菌のぺレットに溶液Iを300
μl加え、ボルテックスで完全にぺレットをとかした。
次に溶液IIを300μl加え、マイクロチューブを10〜15回
転させた後、溶液IIIを600μl加え、マイクロチューブ
を10〜20回転させた。室温で13,000rpm、５分間遠心
し、コレクションチューブ上においたGFXカラムに上清
を移し、室温で１分間静置後、室温で13,000rpm、１分
間遠心した。コレクションチューブにたまった液を捨
て、残りの上清をGFXカラムに移し、室温で１分間静置
後、室温で13,000rpm、１分間遠心した。400μlの洗浄
バッファーをカラムに入れ、室温で13,000rpm、１分間
遠心した後、GFXカラムを1.5mlのマイクロチューブに移
した。プラスミドを溶出させるため、50μlのTE（10mM
Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA）をGFXカラムに入れ、室温
で１分間静置後、室温で13,000rpm、１分間遠心し、プ
ラスミド溶液を回収した。

【００８４】各個体内で変異のある配列（大ヨークシャ
ー、ランドレース、ヨーロッパイノシシ、デュロック）
については、各個体12サンプルずつプラスミドを抽出し
た。変異のある箇所を明らかにすることができるプライ
マーを用いて、すなわち大ヨークシャー、ランドレース
ではプライマーKit1を用いて1313番目の塩基を明らかに
し、一方、プライマーKit19Cにより3884〜3887番目の欠
失の有無を明らかにした。ヨーロッパイノシシとデュロ
ックではプライマーKit3で884番目の塩基を明らかに
し、プライマーKit1で1342番目の塩基を明らかにした。
得られたDNAについてダイレクトシークエンシングを行
い、塩基配列を決定した。

【００８５】(6)ダイレクトシークエンシングにより決
定したc-KIT遺伝子の塩基配列 c-KIT遺伝子の塩基配列を決定した結果、配列番号23〜3
3に示す塩基配列を有するDNAを得た。日本イノシシ１頭
を調べた結果、配列番号23に示す塩基配列を有するDNA
を得た。メイシャン種およびバークシャー種各１頭を調
べた結果、配列番号24に示す塩基配列を有するDNAを得
た。モンカイ種１頭を調べた結果、配列番号25に示す塩
基配列を有するDNAを得た。ヨーロッパイノシシ１頭を
調べた結果、配列番号26に示す塩基配列を有するDNA
（ホモ型）を得た。また、上記ヨーロッパイノシシとは
別個体のヨーロッパイノシシとデュロック種各１頭を調
べた結果、配列番号26と27に示す塩基配列を有するDNA
のヘテロ接合体であった。

【００８６】大ヨークシャー種およびランドレース種各
１頭を調べた結果、配列番号28〜30に示す塩基配列を有
するDNAを各個体について得た。３種類の配列を得た理
由は、白色品種ではc-KIT遺伝子が重複した後、各配列
に変異が蓄積したためと考えられる。ハンプシャー種１
頭を調べた結果、配列番号31に示す塩基配列を有するDN
Aを得た。バークシャー種１頭を調べた結果、配列番号3
2に示す塩基配列を有するDNAを得た。ユカタンマイクロ
ブタ１頭を調べた結果、配列番号33に示す塩基配列を有
するDNAを得た。

【００８７】配列番号23〜33に示す塩基配列を有するDN
AをソフトウエアGENETYX-MAC Version 8のマルチアライ
メント機能を用い、塩基配列の比較を行った。塩基の変
異部位を表３に示す。この表は、配列番号23に示す塩基
配列を有するDNAを基準とし、同じ塩基については(-)
で、また、異なった塩基についてはその塩基の記号（A,
G,C,Tのいずれか）を記した。欠失の場合は(*)で記し
た。ここで、１番目の塩基は、ブタのc-KIT遺伝子の配
列（accession number; AJ223228）で2322番に相当す
る。

【００８８】

【表３】

【００８９】(7)表３により観察される遺伝的変異 配列番号23〜33に示す塩基配列を有するDNAについて塩
基配列の比較を行った。その結果、塩基置換の類似性が
観察された。例えば配列番号23〜25に示す塩基配列を有
するDNAの塩基置換のパターンはよく似ていた（全体で6
2箇所の変異のうち、58箇所が同じ塩基）。これらの配
列を有するブタ品種は日本イノシシ、メイシャン、モン
カイ、バークシャー等の東洋を起源とするものであるた
め、これらの配列は東洋起源と推察される。なお、バー
クシャー種はヨーロッパの品種に中国ブタを交配して作
られた品種である。

【００９０】配列番号26〜31に示す塩基配列を有するDN
Aの塩基置換のパターンはよく似ていた（全体で62箇所
の変異のうち、50箇所が同じ塩基）。これらの配列を有
するブタ品種はヨーロッパイノシシ、大ヨークシャー、
ランドレース、デュロック、ハンプシャーといった西洋
を起源とするものであるため、これらの配列は西洋起源
と推察される。

【００９１】配列番号32〜33に示す塩基配列を有するDN
Aの塩基置換のパターンはよく似ていた（全体で62箇所
の変異のうち、51箇所が同じ塩基）。これらの配列を有
するブタ品種はバークシャーとユカタンマイクロブタで
ある。これらの配列の起源は不明である（以下「起源未
定」という）。

【００９２】〔実施例5〕c-KIT遺伝子の制限酵素分析に
よるブタ品種の識別 (1) PCR-RFLP法による制限酵素断片多型の検出 本実施例では、表３の変異部分を制限酵素分析すること
により、ブタ品種と変異の関係を検索し、配列番号23〜
33に示す配列のうち959番目と1313番目の塩基を調べ
た。1313番目の塩基のGからAへの変化は、エキソン17の
欠落に関与するものであり、優性白色のブタにのみ観察
される。したがって、有色と優性白色の品種を識別する
ためには、1313番目の塩基を調べる必要がある。1313番
目の塩基はGからAに変化することにより、制限酵素NlaI
IIにより認識されるようになる（認識配列CATG）。ま
た、959番目の塩基はAからGに変化することにより、制
限酵素Csp45Iにより認識されるようになる（認識配列TT
CGAA）。

【００９３】まずPCR法により変異を含む部分について
増幅を行い、制限酵素でDNAを切断し、電気泳動によりD
NA断片を確認した。増幅は、実施例２に記述した方法と
同様の方法により行った。制限酵素分析用のプライマー
として、ReKit2（847番、forward；配列番号34）及びRe
Kit4（1389番、reverse；配列番号35）を合成した。カ
ッコ内の番号は、c-KIT遺伝子の配列の最初の塩基を１
番とした場合における、プライマーの5'端の塩基がハイ
ブリダイズする位置の番号である。このプライマーによ
って543bpの増幅産物が得られる。

【００９４】PCRのためのTaqポリメラ−ゼはPERKIN ELM
ER社のAmpliTaq Goldを用いた。DNA100ngを鋳型とし
て、200μM dNTPs、1μM プライマー（ReKit2,ReKit
4）、1×PCR バッファー、20ng BSAに、2.5ユニットのA
mpliTaq Goldを加え、50μlの反応液とした。PCR機（Ge
neAmp PCR System 9700; PERKIN ELMER製）を用い、熱
変性94℃45秒、アニ−リング55℃45秒、伸長反応72℃45
秒を1サイクルとしたPCRにより、これを40回行った。増
幅したDNAバンドの確認は実施例２に記述した方法と同
様の方法により行った。

【００９５】(2)増幅産物の制限酵素処理及びバンドの
確認 増幅産物を確認した後、各サンプルにつき10μlを制限
酵素処理した。制限酵素は２種類（NlaIII:TOYOBO製,Cs
p45I:TOYOBO製）用いた。PCR増幅済みの反応液10μlに
対し、制限酵素0.5μl、制限酵素に添付されている10×
バッファーを2μl加え、滅菌水で20μlにして各酵素に
至適な温度（両酵素とも37℃）により制限酵素処理をし
た。

【００９６】制限酵素DNA断片の電気泳動装置として
は、Csp45Iで消化した場合は日本ジェネティクス製のEl
ectro-Fast 108 completeを用いた。ゲルトレーに泳動
ゲル（組成は3％アガロース；FMC BioProducts製、Nusi
eve 3:1 agarose、1×TAE（Tris-acetate-EDTA）緩衝
液）を作製し、制限酵素処理したサンプルを10μl添加
した。次いで100ボルトの電圧をかけて電気泳動し、分
離したDNAバンドをEtBr溶液（ethydium bromide；10μg
/100ml）で染色した。その後紫外線（260nm）をあて、
増幅したDNAのバンドを確認した。なお、制限酵素NlaII
Iで消化した場合には、ポリアクリルアミド電気泳動を
行った。

【００９７】泳動装置はバイオクラフト製のワイドミニ
冷却スラブ電気泳動槽（PA-260型）を用いた。5％のポ
リアクリルアミドゲルプレート（組成は5％アクリルア
ミド；アクリルアミド：ビスアクリルアミド=19：1、ア
ムレスコ製、1×TBE（Tris-borate-EDTA）緩衝液）を作
製し、制限酵素処理したサンプルを5μl添加した。次い
で100ボルトの電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAバ
ンドをEtBr溶液（ethydium bromide；10μg/100ml）で
染色した。その後紫外線（260nm）をあて、増幅したDNA
のバンドを確認した。

【００９８】(3) 制限酵素処理により生じることが期待
されるDNA断片長 制限酵素NlaIIIを用いた場合、配列番号23〜26、29〜33
に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プライマーReKit
2とReKit4で増幅することができる543bpの産物は、384b
p、154bp、5bpの3つのDNA断片となる。配列番号27に示
す塩基配列を有するDNAにおいて、プライマーReKit2とR
eKit4で増幅することができる543bpの産物は、384bp、1
09bp、45bp、5bpの4つのDNA断片となる。配列番号28に
示す塩基配列を有するDNA（ブタの優性白色に関与）に
おいて、プライマーReKit2とReKit4で増幅することがで
きる543bpの産物は、384bp、80bp、74bp、5bpの4つのDN
A断片となる。優性白色の場合、80bpと74bpの断片が出
現するが、有色の場合はこの断片が出ない。

【００９９】制限酵素Csp45Iを用いた場合、配列番号２
３〜２５、３３に示す塩基配列を有するDNAにおいて、
プライマーReKit2とReKit4で増幅することができる543b
pの産物には制限酵素サイトが存在しない。配列番号２
６〜３２に示す塩基配列を有するDNAにおいて、プライ
マーReKit2とReKit4で増幅することができる543bpの産
物は、432bpと111bpの２つのDNA断片となる。

【０１００】(4)結果 PCR-RFLPのポリアクリルアミドゲル電気泳動像を図6に
示す。図６の各レーンにおいて、Lはランドレース、Wは
大ヨークシャー、D1〜D3はデュロック、Mはメイシャ
ン、BはバークシャーのDNAを示す。マーカーは25bpのラ
ダーマーカーであり、濃いバンド（黒矢印「→」）は12
5bpを示す。

【０１０１】図6において、c-KIT遺伝子を制限酵素NlaI
IIで消化した場合、ランドレース及び大ヨークシャー種
の白色ブタは80bpと74bpの位置にバンドが現れているの
に対し（白矢印「⇒」）、デュロック、メイシャン及び
バークシャー種の有色ブタは80bpと74bpの位置にバンド
が現れていない。従って、本発明の方法によりランドレ
ース及び大ヨークシャー種の群と、デュロック、メイシ
ャン及びバークシャー種の群とを識別できることが分か
った。

【０１０２】〔実施例6〕c-KIT遺伝子を用いた各ブタ品
種のPCR-PFLR分析 大ヨークシャー種29頭、ランドレース種79頭、デュロッ
ク種17頭、メイシャン種33頭、バークシャー種27頭の計
185頭を用いて、プライマーReKit2とRekit4で増幅するc
-KIT遺伝子の制限酵素多型を検出し、さらに、どのよう
な配列を保持しているかを検討した。

【０１０３】制限酵素NlaIIIによる識別では、大ヨーク
シャーの全個体と、ランドレースの75個体で、384bp、1
54bp、80bp、74bp、5bpの５つのDNA断片となった。これ
は優性白色に関与する配列の存在を示唆する。また、ラ
ンドレースの４個体で、384bp、154bp、5bpの3つのDNA
断片となった。これは、対立遺伝子I^Pのホモ接合型であ
ると考えられた。一方、有色の他の品種（メイシャン、
バークシャー）では、全て384bp、154bp、5bpの3つのDN
A断片となった。また、デュロックでは3個体で384bp、1
54bp、5bpの3つのDNA断片、9個体で384bp、154bp、109b
p、45bp、5bpの5つのDNA断片、5個体で384bp、109bp、4
5bp、5bpの4つの断片となった。

【０１０４】以上のことより、本発明の方法により、白
色品種（ランドレース、大ヨークシャー）と有色品種
（デュロック、メイシャン、バークシャー）とを識別で
きることが分かった。

【０１０５】一方、制限酵素Csp45Iによる識別では、大
ヨークシャーとランドレースの全個体で432bpと111bpの
２つのDNA断片となった。一方、メイシャン全個体で543
bpのDNA断片となった。また、デュロック１５頭で432bp
と111bpの２つのDNA断片、２頭で543bp、432bp、111bp
の3つのDNA断片となった（ヘテロ型）。バークシャーで
は14個体が543bpのDNA断片、5個体が543bp、432bp、111
bpの3つのDNA断片、8個体が432bpと111bpの２つのDNA断
片となった。

【０１０６】各品種のいずれのDNA断片を調べても、各
個体において図７に示すパターンと同一のパターンを示
した。なお、図７の各レーンにおいて、Lはランドレー
ス、Wは大ヨークシャー、D1は2つの断片を生じたデュロ
ック、D2は3つの断片を生じたデュロック、Mはメイシャ
ン、B1はバークシャーの543bpの1つのDNA断片、B2はバ
ークシャーの3つのDNA断片、B3はバークシャーの2つのD
NA断片を示す。マーカーは100bpのラダーマーカーを示
す。

【０１０７】上記結果に基づいて、543bpのDNA断片(図7
のレーンB1)となった2個体、543bp、432bp、111bpの3つ
のDNA断片(図7のレーンB2)となった1個体、432bpと111b
pの２つのDNA断片(図7のレーンB3)となった3個体を選
び、プライマーKit9とKit10を用いPCRを行った後、ダイ
レクトシークエンシングを行った（方法の概略は前記と
同様である）。

【０１０８】プライマーKit9とKit10により、表２の183
9〜2717番目の塩基置換を明らかにした。その結果、432
bpと111bpの２つのDNA断片となった３個体(B3)は、配列
番号32に示す塩基配列を有するDNAであった。また、543
bpのDNA断片となった2個体(B1)は、配列番号24に示す塩
基配列を有するDNAであった。一方、543bp、432bp、111
bpの3つのDNA断片となった1個体(B2)は、配列番号24及
び32に示す塩基配列を有するDNAのヘテロ接合であっ
た。以上のことより、図7のB1は東洋型、B2は東洋型と
起源未定型とのヘテロ、B3は起源未定型のホモであり、
それぞれの起源を分けることができることが分かった。

【０１０９】〔実施例7〕 c-KIT遺伝子の制限酵素分析
によるブタ品種の識別 上記のc-KIT遺伝子の制限酵素多型を調べた場合、制限
酵素NlaIIIを用いることにより、白色ブタ（大ヨークシ
ャー、ランドレース）を、有色ブタ（デュロック、バー
クシャー、ハンプシャー、メイシャン）と識別すること
ができる。しかし、白色品種の中には1313番目の塩基が
GのままのDNAを有する個体が存在する（対立遺伝子I^Pの
ホモまたはヘテロ型）。

【０１１０】ところで、ブタ肉生産においては、一般的
に三元交雑が行われており、子取り用メス豚として白色
品種の大ヨークシャーとランドレースの交雑種を用い
る。そのメス豚に種オス豚としてデュロックを掛け合わ
せて肉豚を生産する。従って、対立遺伝子I^Pのホモ型ま
たはヘテロ型の個体を子取り用のメス豚に用いた場合、
三元交雑後のブタ肉から得たDNAにおいては制限酵素Nla
IIIで判定できない可能性がある。この場合は、優性白
色に関与する塩基（1313番目；表３）以外の塩基置換か
ら、その配列の起源をもとに識別することができる。

【０１１１】そこで、本実施例においては、表1に記載
の塩基置換変異のうち、第959番目を標的としてCsp45I
処理を行い、品種の識別を行った。その結果、制限酵素
Csp45Iによる識別では、大ヨークシャーとランドレース
の全個体で432bpと111bpの２つのDNA断片となった。こ
れは、大ヨークシャー及びランドレースは西洋起源であ
ることが分かった。 〔実施例８〕MC1-Rとc-KIT遺伝子との組み合わせによる
ブタ品種の識別 主要なブタ品種の識別について、その変異と制限酵素の
組み合わせを表４及び５にまとめた。

【０１１２】

【表４】

【０１１３】

【表５】

【０１１４】表４及び５中、（+）は制限酵素サイト有
り、（-）は制限酵素サイト無し、（*）は制限酵素が市
販されていないことを示す。+*は起源未定の配列（配列
番号32及び33に該当する）の存在により、（+）となっ
たものである。-** は東洋型の配列の存在により、
（-）となったものである。

【０１１５】ある1つの品種を他の品種と識別するため
に標的となる置換塩基は以下の通りである。すなわち、
デュロック種はMC1-R遺伝子のコドン159の変異により、
他の品種と区別することができる。メイシャン種はMC1-
R遺伝子のコドン97と116の変異により、他の品種と区別
することができる。ランドレースと大ヨークシャーの白
色品種は、バークシャー種やハンプシャー種とMC1-R遺
伝子の配列では区別がつかないが、c-KIT遺伝子の1313
番目の変異により有色と白色を区別することができる。

【０１１６】上記方法は、毛色の表現型に関与する多型
を用いた場合であるが、系統的な識別（表５の「起源に
関連」の部分）により、より細かく分類することが可能
となる。例えば、c-KIT遺伝子の2600番目の塩基は、Sma
Iにより西洋起源を分けることができるが、これによっ
てバークシャー種とハンプシャー種を分けることができ
る。また、2313と2314番目の塩基により、バークシャー
種の一部を識別することもできる。さらに、表3の塩基
変異を認識する表１記載の制限酵素を用いることで、品
種のより細かな分類が可能である。

【０１１７】本発明においては、上記の通り他の品種と
交配していない純系の黒ブタ品種（バークシャー種）を
白色品種（ランドレース、大ヨークシャー）およびデュ
ロック種（茶色）から識別することができる。しかしな
がら、毛色が同じならば、品種が違っても同じ遺伝子型
になるという点に注意する必要がある。

【０１１８】日本における豚肉の生産に関与している主
要な品種は、大ヨークシャー（白色）、ランドレース
（白色）、デュロック（茶色）、バークシャー（六
白）、まれにハンプシャー（黒地に白ベルト）の5つの
品種である。従って、本発明においては、日本において
豚肉の生産に用いられたブタ品種を効果的に識別するこ
とができる。

【０１１９】現在、市場には黒豚肉として、バークシャ
ー種の肉が販売されている。一方、豚肉の生産では、単
一の品種を用いることはほとんど無く、一般的に大ヨー
クシャー種（L）とランドレース種（W）の雑種を子取り
メス豚とし、デュロック種（D）を種オス豚に用いた三
元交雑（（LW）D）による豚肉の生産が主流である。こ
の三元交雑のメリットは、大ヨークシャー種とランドレ
ース種の多産性と早い成長性を利用し、沢山の子供を生
産した上で、肉質について勝るデュロック種を掛け合わ
せるため、経済性と肉質の両方が向上する点にある。一
方、バークシャー種は大ヨークシャーやランドレースと
いった白色品種よりも産子数が少なく、肥育に時間がか
かるため、経済性で劣る。

【０１２０】MC1-Rとc-KIT遺伝子を品種識別に用いた場
合、LWDの三元交雑の豚肉では、MC1-R遺伝子のコドン11
9、159、238番で制限酵素多型が生じるため、デュロッ
ク種の関与を識別できる。また、c-KIT遺伝子の1313番
目の塩基でも多型が生じるため、白色品種の関与も識別
できる。

【０１２１】偽黒豚を生産する場合、経済性を考慮し
て、大ヨークシャー種（L）とランドレース種（W）の雑
種を子取りメス豚とし、バークシャー種（D）を種オス
豚に用いる三元交雑（（LW）B）とする可能性が高い。
この場合、豚肉ではMC1-R遺伝子について、白色品種と
バークシャー種で同じ配列のため、識別が不可能である
が、c-KIT遺伝子を用いると、1313番目の塩基で多型が
生じるため、白色品種の関与を識別できる。

【０１２２】

【発明の効果】本発明により、ブタの品種の識別方法が
提供される。本発明の方法は、白色品種（ランドレー
ス、大ヨークシャー）、デュロック種（茶色）、バーク
シャー種（六白）、黒地白ベルト種および黒色種（メイ
シャン、モンカイ）を識別するために有用である。ま
た、ブタ肉において、純粋種（白色品種（ランドレー
ス、大ヨークシャー）、デュロック種（茶色）、バーク
シャー種（六白）、ハンプシャー種および黒色種（メイ
シャン、モンカイ））と三元交雑を識別するために有用
である。

【０１２３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Society for Techno-Innovation of Agriculture, Forestry and Fisheri es The Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan Mitushashi, Tadayoshi <120> A method for discriminating a breed big by RFLP <130> P99-0289 <140> <141> <160> 35 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 ggccccagtg cctggaggtg tccat 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 cagaggaaga agacgcccag caggat 26 <210> 3 <211> 613 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 tcccgacggg ctcttcctca gcctggggct ggtgagcctc gtggagaacg tgctggtggt 60 ggccgccatc gccaagaacc gcaacctgca ctcgcccatg tactacttcg tctgctgcct 120 ggccgtgtcg gacctgctgg tgagcgtgag caacgtgctg gagacggccg tgctgctgct 180 gctggaggcg ggcgccctgg ccgcccaggc cgccgtggtg cagcagctgg acaatgtcat 240 ggacgtgctc atctgcggct ccatggtgtc cagcctctgc ttcctgggcg ccatcgccgt 300 ggaccgctac gtgtccatct tctacgcgct gcgctaccac agcatcgtga cgctgccccg 360 cgtggggcgg gccatcgcgg ccatctgggc gggcagcgtg ctctccagca ccctcttcat 420 cgcctactac caccacacgg ccgtcctgct gggcctcgtc agcttcttcg tggccatgct 480 ggcgctcatg gcggtactgt acgtccacat gctggcccgg gcctgccagc acggccggca 540 catcgcccgg ctccacaaga cgcagcaccc cacccgccag ggctgcggcc tcaagggcac 600 ggccaccctc acc 613 <210> 4 <211> 613 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 4 tcccgacggg ctcttcctca gcctggggct ggtgagcctc gtggagaacg tgctggtggt 60 ggccgccatc gccaagaacc gcaacctgca ctcgcccatg tactacttcg tctgctgcct 120 ggccgtgtcg gacctgctgg tgagcgtgag caacgtgctg gagacggccg tgctgctgct 180 gctggaggcg ggcgccctgg ccgcccaggc cgccgtggtg cagcagctgg acaatgtcat 240 gaacgtgctc atctgcggct ccatggtgtc cagcctctgc ttcctgggcg ccatcgccgt 300 ggaccgctac gtgtccatct tctacgcgct gcgctaccac agcatcgtga cgctgccccg 360 cgcggggcgg gccatcgcgg ccatctgggc gggcagcgtg ctctccagca ccctcttcat 420 cgcctactac caccacacgg ccgtcctgct gggcctcgtc agcttcttcg tggccatgct 480 ggcgctcatg gcggtactgt acgtccacat gctggcccgg gcctgccagc acggccggca 540 catcgcccgg ctccacaaga cgcagcaccc cacccgccag ggctgcggcc tcaagggcgc 600 ggccaccctc acc 613 <210> 5 <211> 613 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 5 tcccgacggg ctcttcctca gcctggggct ggtgagcctc gtggagaacg tgctggtggt 60 ggccgccatc gccaagaacc gcaacctgca ctcgcccatg tactacttcg tctgctgcct 120 ggccgtgtcg gacctgctgg tgagcgtgag caacgtgctg gagacggccg tgctgctgct 180 gctggaggcg ggcgccctgg ccgcccaggc cgccgtggtg cagcagctgg acaatgtcat 240 gaacgtgctc atctgcggct ccatggtgtc cagcctctgc ttcctgggcg ccatcgccgt 300 ggaccgctac gtgtccatct tctacgcgct gcgctaccac agcatcgtga cgctgccccg 360 cgcggggtgg gccatcgcgg ccatctgggc gggcagcgtg ctctccagca ccctcttcat 420 cgcctactac caccacacgg ccgtcctgct gggcctcgtc agcttcttcg tggccatgct 480 ggcgctcatg gcggtactgt acgtccacat gctggcccgg gcctgccagc acggccggca 540 catcgcccgg ctccacaaga cgcagcaccc cacccgccag ggctgcggcc tcaagggcgc 600 ggccaccctc acc 613 <210> 6 <211> 613 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 6 tcccgacggg ctcttcctca gcctggggct ggtgagcctc gtggagaacg tgctggtggt 60 ggccgccatc gccaagaacc gcaacctgca ctcgcccatg tactacttcg tctgctgcct 120 ggccgtgtcg gacctgctgg tgagcgtgag caacatgctg gagacggccg tgctgccgct 180 gctggaggcg ggcgccctgg ccgcccaggc cgccgtggtg cagcagctgg acaacgtcat 240 ggacgtgctc atctgcggct ccatggtgtc cagcctctgc ttcctgggcg ccatcgccgt 300 ggaccgctac gtgtccatct tctacgcgct gcgctaccac agcatcgtga cgctgccccg 360 cgcggggcgg gccatcgcgg ccatctgggc gggcagcgtg ctctccagca ccctcttcat 420 cgcctactac caccacacgg ccgtcctgct gggcctcgtc agcttcttcg tggccatgct 480 ggcgctcatg gcggtactgt acgtccacat gctggcccgg gcctgccagc acggccggca 540 catcgcccgg ctccacaaga cgcagcaccc cacccgccag ggctgcggcc tcaagggcgc 600 agccaccctc acc 613 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 7 catcgccaag aaccgcaac 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 8 acgaagaagc tgacgaggc 19 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 9 tcatacatag aacgagatgt gactcctgcc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA 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tagagagaga atgattttaa 420 cagcaaaagg agggggaact tcgtgtagtt gcaatactca gtgaagcctg tgcctgggtc 480 tttttgaagt tagacctcaa atattgcata gatgctttag gaagtgtgat cggggcaggg 540 aatcaagaaa aagtaattaa cagttgataa ggagattggg gatggaagag aatgatggaa 600 ccaaaacaag gagccagggc tcttagaagg gtaagaggaa ttcattagaa aatggggctc 660 acagaataga atgtggttac agatcttacc ctctcgtgtc cttggtgaca tttccaaaca 720 attgccaaac taaacgaggt tttaggatag ctgaaatcaa gagcctcttc cccatgtcct 780 tgagaggtgt caaactgaag ttgcaaacat tttagaaact ctttagaaaa agaccttcaa 840 agagaaacat gcaaaatgag ttttccattt taaaaaaatg atacgactgt ttatcacgta 900 ttttcctatg aatgaaagca gtcctaagaa gaaaaaagca tttatctgag ttggtttcaa 960 aagcgattat agcaattaaa gtcctcacga tgtgaaatac acatttgaac atcattcaca 1020 gcgcaatttg gatgtttatt tttggtgcac cgaatagttt aagtgtaaag caaaaatatt 1080 ggcaccatat aacataggca gcattctagc attaaacata gctttccctc ttgaaaagtt 1140 taaaataaat ttcagtggtt ttcttttgtc cccccgactc tcctaacagt gtattcacag 1200 agacttggcg gccagaaata tcctccttac tcatggtcga atcacaaaga tttgtgattt 1260 tggtctagcc agagacatca agaatgattc taattacgtg gtcaaaggaa acgtgagtac 1320 ccacgctctc ctgacagtcc cgtgaaggat tttccttgca ggttttctta agtattgttt 1380 tttgtgagtt tcataatgca caccctacct ttgccatacc atgcatttta gccgtcagat 1440 gaagtgtact tttgcaaaat tccgataata gaattcctag ttctaattgt gtaattagag 1500 ggcatgcaaa ggaaacagaa atagccttca ttttctttat agcctgagaa cagcaatgaa 1560 ctcaatttcg ttcaagtgaa acaaatgtgg acctgaaggt cacagcaggg gaattttatt 1620 ttgagattga cgtgctaggt gagaaagatt aaaatcgaag ataatgctca gaattaggcg 1680 tctagaatgt tggcgcttag aatcaaagag agcttattaa agacgttcgt aagtaataat 1740 tggcttatgg agcagagcga ttttacttca aagtgctttt atttcattgc cacttttcat 1800 tgtctcatca gaataacccc ttggcattgg aatgcaatgt cttcacagtt taagagttgg 1860 agaaactaaa agcccagtgt cttttagtga tggctgtctg agatgacata ggtcggtaga 1920 ggctgaaacc agagcctatg acttttcaga gccatatccc atgagtatgg gaagctgaag 1980 ggcccaaaca ccctctgcat ctgttttccc agccccatag ctccagtcca gaggtcttcc 2040 tggaggtggc tatttgcgtg ccttaccatg atgtcccatt tccttctcca tcactatggc 2100 atctctgtgg ctgagctgta caagacttgg ttttgtagaa atgtggctgg gtttacttcc 2160 tgatggcagc atgcatgtct aataactctg aggctgggag tgttaataac gccaaatcct 2220 ctccttcccg gtgcactctt gggaggaaga atgagtattg gaaggaagca tggatgaatg 2280 atgggtactt ccccgtccag gcctttgaac atccacaaag gggtaatggg ttctggaccc 2340 agtcttgctg agatcaaatc tggttctgtc attcagcgct ctgatgtttg gcaaggattt 2400 ccccaatacc tctgaacctt agttttttcc tccatttggt aataatacgg tcacctgcct 2460 cctgaagttg tcgtgatgat taacacaata tagataaaat gctgggagca gcgtcaggta 2520 ccttgtggct aatactccag tggcacttac tactctagct attctttttt tgctgcacct 2580 gtggcaggtg gaatttcccg ggccagggat agaacctggg ccacaggagt gtagcgactc 2640 aagctgctgc tgtgacagtg tcagatcctt aaccctctgt accacaagca aactcctgag 2700 atctctgttt taaatgcatc aaataaaata cacagaagta ccaagaaaag ctgtcaaatt 2760 gaaatgcagt tattaaaata tagaaagtac ctctgtgata ctcatttcat gtgcttcttt 2820 gttgcaaaga ataacaagta ccagtggtgg gtctaacagc tgctatcaaa gtaatgaata 2880 taaaaataga gttccctcgt ggcctaacag ttagggtttg tgcattgtca 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gatggaagag aatgatggaa 600 ccaaaacaag gagccagggc tcttagaagg gtaagaggaa ttcattagaa aatggggccc 660 acagaataga atgtggttac agatcttacc ctctcgtgtc cttggtgaca tttccaaaca 720 attgccaaac taaacgaggt tttaggatag ctgaaatcaa gagcctcttc cccatgtcct 780 tgagaggtgt caaactgaag ttgcaaacat tttagaaact ctttagaaaa agaccttcaa 840 agagaaacat gcaaaatgag ttttccattt taaaaaaatg atacgactgt ttatcacgta 900 ttttcctatg aatgaaagca gtcctaagaa gaaaaaagca tttatctgag ttggtttcaa 960 aagcgattat agcaattaaa gtcctcacga tgtgaaatac acatttgaac atcattcaca 1020 gcgcaatttg gatgtttatt tttggtgcac cgaatagttt aagtgtaaag caaaaatatt 1080 ggcaccatat aacataggca gcattctagc attaaacata gctttccctc ttgaaaagtt 1140 taaaataaat ttcagtggtt ttcttttgtc cccccgactc tcctaacagt gtattcacag 1200 agacttggcg gccagaaata tcctccttac tcatggtcga atcacaaaga tttgtgattt 1260 tggtctagcc agagacatca agaatgattc taattacgtg gtcaaaggaa acgtgagtac 1320 ccacgctctc ctgacagtcc cgtgaaggat tttccttgca ggttttctta agtattgttt 1380 tttgtgagtt tcataatgca caccctacct ttgccatacc atgcatttta gccgtcagat 1440 gaagtgtact tttgcaaaat tccgataata gaattcctag ttctaattgt gtaattagag 1500 ggcatgcaaa ggaaacagaa atagccttca ttttctttat agcctgagaa cagcaatgaa 1560 ctcaatttcg ttcaagtgaa acaaatgtgg acctgaaggt cacagcaggg gaattttatt 1620 ttgagattga cgtgctaggt gagaaagatt aaaatcgaag ataatgctca gaattaggcg 1680 tctagaatgt tggcgcttag aatcaaagag agcttattaa agacgttcgt aagtaataat 1740 tggcttatgg agcagagcga ttttacttca aagtgctttt atttcattgc cacttttcat 1800 tgtctcatca gaataacccc ttggcattgg aatgcaatgt cttcacagtt taagagttgg 1860 agaaactaaa agcccagtgt cttttagtga tggctgtctg agatgacata ggtcggtaga 1920 ggctgaaacc agagcctatg acttttcaga gccatatccc atgagtatgg gaagctgatg 1980 ggcccaaaca ccctctgcat ctgttttccc agccccatag ctccagtcca gaggtcttcc 2040 tggaggtggc tatttgcgtg ccttaccatg atgtcccatt tccttctcca tcactatggc 2100 atctctgtgg ctgagctgta caagacttgg ttttgtagaa atgtggctgg gtttacttcc 2160 tgatggcagc atgcatgtct aataactctg aggctgggag tgttaataac gccaaatcct 2220 ctccttcccg gtgcactctt gggaggaaga atgagtattg gaaggaagca 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tgccatttct 3120 tgggccaccc ctgtggcata tggatattcc caggctaggg gtctaattgg agctgtagcc 3180 accggcctat gccacagcca tagccacgca ggatctgagc agcgtctgca acctacacca 3240 cagctcacgg caacgccgga tccttaagcc actgagcaag gccagggatt gaacctacaa 3300 cctcatggtt cctagttgga tttgttaacc actgcgccac gacaggaact ccaatgtctc 3360 catcttgaaa atggggacag ttcaccgttg accactgacc cacacagggg tgaatctcca 3420 tataacttag agccagccct ccatacgtga ggctcctcca catccttgga tccaaccaac 3480 cgcagacagt gtggcattta tcattgaaaa atattcacat gtaagtggac tcatgcagct 3540 taaaccctgg ttgttcaaga gtcaactata cttgtgaccc acgtatttca gaagcagtca 3600 gggtcatcca aggtcatggc tcaaaggact ttgtgagatg cccgtcaagt tctcaccccc 3660 acctcacagc aggagcagta tctacaggaa tattttggag cttcgtaatg aacattgctg 3720 actcccctgt gcttccactg caggctcggc tacccgtgaa gtggatggca cccgagagca 3780 ttttcaactg tgtctacaca tttgaaagcg atgtctggtc ctatgggatt tttctgtggg 3840 agctcttctc tttaggtaaa atgcaccttg ccaaaggcac ctcagttaga ctctgggcat 3900 cttctttaag atgttcccat tgtcctgctg gctgcctgtg acactgattt 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gtcaactata cttgtgaccc acgtatttca gaagcagtca 3600 gggtcatcca aggtcatggc tcaaaggact ttgtgagatg cccgtcaagt tctcaccccc 3660 acctcgcagc aggagcagta tctacaggaa tattttggag cttcataatg aacattgctg 3720 actcccctgt gcttccactg caggctcggc tacccgtgaa gtggatggca cctgagagca 3780 ttttcaactg tgtctacaca tttgaaagcg atgtctggtc ctatgggatt tttctgtggg 3840 agctcttctc tttaggtaaa atgcaccttg ccaaaggcac ctcagttaga ctctgggcat 3900 cttctttaag atgttcccat tgtcctgctg gctgcctgtg acactgattt gcaaaccctt 3960 tgtgcctcag ggagcagccc ctaccc 3986 <210> 32 <211> 3985 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 32 atcatggaag atgatgagtt ggccctagac ctggaggact tgctcagctt ttcttaccaa 60 gtggcaaagg gcatggcctt cctcgcctcg aagaatgtaa gtggaggtga ttctcatgga 120 ggtgattttc ggaagattcc tctccccacc cccaccgccc ccaaggagca ttttagagcc 180 gtagttagaa agcagagtgc catttgcagt gtggtaacca aaagcagagg aaatagagtt 240 tcttcatgtt ccaactgctg tctctttgga attcttgttc tcatttataa gccttaaagt 300 gcacgcctgt ctaaatgagc tttctatgaa tatatttttt tatatgcaat gaattcattt 360 aaaacttggc ttttaggata taggagctgc tcttagatca tagagagaga atgattttaa 420 cagcaaaagg agggggaact tcgtgtagtt gcaatactca gtgaagcctg tgcctgggtc 480 tttttgaagt tagacctcaa atattgcata gatgctttag gaagtgtgat cggggcaggg 540 aatcaagaaa aagtaattaa cagttgataa ggagattggg gatggaagag aatgttggaa 600 ccaaaacaag gagccagggc tcttagaagg gtaagaggaa ttcattagaa aatggggctc 660 acagaataga atgtggttac agatcttacc ctctcgtgtc cttggtgaca tttccaaaca 720 attgccaaac taaacgaggt tttaggatag ctgaaatcaa gagcctcttc cccatgtcct 780 tgagaggtgt caaactgaag ttgcaaacat tttagaaact ctttagaaaa agaccttcaa 840 agaaaaacat gcaaaatgag ttttccattt taaaaaaatg atacgactgt ttatcacgta 900 ttttcctatg aatgaaagca gtcctaagaa gaaaaaagca tttatctgag ttggtttcga 960 aagcgattat agcaattaaa gtcctcacga tgtgaaatac acatttgaac atcattcaca 1020 gcgcaatttg gatgtttatt tttggtgcac cgaatagttt aagtgtaaag caaaaatatt 1080 ggcaccatat aacataggca gcattctagc attaaacata gctttccctc ttgaaaagtt 1140 taaaataaat ttcagtggtt ttcttttgtc cccccgactc tcctaacagt gtattcacag 1200 agacttggcg gccagaaata tcctccttac tcatggtcga atcacaaaga tttgtgattt 1260 tggtctagcc agagacatca agaatgattc taattacgtg gtcaaaggaa acgtgagtac 1320 ccacgctctc ctgacagtcc cgtgaaggat tttccttgca ggttttctta agtattgttt 1380 tttgtgagtt tcataatgca caccctacct ttgccatacc atgcatttta gccgtcagat 1440 gaagtgtact tttgcaaaat tccgataata gaattcctag ttctaattgt gtaattagag 1500 ggcatgcaaa ggaaacagaa atagccttca ttttctttat agcctgagaa cagcaatgaa 1560 ctcaatttcg ttcaagtgaa acaaatgtgg acctgaaggt cacagcaggg gaattttatt 1620 ttgagattga catgctaggt gagaaagatt aaaatcgaag ataatgctca gaattaggcg 1680 tctagaatgt tggcgcttag aatcaaagag agcttattaa agacgttcgt aagtaataat 1740 tggcttatgg agcagagcga ttttacttca aagtgctttt atttcattgc cacttttcat 1800 tgtctcatca gaataacccc ttggcattgg aatgcaatgt cttcacagtt taagagttgg 1860 agaaactaaa agcccagtgt cttttagtga tggctgtctg agatgacata ggtcggtaga 1920 ggctgaaacc agagcctatg acttttcaga gccatatccc atgagtatgg gaagctgatg 1980 ggcccgaaca ccctctgcat ctgttttccc agccccatag ctccagtcca gaggtcttcc 2040 tggaggtggc tatttgcgtg ccttaccatg atgtcccatt tccttctcca tcactatggc 2100 atctctgtgg ctgagctgta caagacttgg ttttgtagaa atgtggctgg gtttacttcc 2160 tgatggcagc atgcatgtct aataactctg aggctgggag tgttaataac gccaaatcct 2220 ctccttcccg gtgcactctt gggaggaaga atgagtattg gaaggaagca tggatgaatg 2280 atgggtactt ccccatccag gcctttgaac attaacaaag gggtaatggg ttctggaccc 2340 agtcttgctg agatcaaatt tggttctgtc attcagcgct ctgatgtttg gcaaggattt 2400 ccccaatacc tctgaacctt agttttttct ccatttggta ataatacagt cacctgcctc 2460 ctgaagttgt cgtgatgatt aacacaatat agataaaatg ctgggagcag cgtcaggtac 2520 cttgtggcta atactccagt ggcacttact actctagcta ttcttttttt gctgcacctg 2580 tggcaggtgg aatttcccgg gccagggatg gaacctgggc tacaggagtg tagcgactca 2640 agctgctgct gtgacagtgt cggatcctta acgctctgca ccacaagcaa actcctgaga 2700 tctctgtttt aaatgtatca aataaaatac acagaagtac caagaaaagc tgtcaaattg 2760 aaatgcagtt attaaaatat agaaagtacc tctgtgatac tcatttcatg tgcttctttg 2820 ttgcaaagaa tagcaagttc cagtggtggg tctaacagct gctatcaaag taatgaatat 2880 aaaaatagag ttccctcgtg gcctaacagt tagggtttgt gcattgtcac tgctgtggct 2940 caggttcatc ccttggccct gctggaactt ctgcttgctg cgggcacagc cagtggtgga 3000 gtctgggtca gaacccccgt gtctgtctct gacatctgtg ctccaaaaga ctacgctgta 3060 gagcctcaat gtctccatct tttttgtttg tttgtttgtt ttggcttttt gccatttctt 3120 gggccacccc tgtggcatat ggatattccc aggctagggg tctaattgga gctgtagcca 3180 ccggcctatg ccacagccat agccacgcag gatctgagcc gcgtctgcaa cctacaccac 3240 agctcacggc aacgccggat ccttaagcca ctgagcaagg ccagggattg aacccacaac 3300 ctcatggttc ctagtcggat tcgttaacca ctgcgccacg acaggaactc caatgtctcc 3360 atcttgaaaa ttgggacagt tcaccgttga ccactgaccc acacaggggt gaatctccgt 3420 ataacttaga gccagccctc catacgtgag gctcctccac atccttggat ccaaccaacc 3480 acagacagtg tggcatttat cattgaaaaa tattcacatg taagtggact catgcagctt 3540 aaaccctggt tgttcaagag tcaactatac ttgtgaccca cgtatttcag aagcattcag 3600 ggtcatccaa ggtcatggct caaaggactt tgtgagatgc ccgtcaagtt ctcaccccca 3660 cctcgcagca ggagcagtat ctacaggaat attttggagc ttcataatga acattgctga 3720 ctcccctgtg cttccgctgc aggctcggct acccgtgaag tggatggcac ccgagagcat 3780 tttcaactgt gtctacacat ttgaaagcga tgtctggtcc tatgggattt ttctgtggga 3840 gctcttctct ttaggtaaaa tgcaccttgc caaaggcacc tcagttagac tctgggcatc 3900 ttctttaaga tgttcccatt gtcctgctgg ctgcctgtga cactgatttg caaacccttt 3960 gtgcctcagg gagcagcccc taccc 3985 <210> 33 <211> 3985 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 33 atcatggaag atgatgagtt ggccctagac ctggaggact tgctcagctt ttcttaccaa 60 gtggcaaagg gcatggcctt cctcgcctcg aagaatgtaa gtggaggtga ttctcatgga 120 ggtgattttc ggaagattcc tctccccacc cccaccgccc ccaaggagca ttttagagcc 180 gtagttagaa agcagagtgc catttgcagt gtggtaacca aaagcagagg aaatagagtt 240 tcttcatgtt ccaactgctg tctctttgga attcttgttc tcatttataa gccttaaagt 300 gcacgcctgt ctaaatgagc tttctatgaa tatatttttt tatatgcaat gaattcattt 360 aaaacttggc ttttaggata taggagctgc tcttagatca tagagagaga atgattttaa 420 cagcaaaagg agggggaact tcgtgtagtt gcaatactca gtgaagcctg tgcctgggtc 480 tttttgaagt tagacctcaa atattgcata gatgctttag gaagtgtgat cggggcaggg 540 aatcaagaaa aagtaattaa cagttgataa ggagattggg gatggaagag aatgatggaa 600 ccaaaacaag gagccagggc tcttagaagg gtaagaggaa ttcattagaa aatggggctc 660 acagaataga atgtggttac agatcttacc ctcttgtgtc cttggtgaca tttccaaaca 720 attgccaaac taaacgaggt tttaggatag ctgaaatcaa gagcctcttc cccatgtcct 780 tgagaggtgt caaactgaag ttgcaaacat tttagaaact ctttagaaaa agaccttcaa 840 agagaaacat gcaaaatgag ttttccattt taaaaaaatg atacgactgt ttatcacgta 900 ttttcctatg aatgaaagca gtcctaagaa gaaaaaagca tttatctgag ttggttttga 960 aagcgattat agcaattaaa gtcctcacga tgtgaaatac acatttgaac atcattcaca 1020 gcgcaatttg gatgtttatt tttggtgcac cgaatagttt aagtgtaaag caaaaatatt 1080 ggcaccatat aacataggca gcattctagc attaaacata gctttccctc ttgaaaagtt 1140 taaaataaat ttcagtggtt ttcttttgtc cccccgactc tcctaacagt gtattcacag 1200 agacttggcg gccagaaata tcctccttac tcatggtcga atcacaaaga tttgtgattt 1260 tggtctagcc agagacatca agaatgattc taattacgtg gtcaaaggaa acgtgagtac 1320 ccacgctctc ctgacagtcc cgtgaaggat tttccttgca ggttttctta agtattgttt 1380 tttgtgagtt tcataatgca caccctacct ttgccatacc atgcatttta gccgtcagat 1440 gaagtgtact tttgcaaaat tccgataata gaattcctag ttctaattgt gtaattagag 1500 ggcatgcaaa ggaaacagaa atagccttca ttttctttat agcctgagaa cagcaatgaa 1560 ctcaatttcg ttcaagtgaa acaaatgtgg acctgaaggt cacagcaggg gaattttatt 1620 ttgagattga catgctaggt gagaaagatt aaaatcgaag ataatgctca gaattaggcg 1680 tctagaatgt tggcgcttag aatcaaagag agcttattaa agacgttcgt aagtaataat 1740 tggcttatgg agcagagcga ttttacttca aagtgctttt atttcattgc cacttttcat 1800 tgtctcatca gaataacccc ttggcattgg aatgcagtgt cttcacagtt taagagttgg 1860 agaaactaaa agcccagtgt cttttagtga tggctgtctg agatgacata ggtcggtaga 1920 ggctgaaacc agagcctatg acttttcaga gccatatccc atgagtatgg gaagctgatg 1980 ggcccgaaca ccctctgcat ctgttttccc agccccatag ctccagtcca gaggtcttcc 2040 tggaggtggc tatttgcgtg ccttaccatg atatcccatt tccttctcca tcactatggc 2100 atctctgtgg ctgagctgta caagacttgg ttttgtagaa atgtggctgg gtttacttcc 2160 tgatggcagc atgcatgtct aataactctg aggctgggag tgttaataac gccaaatcct 2220 ctccttcccg gtgcactctt gggaggaaga atgagtattg gaaggaagca tggatgaatg 2280 atgggtactt ccccatccag gcctttgaac attaacaaag gggtaatggg ttctggaccc 2340 agtcttgctg agatcaaatc tggttctgtc attcagcgct ctgatgtttg gcaaggattt 2400 ccccaatacc tctgaacctt agttttttct ccatttggta ataatacagt cacctgcctc 2460 ctgaagttgt cgtgatgatt aacacaatat agataaaatg ctgggagcag cgtcaggtac 2520 cttgtggcga atactccagt ggcacttact actctagcta ttcttttttt gctgcacctg 2580 tggcaggtgg aatttcccgg gccagggatg gaacctgggc tacaggagtg tagcgactca 2640 agctgctgct gtgacagtgt cggatcctta accctctgca ccacaagcaa actcctgaga 2700 tctctgtttt aaatgtatca aataaaatac acagaagtac caagaaaagc tgtcaaattg 2760 aaatgcagtt attaaaatat agaaagtacc tctgtgatac tcatttcatg tgcttctttg 2820 ttgcaaagaa taacaagttc cagtggtggg tctaacagct gctatcaaag taatgaatat 2880 aaaaatagag ttccctcgtg gcctaacagt tagggtttgt gcattgtcac tgctgtggct 2940 caggttcatc ccttggccct gctggaactt ctgcttgctg cgggcacagc cagtggtgga 3000 gtctgggtca gaacccccgt gtctgtctct gacatctgtg ctccaaaaga ctacgctgta 3060 gagcctcaat gtctccatct tttttgtttg tttgtttgtt ttggcttttt gccatttctt 3120 gggccacccc tgtggcatat ggatattccc aggctagggg tctaattgga gctgtagcca 3180 ccggcctatg ccacagccat agccacgcag gatctgagcc gcgtctgcaa cctacaccac 3240 agctcacggc aacgccggat ccttaagcca ctgagcaagg ccagggattg aacccacaac 3300 ctcatggttc ctagtcggat tcgttaacca ctgcgccacg acaggaactc caatgtctcc 3360 atcttgaaaa ttgggacagt tcaccgttga ccactgaccc acacaggggt gaatctccgt 3420 ataacttaga gccagccctc catacgtgag gctcctccac atccttggat ccaaccaacc 3480 acagacagtg tggcatttat cattgaaaaa tattcacatg taagtggact catgcagctt 3540 aaaccctggt tgttcaagag tcaactatac ttgtgaccca cgtatttcag aagcattcag 3600 ggtcatccaa ggtcatggct caaaggactt tgtgagatgc ccgtcaagtt ctcaccccca 3660 cctcgcagca ggagcagtat ctacaggaat attttggagc ttcataatga acattgctga 3720 ctcccctgtg cttccactgc aggctcggct acccgtgaag tggatggcac ccgagagcat 3780 tttcaactgt gtctacacat ttgaaagcga tgtctggtcc tatgggattt ttctgtggga 3840 gctcttctct ttaggtaaaa tgcaccttgc caaaggcacc tcagttagac tctgggcatc 3900 ttctttaaga tgttcccatt gtcctgctgg ctgcctgtga cactgatttg caaacccttt 3960 gtgcctcagg gagcagcccc taccc 3985 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 34 acatgcaaaa tgagttttcc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 35 actcacaaaa aacaatactt a 21

【０１２４】

【配列表フリーテキスト】 配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号７：合成DNA 配列番号８：合成DNA 配列番号９：合成DNA 配列番号10：合成DNA 配列番号11：合成DNA 配列番号12：合成DNA 配列番号13：合成DNA 配列番号14：合成DNA 配列番号15：合成DNA 配列番号16：合成DNA 配列番号17：合成DNA 配列番号18：合成DNA 配列番号19：合成DNA 配列番号20：合成DNA 配列番号21：合成DNA 配列番号22：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】各ブタ品種におけるMC1-R遺伝子の制限酵素部
位を示す図である。

【図２】各ブタ品種におけるc-KIT遺伝子の重複の有無
を示す図である

【図３】PCR-RFLPによる豚肉の品種判定の例を示す図で
ある。

【図４】各ブタ品種のMC1-R遺伝子のPCR-RFLPを示す写
真である。左から各制限酵素HhaI、MaeII、NlaIIIによ
る消化断片を示す。

【図５】各ブタ品種のMC1-R遺伝子のPCR-RFLPを示す写
真である。制限酵素RcaIによる消化断片を示す。

【図６】各ブタ品種のc-KIT遺伝子のPCR-RFLPを示す写
真である。制限酵素NlaIIIによる消化断片を示す。

【図７】各ブタ品種のc-KIT遺伝子のPCR-RFLPを示す写
真である。制限酵素Csp45Iによる消化断片を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 奥村 直彦 茨城県つくば市二の宮２丁目７−２ サ ンシティ二の宮101号 (56)参考文献 国際公開99／20795（ＷＯ，Ａ１) Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８ ［８］（1998）ｐ．826−833 Ｔｅｃｈｎｏ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏ ｎ，９［33］（1999．Ｍａｒ．31発行, 1999．Ｏｃｔ．27頒布）ｐ．４，５，57 −59 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハンプシャー種、バークシャー種、メイ
   シャン種、モンカイ種及びデュロック種からなるブタ有
   色種並びにランドレース種及び大ヨークシャー種からな
   るブタ白色種から抽出したメラニン細胞刺激ホルモン受
   容体遺伝子であって配列番号３〜６に示される塩基配列
   又はその部分配列を有するものから選択される少なくと
   も１つを、少なくとも1種類の制限酵素で処理し、得ら
   れるDNA断片について制限酵素断片長多型分析を行っ
   て、ハンプシャー種及びバークシャー種並びに白色種か
   らなる群と、メイシャン種及びモンカイ種からなる群
   と、デュロック種からなる群とを相互に識別し、かつ、
   前記有色種及び白色種から抽出したc-KIT遺伝子であっ
   て配列番号23〜33に示される塩基配列又はその部分配列
   を有するものから選択される少なくとも１つを、少なく
   とも1種類の制限酵素で処理し、得られるDNA断片につい
   て制限酵素断片長多型分析を行って、白色種と有色種と
   を識別することにより、ハンプシャー種及びバークシャ
   ー種からなる群と、メイシャン種及びモンカイ種からな
   る群と、デュロック種からなる群と、白色種とを識別す
   ることを特徴とするブタの品種識別方法。
2. 【請求項２】 さらに配列番号24若しくは32に示す塩基
   配列又はその部分配列、及び配列番号31に示す塩基配列
   又はその部分配列を制限酵素SmaIで処理し、得られるDN
   A断片について制限酵素断片長多型分析を行って、バー
   クシャー種とハンプシャー種とを識別することを特徴と
   する請求項1記載の品種識別方法。
3. 【請求項３】 制限酵素が、MaeII、RcaI、HhaI、NlaII
   I、Csp45I、DpnI、DpnII、MboI、Sau3AI、TaqI、TthHB8
   I、NspI、NspHI、EcoRV、MseI、BslI、HaeII、CfoI、Hi
   nPI、Aor51HI、Eco47III、BsaJI、EcoT14I、StyI、Mnl
   I、BstEII、BstPI、Eco065I、HapII、HpaII、MspI、Sma
   I、XmaI、PspAI、Cfr9I、AsuI、Cfr13I、San96I、Bcn
   I、BstNI、Bst0I、EcoRII、HaeIII、PalI、SfcI、BamH
   I、NlaIV、AlwI、AfaI、RsaI、EcoT22I、NsiI、SfaNI、
   ScrFI、MvaI、AccII、AciI、BstVI、Bsh1236I、HinfI、
   TfiI、HincII、HindII、BsmI、Fnu4HI、AvaI、DdeI、Ap
   aI、BsiCI、BstBI、NspV及びAlwNI並びにこれらの制限
   酵素のイソチゾマーからなる群から選択される少なくと
   も1種である請求項1記載の識別方法。
4. 【請求項４】 配列番号7及び8に示される塩基配列を有
   するプライマーセットと、制限酵素 MaeII、RcaI、Hha
   I、NlaIII、AccII及びAciI並びにこれらの制限酵素のイ
   ソチゾマーからなる群から選択される少なくとも1種の
   制限酵素とを含む、ブタの品種識別用キット。
5. 【請求項５】 配列番号34及び35に示される塩基配列を
   有するプライマーセットと、制限酵素 NlaIII、TaqI及
   びCsp45I並びにこれらの制限酵素のイソチゾマーからな
   る群から選択される少なくとも1種の制限酵素とを含
   む、ブタの品種識別用キット。