WO2005108569A1 - 豚の種別の判別法 - Google Patents

豚の種別の判別法 Download PDF

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WO2005108569A1
WO2005108569A1 PCT/JP2004/006253 JP2004006253W WO2005108569A1 WO 2005108569 A1 WO2005108569 A1 WO 2005108569A1 JP 2004006253 W JP2004006253 W JP 2004006253W WO 2005108569 A1 WO2005108569 A1 WO 2005108569A1
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polymorphism
kit
oligonucleotide
pig
nucleic acid
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PCT/JP2004/006253
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Shogo Moriya
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Nisshinbo Industries, Inc.
Genetic Id (Japan), Inc.
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for easily discriminating pig breeds.
  • pork is bred mainly by large Yorkshire, Landrace, Durok, Berkshire, Hampshire, Meishan, Monkai, etc., and their crossbreeding. .
  • Berkshire varieties are called black pigs, and are traded at high prices due to their high quality.
  • An object of the present invention is to provide a method and a kit which are simple, suitable for processing multiple samples, and are capable of performing high-precision determination on a single sample in a single test, when determining the type of pig. You.
  • the present inventors have conducted studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a novel polymorphism suitable for discrimination of pig type has been found in the KIT gene, which is a kind of stem cell growth factor receptor gene. I found that it exists. Then, they found that the combination with a known polymorphism of the KIT gene or a polymorphism in the melanocyte stimulating hormone receptor gene (MC1R gene) can determine the type of a subject pig with high accuracy. The present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a polymorphism comprising one or more capture oligonucleotides, and a polymorphism or a combination thereof detected by hybridization of these capture oligonucleotides and a nucleic acid derived from a subject pig
  • a kit comprising an oligonucleotide capable of detecting a polymorphism at one or both of the positions.
  • the capture oligonucleotide in the nucleotide sequence of the KIT gene, 398, 549, 595, 659, 844, 884, 959, 1313, 1342, 1632, 1724, 1986, 2179, 2295, 2313, 2314, 2360, 2377, 2391, 2429, 2449, 2470, 2472, 2600, 2611, 2622, 26 63 , 2674, 2680, 2717, 2834, 2840, 2899, 3020, 3049 , 3207, 3221, 3258, 3296, 3317, 3323, 3341, 3373, 3387, 3420, 3482, 3597, 3666, 3705, 3737, 3773, The kit according to (1) or (2), further comprising an oligonucleotide capable of detecting a polymorphism at one or more positions selected from positions 3884, 3885, 3886, and 3887.
  • the capture oligonucleotide includes an oligonucleotide capable of detecting a polymorphism at one or more positions in a melanocyte stimulating hormone receptor gene (hereinafter, referred to as “MC1R gene”).
  • M1R gene melanocyte stimulating hormone receptor gene
  • the capture oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary or homologous to the nucleotide sequence of the region containing the polymorphic site, and is 1040 nucleotides in length (1).
  • oligonucleotide according to (7) having a nucleotide sequence complementary or homologous to the nucleotide sequence of the region containing the polymorphic site, and having a length of 10 to 40 nucleotides.
  • the nucleic acid derived from the test pig is hybridized with the capture oligonucleotide contained in the kit according to any one of (1) to (6), and the capture oligonucleotide is tested for each capture oligonucleotide.
  • a method for determining the type of a test pig by detecting the presence or absence of hybridization with a nucleic acid derived from the test pig and identifying a polymorphism in the nucleotide sequence of the test pig.
  • the method of the present invention is a method for detecting one or more polymorphisms in the KIT gene of a subject pig, and discriminating the type of the subject pig based on the detected polymorphism or a combination thereof.
  • a polymorphism is defined as including a polymorphism at one or both of the positions corresponding to positions 1159 and 1209 in the nucleotide sequence of the KIT gene based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Characteristic method. The method is specifically performed by, for example, hybridization using immobilized nucleic acid.
  • the kit of the present invention is a kit for carrying out the method of the present invention by such hybridization, and comprises a kit at one or both of the positions corresponding to positions 1159 and 1209. Oligonucleotides whose type can be detected are included as capture oligonucleotides.
  • the polymorphism is a novel polymorphism found by the present inventors.
  • the detection of polymorphism and the classification of pigs based on the results may be performed in combination with a known polymorphism of the KIT gene in addition to the above polymorphism. Furthermore, these polymorphisms may be combined with polymorphisms in the MC1R gene.
  • Polymorphisms in the KIT gene are as follows: 398th, 549th, 595th, 659th, 844th in the base sequence of the KIT gene based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polymorphism of the MC1R gene includes, as bases of the MC1R gene based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the positions 154, 176, 234, 241 and 241; Polymorphisms at positions corresponding to positions selected from positions 362, 367, 598, and 600 [0014]
  • the position of a polymorphism in a gene can be changed by insertion or deletion of a nucleotide in a sequence upstream of the position.
  • the “corresponding position” indicates the relative position in the reference sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, when the absolute position in the gene sequence is changed.
  • Specific examples of the mode of the polymorphism at the polymorphic position include a substitution of thymine at position 398 with cytosine, a substitution of adenine at position 549 with guanine at the position 549, an adenine force at position 595 of the KIT gene, Substitution of thymine at position 659, substitution of cytosine for thymine at position 659, substitution of guanine for adenine at position 844, substitution of cytosine for adenine at position 884, substitution of adenine for guanine at position 959, at position 1159 Thymine to cytosine substitution, cytosine force at position 1209, thymine substitution, guanine to adenine substitution at position 1313, guanine to adenine substitution at position 1342, guanine to adenine substitution at position 1632, Substitution of cytosine for thymine at position 1724, substitution of guanine for thymine
  • guanine is substituted with adenine at position 154, thymine is substituted with cytosine at position 176, thymine is substituted with cytosine at position 234, adenine is substituted with guanine at position 241, Substitution of cytosine for thymine at position 362, substitution of cytosine for thymine at position 367, substitution of guanine for adenine at position 598, and substitution of guanine for adenine at position 600.
  • Examples of combinations of polymorphisms other than positions 1159 and 1209 of the KIT gene detected in the present invention include the following combinations.
  • Examples of the polymorphism combinations of the MC1R gene detected in the present invention include the following combinations. [0029] (10) C367T
  • the determination of the pig species is performed by identifying the above polymorphism or a combination thereof.
  • Table 1 shows a list of polymorphisms of MC1R gene by pig type.
  • Table 2-3 shows a list of polymorphisms of the KIT gene by pig type.
  • four types of “white pigs” are listed. This means that the four types of white pigs were classified into four types when the polymorphic combinations were classified.
  • "polymorphism site" indicates a position based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 for MC1R, and a position based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 for KIT gene. Since both Landrace and Great Yorkshire are white, the following two species are collectively referred to as white pigs.
  • the polymorphism is detected using an oligonucleotide capable of detecting each polymorphism by hybridization.
  • an oligonucleotide is referred to as a capture oligonucleotide.
  • the capture oligonucleotide has a nucleotide sequence complementary or homologous to the nucleotide sequence of the region containing the polymorphic site.
  • the capture oligonucleotide is designed to include each polymorphic site present in each gene.
  • one capture oligonucleotide has a type-specific base sequence of two or more bases in one capture oligonucleotide.
  • the base length of the capture oligonucleotide is preferably 1040 bases. If the length is shorter than this, detection of hybridization becomes difficult, and if the length is longer, the difference in hybridization due to the type-specific sequence is reduced, and type determination may be difficult.
  • the length of the capture oligonucleotide mainly depends on the characteristics of the sequence such as the content of each base and the repetition of the same base. If there is a secondary structural disorder that is a factor that hinders hybridization, replacement of any base not related to the polymorphism of the gene with a spacer compound will result in hybridization.
  • the above obstacle can also be avoided by using an oligonucleotide having a reduced binding affinity. Examples of such spacer compounds include V, a nucleic acid skeleton, and the like, which do not have a complementary binding property to a base of a different kind.
  • Examples of the base sequence of the capture oligonucleotide are shown in SEQ ID NOs: 3-121.
  • the base sequence on the 5 ′ side and / or 3 ′ side of each base sequence is extended corresponding to the base sequence of the MC1R gene and KIT gene.
  • the capture oligonucleotide is preferably in the range of 1040 bases.
  • the capture oligonucleotide may be any of DNA, RNA, peptide nucleic acid, or locked nucleic acid.
  • the method for synthesizing the capture oligonucleotide can be carried out in the same manner as for a normal oligonucleotide, for example, by a method using a commercially available DNA synthesizer.
  • the designed capture oligonucleotide is used for research up to the time of filing. Power that is a good reflection of the results of the investigation. If additional information is subsequently obtained regarding the nucleotide sequence of the new haplotype, a new capture oligonucleotide based on the method described in the present application may be used. Will be designed. The use of such capture oligonucleotides is also included in the present invention as long as one of the positions corresponding to positions 1159 and 1209 of the KIT gene is detected.
  • the capture oligonucleotide and a nucleic acid derived from a subject pig (hereinafter, also referred to as “nucleic acid probe”) May be hybridized in a liquid, or either the capture oligonucleotide or the nucleic acid probe may be immobilized on a support.
  • a capture oligonucleotide or a nucleic acid probe can be immobilized as such a support, and can be used for hybridization with an analyte and a reaction step required for detection of a hybrid.
  • a support There is no particular limitation as long as it can withstand the above.
  • Specific examples of the material of such a support include plastics, inorganic polymers, metals, natural polymers, and ceramics.
  • plastics include polyethylene, polystyrene, polycarbonate, polypropylene, polyamide, phenol resin, epoxy resin, polycarboimide resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, polyfluoroethylene, polyimide, and acrylic resin. And the like.
  • the inorganic polymer include glass, quartz, carbon, silica gel, and dalaphite.
  • the metal include gold, platinum, silver, copper, iron, aluminum, a magnet, and a paramagnet.
  • Examples of the natural polymer include polyamino acids, cellulose, chitin, chitosan, alginic acid, and derivatives thereof.
  • the ceramic include apatite, alumina, silica, silicon carbide, silicon nitride, and boron carbide.
  • the shape of the capture oligonucleotide or the support used for immobilizing the analyte is not particularly limited as long as the capture oligonucleotide is immobilized.
  • Examples of the shape of such a support include a flat plate, a membrane, and fine particles.
  • a carrier that can directly immobilize the capture oligonucleotide or the nucleic acid probe on the support is supported on the support. Then, the capture oligonucleotide or the analyte may be immobilized on the support via the carrier.
  • the carrier itself may be a capture oligonucleotide or a capture oligonucleotide which may be capable of binding to the analyte or a capture oligonucleotide or a analyte via a ligand capable of binding to the analyte. May be immobilized.
  • ⁇ support '' refers to a water-soluble property used when immobilizing a capture oligonucleotide or a nucleic acid probe on a carrier, or when using a capture oligonucleotide or a nucleic acid probe-immobilized support for actual detection. It means that the carrier is not substantially detached from the support in various solvents such as a solvent and an organic solvent.
  • the carrier used in the present invention may be supported simply by using physical adhesiveness, or may be chemically bonded via a covalent bond or the like. It may be carried.
  • the carrier may be supported on the entire surface of the support, or may be supported on a part of the support, if necessary.
  • Examples of the carrier include low organic molecules, plastics, inorganic polymers, metals, natural polymers, and ceramics.
  • organic low-molecular compound examples include a carbodiimide group-containing compound, an isocyanate group-containing compound, a nitrogen dioxide group-containing compound, an aldehyde group-containing compound, and an amino group-containing compound.
  • Particularly preferred carriers in the present invention are compounds containing a carbodiimide group or compounds containing an isocyanate group.
  • each capture oligonucleotide or nucleic acid probe to the support is usually carried out in a form contained in water or a buffer so that the activity of the capture oligonucleotide or nucleic acid probe is maintained. Supplied.
  • the supply temperature is fixed. O ° c—the activity of the capture oligonucleotide or analyte to be
  • the mixture may be contacted with a carrier to be immobilized. At this time, it may be fixed by irradiating electromagnetic waves such as ultraviolet rays.
  • the means for supplying the capture oligonucleotide or the analyte to the support is not particularly limited as long as the capture oligonucleotide or the analyte is supplied while the activity of the analyte is maintained.
  • Examples of such a method include a method using a dispenser, a method using a pin, and a method using an inkjet.
  • the capture oligonucleotide or nucleic acid probe is immobilized on a support, its shape does not affect hybridization, and its shape is particularly limited unless detection becomes difficult. Not done. Such examples include circles, squares, and the like.
  • the size of the site where each capture oligonucleotide is immobilized on the support is preferably 1 O / im-1 cm in diameter. If it is smaller than this, detection becomes difficult, and if it is larger than this, the area occupied by the entire arrangement of the capture oligonucleotides becomes large, which may cause a problem that operability is deteriorated.
  • each capture oligonucleotide or nucleic acid probe When each capture oligonucleotide or nucleic acid probe is immobilized on the support, each oligonucleotide or analyte may be immobilized as it is, but by increasing the reactivity, the capture oligonucleotide can be improved.
  • a linker may be attached to the end of the subject to react the linker with the support or carrier. Examples of such a linker include an amino group or a homopolymer such as a homopolymer of a thymidine residue.
  • each capture oligonucleotide or nucleic acid probe on a support is not particularly limited as long as each polymorphism can be determined. It is preferable to arrange the capture oligonucleotide or the analyte to be used in such a manner that the capture oligonucleotides or the analytes are combined into one section or arranged in a line.
  • the capture oligonucleotide or nucleic acid probe immobilized on the support may be one kind or two or more kinds.
  • the nucleic acid probe used for hybridization with the capture oligonucleotide is a nucleic acid containing the MC1R gene and the KIT gene or a part thereof.
  • the nucleic acid probe does not inhibit hybridization, and is not particularly limited as long as it does not inhibit hybridization.
  • DNA or RNA is used.
  • the method for preparing the nucleic acid probe is not particularly limited as long as the method does not inhibit hybridization. Specifically, pig blood or tissue extract nucleic acid is extracted and a region containing at least the polymorphic site of MC1R gene and KIT gene, Polymerase Chain Reaction (PCR) method, in virto transcription method, Loop-mediated Isothermal Amplification method, etc.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a nucleic acid probe can be prepared by amplifying or isolating by the method described above.
  • a method usually used for preparing a nucleic acid can be employed. For example, there is a method introduced in Anim. Sci. J. 71 (8): 2 22-234, 2000.
  • the nucleic acid probe is prepared so as to include at least one polymorphism at each site.
  • the PCR primers used for preparing the nucleic acid probe are designed to have a nucleotide sequence complementary to the capture oligonucleotide, excluding the sequence region unique to each haplotype.
  • the nucleic acid probe may be longer or shorter than the capture oligonucleotide as long as the hybridization is possible.
  • an initial preparation is performed using preliminary primers for preparing a wider region than the target nucleic acid probe, and the prepared nucleic acid is used as a type III to obtain a nucleic acid probe.
  • Nucleic acid amplification may be performed using secondary primers. When the polymorphism is at a distant place, a nucleic acid probe corresponding to each unique region can be prepared.
  • Nucleic acid probes or capture oligonucleotides are usually labeled to detect hybridization.
  • the method for obtaining a labeled nucleic acid probe or capture oligonucleotide is not particularly limited as long as it does not inhibit hybridization. Examples of such a method include a method in which a primer used for final nucleic acid probe production is labeled in advance, a method in which the primer is labeled during nucleic acid probe production, a method in which a nucleic acid probe is labeled after production, and a method in which a labeled capture is used. Those who make oligonucleotides And the like.
  • Examples of a method of labeling a primer in advance and a method of producing a labeled capture oligonucleotide include a method of synthesizing a primer using a labeled nucleotide.
  • a method for labeling during preparation of a nucleic acid probe a method of incorporating a labeled nucleotide during a reaction for preparing a nucleic acid probe can be exemplified.
  • a method of labeling after the production reaction a method of labeling by a method disclosed in JP-A-10-287870 and the like can be mentioned.
  • a labeling substance used in a usual hybridization method can be used as a substance for labeling a nucleic acid probe or a capture oligonucleotide.
  • a labeling substance include a fluorescent substance and a hapten. Specific examples include fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Texas Red and cyanine fluorescent dyes, and haptens include biotin, digoxigenin, dinitrophenyl and the like.
  • Primers for producing a nucleic acid probe can be included in a haplotype typing kit together with the capture oligonucleotide.
  • Hybridization can be carried out in the same manner as in ordinary nucleic acid hybridization. A specific method will be exemplified below.
  • Salt solutions such as SSC (Standard Saline Citrate), sodium dodecyl sulfate (SDS)
  • the nucleic acid probe is added to a mixture of a blocking solution such as serum albumin and an additive for accelerating the reaction. If the probe is double-stranded, denature by heat or the like. After dropping several L of the nucleic acid probe solution onto the support, heat for several hours (usually 30
  • the support is immersed in an SSC solution or tetramethylammonium chloride solution of an appropriate concentration, and heated (usually at 37 ° C to 70 ° C) to selectively deposit only the specific hybrid on the support. leave. At this time, SDS or the like may be added.
  • a fluorescent substance, a hapten, or the like labeled on the nucleic acid probe is used.
  • a fluorescent substance the fluorescence labeled on the hybridized nucleic acid probe is detected using a dedicated fluorescent scanner.
  • a conjugate enzyme conjugate
  • alkaline phosphatase or horseradish peroxidase is added to the support. Incubate at room temperature for several tens of minutes.
  • the enzyme conjugate is obtained by coating the region of the support other than the region where the capture oligonucleotide is immobilized with a protein such as casein-serum albumin. Non-specific adsorption of the gate and the support can be prevented. This treatment can be performed by immobilizing the oligonucleotide, adding a solution of a protein such as casein onto the support, and allowing the solution to stand at room temperature for several tens of minutes.
  • the enzyme conjugate After the binding reaction between the enzyme conjugate and the hapten of the nucleic acid probe, the enzyme conjugate is washed with a suitable buffer solution containing a surfactant by removing the enzyme conjugate with a force not binding to the hapten. Only the enzyme conjugate bound to the hapten in the target nucleic acid will remain on top.
  • Compounds used herein include nitro blue tetrazolium chloride, 5_bromo_4 -cloth_3 -indolyl phosphate-p-toluidine salt), 3,3,5,5, -tetra Methylbenzidine is used.
  • Polymorphism is detected by detecting a dye or fluorescence deposited for each capture oligonucleotide based on the obtained hybridization results. Specifically, the color development amount and the fluorescence intensity of each capture oligonucleotide are compared with the corresponding capture oligonucleotides, and the larger amount is determined to be hybridization positive. When the amounts are the same, both are determined to be positive.
  • the standard is not particularly limited, since it differs depending on a labeling substance to be used, it is desirable to determine the standard for each detection system.
  • the kit of the present invention contains a capture oligonucleotide.
  • the kit of the present invention can contain a primer or a labeled nucleic acid probe for preparing a nucleic acid probe, a buffer, a reagent for hybridization such as an enzyme conjugate that recognizes a hapten, and the like.
  • an oligonucleotide was synthesized using an oligonucleotide synthesizer (Perkin-Elmer Applied biosystems), deprotected, and dried.
  • the dried oligonucleotide was dissolved using 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and ImM EDTA buffer to prepare a 100 pmol // iL oligonucleotide solution.
  • This method of synthesis is similar for capture oligonucleotides or any oligonucleotides used as primers.
  • the nucleotide sequence of the synthesized oligonucleotide is shown in SEQ ID NOs: 3-125.
  • SEQ ID NOs: 3-121 are capture oligonucleotides
  • SEQ ID NOs: 122-125 are primers.
  • An amino group was bound to the 5 'end of the capture oligonucleotide using the above synthesizer, and a rhodamine label was placed on the 5' side of the primer.
  • a microspotting solution (TeleChem International In) was mixed with 10 ⁇ L of an oligonucleotide solution having an amino group at the terminal, and the mixture was dispensed onto a microtiter plate (Greiner Laboratory In).
  • a silanized slide glass (Matsunami Glass Ind. Ltd.) was placed at a predetermined position of the spotting machine, and the spotting machine was operated. After the spotting was completed, steam from hot water was applied to the slide glass for several seconds and then irradiated with 30 mJ of ultraviolet light. After re-exposure to steam for a few seconds, the slides were placed on a hot plate to remove moisture.
  • the slide glass After rinsing the slide glass with a 0.1% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate, the slide glass was rinsed with distilled water. The slide glass was immersed in lOOmM Tris-HCl (pH 7.5), lOOmM NaCl, 0.1% Triton X-100 containing 3% BSA (peroxidase albumin) for 30 minutes at room temperature for blocking. Then dry at room temperature After drying, the plate was washed with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and ImM EDTA buffer. The slide glass was dried again at room temperature and stored in a dry place in a cold place until use.
  • lOOmM Tris-HCl pH 7.5
  • BSA peroxidase albumin
  • a probe nucleic acid was prepared by PCR using swine DNA as type III.
  • a chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) solution was added to the obtained aqueous phase, and the mixture was stirred and centrifuged (12000 rpm, 1 minute) to collect the aqueous phase. This operation was repeated twice.
  • the DNA in the obtained aqueous phase was recovered by ethanol precipitation, dried, and then dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl, ImM EDTA, ⁇ 7.5) to obtain a PCR template solution.
  • composition of the PCR reaction solution was as follows: lUnit of Taq polymerase, 10 pmol of each primer, 5 ⁇ l of reaction buffer, 10 nmol of dNTP, template DNA solution of 0.5 / i1, and sterile water. Prepare a total of 50 ⁇ l, and prepare two types of PCR template to amplify the MC1R gene (primers of SEQ ID NOs: 122 and 123) and KIT gene (primers of SEQ ID NOs: 124 and 125).
  • probe nucleic acid solutions prepared in ⁇ 3> then take 4 ⁇ l, mix and mix with Arraylt Unihyb Hybridization Solution (TeleChem International Inc.) 16 i1, heat-treat at 100 ° C for 10 minutes After that, it was immersed in ice for 5 minutes. 5 ⁇ l of this probe nucleic acid solution was placed on a slide glass on which the capture oligonucleotide prepared in ⁇ 2> was immobilized, and a cover glass was placed thereon. This was placed in a moisturizing box, further placed in a thermostat set at 37 ° C, and allowed to stand for 120 minutes.
  • Arraylt Unihyb Hybridization Solution TeleChem International Inc. 16 i1
  • the slide glass was taken out and immediately immersed in a 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution (2 ⁇ SSC: 0.033 M NaCl, 0.03 M sodium citrate) at room temperature to remove the cover glass.
  • Table 7 shows the above results and the relationship with the typing by the DNA sequencing method. It is clear that the method of the present invention enables the type of pig to be determined.
  • the type determination of a pig can be performed efficiently and with high accuracy.

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Abstract

　被検体豚のＫＩＴ遺伝子中の１又は２以上の多型を検出し、検出される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法において、前記多型として、配列番号１に示す塩基配列を基準とするＫＩＴ遺伝子の塩基配列において、１１５９位及び１２０９位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を検出する。

Description

明 細 書
豚の種別の判別法
技術分野
[0001] 本発明は、豚の品種を簡便に判別する方法および、キットに関するものである。
背景技術
[0002] 現在、豚肉用として飼育されているものは大ヨークシャー種、ランドレース種、デュロ ック種、バークシヤー種、ハンプシャー種、メイシャン種、モンカイ種などと、それらの 交雑によるものが主流である。そのなかで、バークシヤー種はいわゆる黒豚といわれ 、品質の高さから高値で取引されている。
[0003] し力し、この高値に便乗して黒豚肉として取引されているものの中にはバークシヤー 以外の種の混じった豚肉やバークシヤー種が全く混じってレ、なレ、豚肉も出回ってレ、 る。そこで、平成 11年 6月に「食肉小売品質基準」が改正され、バークシヤー純粋種 以外の肉を黒豚として表示することを禁止した。し力 ながらこれは完全に守られて レ、るとはいえなレ、のが現状である。
[0004] 豚の品種を調べる方法として、遺伝子を増幅した後、制限酵素断片長多型 (Restri ction fragment length polymorphisms : RFLP)により多型角军析を行つ方法力 ある（特許第 3116049号)。し力、しながら、この方法は RFLPを用いているため多量 の DNAを必要とすること、制限酵素を用いるため操作に熟練を要すること、複数の 制限酵素を用いるときは操作が煩雑になること、制限酵素が市販されていない多型 部位については調べることができなレ、、白色品種と有色品種を区別できない場合が ある等の問題が生じ、高精度且つ多検体を処理することは難しい。
[0005] また、現在までに、豚の種別の判別の指標となる遺伝子多型が多数報告されてい る（特許第 3116049号）が、より正確な判別には、新たな多型を見出すことが必要で ある。特に、従来知られている多型のみでは、黒豚と白豚とを判別できない場合があ る。
[0006] 一方、標識した標的核酸を固相上で捕獲して、その有無や存在比を解析するマイ クロアレイ技術が近年開発された。これは、多数の捕獲核酸 (キヤプチヤーオリゴヌク レオチド）を固相上に固定化し、標識した標的核酸を捕獲核酸にハイプリダイズさせ て捕獲し、標的核酸の有無や存在比を網羅的に解析する技術である（Nature gen etics supplement volume 21 , PlO— 14)。
発明の開示
[0007] 本発明は、豚の種別判別に際し、簡便且つ、多検体処理に適し、 1つの検体に対 して一度の試験で高精度の判別が可能な方法及びキットを提供することを課題とす る。
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決するために検討を行った結果、幹細胞増殖因子レ セプター遺伝子の一種である KIT遺伝子中に、豚の種別の判別に好適な新規な多 型が存在することを見出した。そして、 KIT遺伝子の公知の多型、あるいはメラニン細 胞刺激ホルモンレセプター遺伝子（MC1R遺伝子）中の多型と組み合わせることによ り、被検体豚の種別を高精度に判定することができることを見出し、本発明を完成す るに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
[0009] (1) 1種又は 2種以上のキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを含み、これらのキヤプチヤー オリゴヌクレオチドと被検体豚由来の核酸とのハイブリダィゼーシヨンにより検出される 多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別するためのキットであ つて、前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、配列番号 1に示す塩基配列を基準と する KIT遺伝子の塩基配列において、 1159位及び 1209位に相当する位置のいず れか一方又は両方の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを含むことを 特徴とするキット。
(2)前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されていることを特徴と する（1)に記載のキット。
(3)前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、前記 KIT遺伝子の塩基配列において、 3 98位、 549位、 595位、 659位、 844位、 884位、 959位、 1313位、 1342位、 1632 位、 1724位、 1986位、 2179位、 2295位、 2313位、 2314位、 2360位、 2377位、 2391位、 2429位、 2449位、 2470位、 2472位、 2600位、 2611位、 2622位、 26 63位、 2674位、 2680位、 2717位、 2834位、 2840位、 2899位、 3020位、 3049 位、 3207位、 3221位、 3258位、 3296位、 3317位、 3323位、 3341位、 3373位、 3387位、 3420位、 3482位、 3597位、 3666位、 3705位、 3737位、 3773位、 38 84位、 3885位、 3886位、及び 3887位から選ばれる 1又は 2以上の位置の多型を 検出し得るオリゴヌクレオチドをさらに含む（1)又は（2)に記載のキット。
(4)前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター遺 伝子（以下、「MC1R遺伝子」という）における 1又は 2以上の位置における多型を検 出し得るオリゴヌクレオチドを含む（1)一 (3)のいずれかに記載のキット。
(5)前記 MC1R遺伝子における多型力 配列番号 2に示す塩基配列において、 154 位、 176位、 234位、 241位、 361位、 367位、 598位、及び 600位力も選ばれる位 置に相当する位置における多型である（4)に記載のキット。
(6)前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補 的又は相同な塩基配列を有し、 10 40塩基長である（1)一（5)のレ、ずれかに記載 のキット。
(7)配列番号 1に示す塩基配列を基準とする KIT遺伝子の塩基配列にぉレ、て、 115 9位又は 1209位に相当する位置における多型をハイブリダィゼーシヨンにより検出し 得るオリゴヌクレオチド。
(8)前記多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、 10 一 40塩基長である（7)に記載のオリゴヌクレオチド。
(9)被検体豚由来の核酸と、（1)一（6)のいずれかに記載のキットに含まれるキヤプ チヤ一オリゴヌクレオチドとのハイブリダィゼーシヨンを行い、各々のキヤプチヤーオリ ゴヌクレオチドについて被検体豚由来の核酸とのハイブリッド形成の有無を検出し、 被検体豚の塩基配列中の多型を同定することによって、被検体豚の種別を判別する 方法。
(10)被検体豚の KIT遺伝子中の 1又は 2以上の多型を検出し、検出される多型又 はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法であって、前記多型 は、配列番号 1に示す塩基配列を基準とする KIT遺伝子の塩基配列において、 115 9位及び 1209位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を 含むことを特徴とする方法。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、被検体豚の KIT遺伝子中の 1又は 2以上の多型を検出し、検出 される多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法であつ て、前記多型は、配列番号 1に示す塩基配列を基準とする KIT遺伝子の塩基配列に おいて、 1159位及び 1209位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置にお ける多型を含むことを特徴とする方法である。同方法は、具体的には、例えば固定化 核酸を用いたハイブリダ一ゼーシヨンにより行われる。本発明のキットは、本発明の方 法をこのようなハイブリダィゼーシヨンにより行うためのキットであって、前記 1159位及 び 1209位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を検出し 得るオリゴヌクレオチドを、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドとして含む。前記多型は、 本発明者が見出した新規な多型である。
[0011] 本発明において、多型の検出及びその結果に基づく豚の種別の判別は、上記多 型に加えて、 KIT遺伝子の公知の多型と組み合わせて行ってもよい。さらに、これら の多型と、 MC1R遺伝子中の多型と組み合わせてもよい。
[0012] KIT遺伝子の多型としては、配列番号 1に示す塩基配列を基準とする KIT遺伝子 の塩基酉己歹' Jにおレヽて、 398位、 549位、 595位、 659位、 844位、 884位、 959位、 1 159位、 1209位、 1313位、 1342位、 1632位、 1724位、 1986位、 2179位、 229 5位、 2313位、 2314位、 2360位、 2377位、 2391位、 2429位、 2449位、 2470位 、 2472位、 2600位、 2611位、 2622位、 2663位、 2674位、 2680位、 2717位、 2 834位、 2840位、 2899位、 3020位、 3049位、 3207位、 3221位、 3258位、 329 6位、 3317位、 3323位、 3341位、 3373位、 3387位、 3420位、 3482位、 3597位 、 3666位、 3705位、 3737位、 3773位、 3884位、 3885位、 3886位、 3887位に 相当する位置における多型が挙げられる。
[0013] また、 MC1R遺伝子の多型としては、配列番号 2に示す塩基配列を基準とする MC 1R遺伝子の塩基酉己歹 IJにおレヽて、 154位、 176位、 234位、 241位、 362位、 367位、 598位、および 600位から選ばれる位置に相当する位置における多型が挙げられる [0014] 遺伝子における多型の位置は、その位置よりも上流側における配列中のヌクレオチ ドの挿入、欠失等によって変化し得る。本発明において、「相当する位置」とは、この ように、遺伝子配列中の絶対的位置が変わった場合、配列番号 1又は 2に示す基準 配列中の相対位置を示すものである。
[0015] 上記多型位置における多型の様式として具体的には、 KIT遺伝子では 398位にお けるチミンからシトシンへの置換、 549位におけるアデニンからグァニンへの置換、 5 95位におけるアデニン力、らチミンへの置換、 659位におけるシトシンからチミンへの 置換、 844位におけるグァニンからアデニンへの置換、 884位におけるシトシンから アデニンへの置換、 959位におけるアデニンからグァニンへの置換、 1159位におけ るチミンからシトシンへの置換、 1209位におけるシトシン力、らチミンへの置換、 1313 位におけるグァニンからアデニンへの置換、 1342位におけるグァニンからアデニン への置換、 1632位におけるグァニンからアデニンへの置換、 1724位におけるシトシ ンカらチミンへの置換、 1986位におけるアデニン力らグァニンへの置換、 2179位に おけるシトシン力らグァニンへの置換、 2295位におけるグァニンからアデニンへの置 換、 2313位におけるシトシンからチミンへの置換、 2314位におけるシトシンからアデ ニンへの置換、 2360位におけるシトシン力らチミンへの置換、 2377位におけるシト シンからチミンへの置換、 2391位におけるグァニンからシトシンへの置換、 2429位 におけるシトシンの欠失、 2449位におけるグァニンからアデニンへの置換、 2470位 におけるグァニンからアデニンへの置換、 2472位におけるシトシンからアデニンへの 置換、 2600位におけるグァニンからアデニンへの置換、 2611位におけるアデニン 力らグァニンへの置換、 2622位におけるシトシンからチミンへの置換、 2663位にお けるアデニンからグァニンへの置換、 2674位におけるシトシンからグァニンへの置換 、 2680位におけるチミンカ、らシトシンへの置換、 2717位におけるシトシンからチミン への置換、 2834位におけるアデニンからグァニンへの置換、 2840位におけるアデ ニンからチミンへの置換、 2899位におけるグァニンからアデニンへの置換、 3020位 におけるグァニンからアデニンへの置換、 3049位におけるシトシンからアデニンへの 置換、 3207位におけるシトシンからチミンへの置換、 3221位におけるアデニンから シトシンへの置換、 3258位におけるグァニンからアデニンへの置換、 3296位におけ るチミンからシトシンへの置換、 3317位におけるチミンカらシトシンへの置換、 3323 位におけるチミンからシトシンへの置換、 3341位におけるグァニンからアデニンへの 置換、 3373位におけるグァニンからチミンへの置換、 3387位におけるグァニンから アデニンへの置換、 3420位におけるアデニンからグァニンへの置換、 3482位にお けるグァニンからアデニンへの置換、 3597位におけるグァニンからチミンへの置換、 3666位におけるアデニンからグァニンへの置換、 3705位におけるグァニンからアデ ニンへの置換、 3737位におけるアデニンからグァニンへの置換、 3773位における シトシンからチミンへの置換、 3884位におけるアデニンの欠失、 3885位におけるグ ァニンの欠失、 3886位におけるチミンの欠失、及び 3887位におけるチミンの欠失が 挙げられる。
[0016] また、 MC1R遺伝子では、 154位におけるグァニンからアデニンへの置換、 176位 におけるチミンからシトシンへの置換、 234位におけるチミンからシトシンへの置換、 2 41位におけるアデニンからグァニンへの置換、 362位におけるシトシンからチミンへ の置換、 367位におけるシトシンからチミンへの置換、 598位におけるグァニンからァ デニンへの置換、及び 600位におけるグァニンからアデニンへの置換が挙げられる。
[0017] 本発明において検出する、 KIT遺伝子の 1159位及び 1209位以外の多型の組み 合わせとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
[0018] (1) C659T、 C2377T
[0019] (2)T398C, A549G、 C659T、 A959G、 C1724T, A1986G、 C2179G、 C237 7T、 G2391C、 C2472A, G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C、 A2840T 、 G3020A、 C3207T、 A3221C、 G3258A、 T3296C、 T3317C, T3323C、 G3 341A、 G3387A、 G3482A、 A3666G、 G3705A
[0020] (3)T398C、 A549G、 C659T、 C884A、 A959G、 G1342A、 C1724T, A1986 G、 C2179G、 C2377T, G2391C、 C2472A, G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C、 A2840T, G3020A、 C3207T, A3221C, G3258A、 T3296C、 T33 17C、 T3323C, G3341A、 G3387A、 G3482A, A3666G、 G3705A
[0021] (4)T398C、 A549G、 C659T、 A959G、 G1313A、 C1724T、 A1986G、 C217 9G、 C2377T, C2472A, G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C、 A2840T 、 G3020A、 C3207T、 A3221C、 G3258A、 T3296C、 T3317C, T3323C、 G3 341A、 G3387A, G3482A、 A3666G、 G3705A
[0022] (5)T398C, A549G、 C659T、 A959G、 C1724T, A1986G、 C2179G、 C237 7T、 C2472A, G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C, A2840T, G3020A 、 C3207T, A3221C, G3258A、 T3296C、 T3317C、 T3323C, G3341A、 G3 387A、 G3482A、 A3666G、 G3705A
[0023] (6)T398C、 A549G、 C659T、 A959G、 C1724T, A1986G、 C2179G, C237 7T、 C2472A, G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C, A2840T, G3020A 、 C3207T, A3221C, G3258A、 T3296C、 T3317C、 T3323C, G3341A、 G3 387A、 G3482A、 A3666G、 G3705A, A3884D、 G3885D、 T3886D、 T388 7D
[0024] (7)T398C、 A549G、 C659T、 A959G、 C1724T, A1986G、 C2179G, C237 7T、 C2472A、 G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C、 A2840T、 G3020A 、 C3207T, A3221C、 G3258A、 T3296C、 T3317C、 T3323C、 G3341A, G3 387A、 G3482A、 A3666G、 G3705A
[0025] (8)T398C, A549G、 C659T、 A959G、 C1724T, A1986G、 C2179G、 C237 7T、 G2470A、 C2472A、 G2600A、 A2611G、 A2663G、 T2680C、 A2840T 、 G2899A、 G3020A、 C3207T, A3221C、 T3296C、 T3317C, T3323C、 G3 341A、 G3387A, G3482A、 A3666G、 G3705A、 C3773T
[0026] (9)A595T, C659T、 G844A、 A959G、 G1632A、 A1986G、 G2295A、 C231 3T、 C2314A、 C2360T、 C2429D, G2449A, A2611G、 C2622T、 A2663G、 C2674G, T2680C, C2717T, A2834G、 A2840T, C3049A、 A3221C, T32 96C、 T3317C、 T3323C, G3373T、 A3420G、 G3482A, G3597T、 A3666G 、 G3705A、 A3737G
[0027] (但し、数字は配列番号 1における位置を、数字を挟む左右の文字は左の塩基から 右の塩基への置換を、 Dは欠失を、それぞれ示す。 )
[0028] また、本発明において検出する、 MC1R遺伝子の多型の組み合わせとしては、以 下の組み合わせが挙げられる。 [0029] ( 10) C367T
( 1 1 ) A241G、 C362T、 G598A
( 12) G154A、 T176C、 T234C、 A241G、 G600A
[0030] 本発明において、豚の種の判定は、上記多型又はその組み合わせを同定すること によって行われる。表 1に、 MC1R遺伝子の豚の種別による多型の一覧を示す。また 、表 2— 3に、 KIT遺伝子の豚の種別による多型の一覧を示す。例えば表 2中に、「白 ぶた」が 4種記載されている力 これは、 4種の白ぶたについて多型の組合せを分類 したところ、 4種にわかれたことを意味している。また、表 1一 3中、「多型個所」は、 M C1Rは配列番号 2に示す塩基配列を基準とする位置を、 KIT遺伝子は配列番号 1に 示す塩基配列を基準とする位置を示す。また、ランドレース種と大ヨークシャー種は 共に白色であるため、以下 2種をまとめて白色豚とする。
[0031] [表 1]
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
[0032] [表 2]
ぶた種另 ιΓ~ — ¾15 398 549 595 659 844 884 959 1 159 1209 1313 1342 1632 1724 1986 メイシャン、 /く一クシヤー T A A C G C A T C G G G C A モンカイ T A A T G C A T C G G G C A 丁ュロック C G A T G C G T C G G G T G デュロック C G A T G A G T C G A G T G 白ぶた C G A T G C G T C A G G T G 白ぶた C G A T G C G T C G G G T G 白ぶた C G A T G C G T C G G G T G 白ぶた C G A T G C G c T G G G T G ハンプシャー C G A T G C G T c G G Q T G バ一クシヤー T A T T A C G T c G G A c G ぶた種别 ~ M 2179 2295 2313 2314 2360 2377 2391 2429 2449 2470 2472 2600 261 1 2622 メイシャン、バークシャ一 C G C C C C G C G G C G A C モンカイ C G C C C T G C G G C G A C 丁ュロック G G C C C T C C G G A A G C 丁ュロック G G C C C T C C G G A A G C 白 ：： G G C C C T G C G G A A G C 白 G G C C C T G C G G A A G C 白 , G G C C C T G C G G A A G C 白ぶた G G C C C T G C G G A A G C ハンプシャー G G C C C T G C G A A A Q C バークシヤー C A T A T c G * A G C G G T
表 3
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ぶた種！— - ~ m 3323 3341 3373 3387 3420 3482 3597 3666 3705 3737 3773 3884 3885 3886 3887 メイシャン、バークシヤー T G G G A G G A G A C A G T T モンカイ T G G G A G G A G A C A G T T 丁ュロック C A G A A A G G A A C A G T T 丁ュロック C A G A A A G G A A C A G T T 白ぶた C A G A A A G G A A C A G T T 白ぶた C A G A A A G G A A C A G T T 白ぶた C A G A A A G G A A C * * * * 白ぶた C A G A A A G G A A C A G T T ノ、ンプシャ一 C A G A A A G G A A T A G T T バークシヤー C G T G G A T G A G c A G T T
[0034] 本発明において、好ましくは、上記多型は、それぞれの多型をハイブリダィゼーショ ンにより検出し得るオリゴヌクレオチドを用いて検出される。本発明においては、この ようなオリゴヌクレオチドをキヤプチヤーオリゴヌクレオチドとレ、う。キヤプチヤーオリゴヌ クレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有 する。
[0035] キヤプチヤーオリゴヌクレオチドの設計は、それぞれの遺伝子に存在する各々の多 型部位を含むように行う。また、 1つのキヤプチヤーオリゴヌクレオチドのなかに 2塩基 以上のタイプ固有の塩基配列が存在してレ、ても力、まわなレ、。
[0036] キヤプチヤーオリゴヌクレオチドの塩基の長さは、 10 40塩基が望ましレ、。これより 短いとハイブリダィゼーシヨンの検出が困難になり、長いとタイプ固有の配列によるハ イブリダィゼーシヨンの差が少なくなり、タイプの判定が難しくなることがある。ただし、 このキヤプチヤーオリゴヌクレオチドの長さは、主として各塩基の含有率や同一塩基 の繰り返しなどの配列の特性に依存する。また、ハイブリダィゼーシヨンを妨げる要因 である 2次構造的障害がある場合は、遺伝子の多型性に関係しない任意の塩基をス ぺーサ一化合物で置換することによりハイブリダィゼーシヨンにおける結合親和性を 緩和したオリゴヌクレオチドを用いることにより、前記障害を回避することもできる。この ようなスぺーサー化合物としては、 V、ずれの種類の塩基との相補結合性を有しなレ、 核酸骨格等が挙げられる。
[0037] キヤプチヤーオリゴヌクレオチドの塩基配列の例を、配列番号 3— 121に示す。尚、 配列番号 3— 121に示した番号のほか、各塩基配列の 5 '側もしくは 3 '側またはその 両方において、各々の塩基配列を、 MC1R遺伝子、 KIT遺伝子の塩基配列に対応 して伸長、または短縮させてもよいが、いずれの場合もキヤプチヤーオリゴヌクレオチ ドは 10 40塩基の範囲とすることが好ましい。
[0038] キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、 DNA、 RNA、ペプチド核酸、またはロックド核 酸のいずれであってもよレ、。キヤプチヤーオリゴヌクレオチドの合成方法は、通常のォ リゴヌクレオチドと同様にして、例えば市販の DNA合成機を用いる方法等によって、 行うことができる。
[0039] 本発明において、設計されたキヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、出願時点までの研 究 ·調査結果を良く反映したものである力 新しいハプロタイプの塩基配列に関して、 この後、追加的な情報が得られた場合には、本出願に記載の方法に基づいて新た なキヤプチヤーオリゴヌクレオチドが設計されることになる。このようなキヤプチヤーオリ ゴヌクレオチドを使用する場合であつても、 KIT遺伝子の 1159位及び 1209位に相 当する位置のいずれか一方を検出する限り、本発明に含まれる。
[0040] 上記のようなキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを用いてハイブリダィゼーシヨンを行う 際に、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドと被検体豚に由来する核酸（以下、「核酸プロ ーブ」ともいう）を液中でハイブリダィゼーシヨンさせてもいいし、キヤプチヤーオリゴヌ クレオチドまたは核酸プローブのどちらかを支持体上に固定化してもよい。
[0041] 固定化を行う場合、このような支持体としては、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまた は核酸プローブを固定化でき、被検体とのハイブリダィゼーシヨン及び、ハイブリッド の検出に必要な反応工程に耐え得るものであれば特に制限されない。このような支 持体の材質として具体的にはプラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミツ ク等が挙げられる。
[0042] 上記プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、 ポリプロピレン、ポリアミド、フエノール榭脂、エポキシ樹脂、ポリカルポジイミド樹脂、 ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビリニデン、ポリフッ化工チレン、ポリイミド及びアクリル樹 脂等が挙げられる。
[0043] また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及び、ダラ ファイト等が挙げられる。
また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグ ネット等が挙げられる。
[0044] また、天然高分子としてはポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及 び、それらの誘導体等が挙げられる。
また、セラミックとして具体的にはアパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケィ素、窒化ケ ィ素及び、炭化ホウ素等が挙げられる。
[0045] 本発明においてキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体の固定化に用いる支 持体の形状はキヤプチヤーオリゴヌクレオチドが固定化されれば、特に制限されない 。このような支持体の形状として平板、メンブレン、微粒子等が挙げられる。
[0046] 本発明において上記支持体にキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ を固定化する際、支持体にキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを直 接固定化してもよぐ担体を支持体に担持させて、担体を介してキヤプチヤーオリゴヌ クレオチドまたは被検体を支持体に固定化してもよい。担体としては、担体自体がキ ャプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体に結合性を有してもよぐキヤプチヤーオリ ゴヌクレオチドまたは被検体に結合性を有するリガンドを介してキヤプチヤーオリゴヌ クレオチドまたは被検体を固定化できるものであってもよい。ここで、「担持」とは、担 体にキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを固定化する際やキヤプチ ヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ固定化支持体を実際の検出に用いる際 等に用いられる水溶性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤中で、支持体から上記担体が 実質的に脱離しないことを意味する。
[0047] 本発明に用いられる上記担体は、上記支持体上に担持される限り、単に物理的な 接着性を利用して担持されていてもよぐまた、化学的に共有結合等を介して担持さ れていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、支持体上の全面において担持され ていても、また、その一部において担持されていてもよい。
[0048] 担体としては、有機低分子、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミ ック等力 S挙げられる。
上記有機低分子として具体的には、カルポジイミド基含有化合物、イソシァネート基 含有化合物、窒素ィぺリット基含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有 化合物等が挙げられる。
[0049] また、プラスチック、無機高分子、金属、セラミックは、前記したものと同様のものを 使用すること力 Sできる。
本発明において特に好ましい担体は、カルポジイミド基含有化合物またはイソシァ ネート基含有化合物である。
[0050] 各キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの支持体への供給はキヤプ チヤ一オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの活性が維持されるように、通常、水ま たはバッファ一中に含まれる形で供給される。また、供給の際の温度としては固定化 されるキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体の活性が失われなレ、ように o°c—
100°Cとすることが望ましい。
[0051] また、オリゴヌクレオチドと支持体の接触後に紫外線等の電磁波を照射することによ つ
て固定することもできる。さらに、オリゴヌクレオチドとカルポジイミド樹脂、窒素ィぺリツ ト、ポリアミノ酸、ニトロセルロール等の公知の化合物を化学的に結合又は物理的に 結合した状態で、これら混合物と担体を接触させ固定させても良ぐまた、このとき紫 外線等の電磁波を照射して固定しても良い。
[0052] 本発明においてキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体を支持体に供給する 手段は、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体の活性が維持された状態で供 給されれば特に制限はされない。このような例としてディスペンサを用いる方法、ピン を用いる方法、インクジェットを用いる方法などが挙げられる。
[0053] キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを支持体上へ固定化する際、 その形状はハイブリダィゼーシヨンに影響を及ぼさず、また、検出が困難にならなけ れば特にその形状は制限されない。このような例として円形、四角形等が挙げられる 。支持体上へ各キヤプチヤーオリゴヌクレオチドが固定化される部位のサイズは、径 1 O /i m— lcmが好ましい。これより小さいと検出が困難になり、また、これより大きいと 配置されたキヤプチヤーオリゴヌクレオチド全体の占める面積が大きくなり、操作性が 悪くなるという問題が生じることがある。
[0054] 支持体上への各キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの固定化の際 、各オリゴヌクレオチドまたは被検体をそのまま固定化しても良いが、反応性を高める ことによって、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体の末端にリンカ一を付カロ し、リンカ一と支持体又は担体とを反応させてもよい。そのようなリンカ一としては、アミ ノ基、またはホモポリマー、例えばチミジン残基のホモポリマー等が挙げられる。
[0055] 各キヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブの支持体上への配置は各多 型の判定が出来れば特に制限されないが、各多型の判定を容易にするために、多 型の判定に用いられるキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは被検体を 1区画にまとめ る力 \あるいは一列に並べるなどして配置することが好ましい。 [0056] 支持体上へ固定されるキヤプチヤーオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブは、 1種 であっても、 2種以上であってもよい。
キヤプチヤーオリゴヌクレオチドとのハイブリダィゼーシヨンに用いる核酸プローブは 、 MC1R遺伝子及び KIT遺伝子又はその一部を含む核酸である。核酸プローブは、 ハイブリダィゼーシヨンを阻害しなレ、ものであれば特に制限されなレ、が、通常、 DNA または RNAなどが用いられる。また、核酸プローブの作製方法は、ハイブリダィゼー シヨンを阻害しない方法であれば特に制限されなレ、。具体的には、豚の血液または 組織力 核酸を抽出し、 MC1R遺伝子及び KIT遺伝子の少なくとも多型部位を含む 領域 、 Polymerase Chain Reaction (PCR)法、 in virto transcription法、 Loop-mediated Isothermal Amplification法等の方法によって増幅又は単離 することによって、核酸プローブを調製することができる。核酸の調製は、通常核酸の 調製に用いられている方法を採用することができる。例えば Anim. Sci. J. 71 (8) : 2 22-234, 2000で紹介されている方法が挙げられる。
[0057] 核酸プローブは、各多型を少なくとも 1箇所含むように調製する。また、核酸プロ一 ブの作製に用いる PCRプライマーは、各ハプロタイプ固有の配列領域を除き、キヤプ チヤ一オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列になるように設計される。なお、ノ、イブリ ダイゼーシヨンが可能である限りにおいて、核酸プローブは、キヤプチヤーオリゴヌク レオチドより長くても短くても良い。また、 PCR反応の特異性を高めるために、 目的と する核酸プローブよりも広い領域を作製する予備的プライマーを用いて初回の作製 をおこない、作製された核酸を铸型として核酸プローブを得るための 2次プライマー を用いて核酸増幅をおこなっても良い。多型が離れたところにある場合、各固有領域 に応じた核酸プローブを作製することができる。
[0058] 核酸プローブまたはキヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダィゼーシヨンを検 出するために通常標識されている。標識された核酸プローブまたはキヤプチヤーオリ ゴヌクレオチドを得る方法は、ハイブリダィゼーシヨンを阻害しなレ、方法であれば特に 制限されない。このような方法として、最終的な核酸プローブ作製に用いるプライマ 一を予め標識しておく方法、核酸プローブ作製中に標識する方法、及び、核酸プロ ーブ作製後に標識する方法、標識したキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを作製する方 法等が挙げられる。
[0059] プライマーを予め標識しておく方法、標識したキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを作 製する方法としては、標識ヌクレオチドを用いてプライマー合成を行う方法などが挙 げられる。核酸プローブ作製中に標識する方法として、核酸プローブ作製反応中に 標識したヌクレオチドをとりこませる方法などが挙げられる。また、作製反応後に標識 する方法としては、特開平 10—287870号に示される方法で標識する方法などが挙 げられる。
[0060] 核酸プローブまたはキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを標識する物質は、通常のハイ ブリダィゼーシヨン法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識 物質として蛍光物質ゃハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルォレセイン、ロー ダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シァニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビ ォチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフエニルなどが挙げられる。
[0061] 核酸プローブを作製するためのプライマーは、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドと共 に、ハプロタイプタイピングキットに含めることができる。
ハイブリダィゼーシヨンは、通常の核酸のハイブリダィゼーシヨンと同様にして行うこ とができる。以下に具体的な方法を例示する。
[0062] SSC (Standard Saline Citrate)などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)
、ゥシ血清アルブミンなどのブロッキング溶液、および反応促進のための添加剤から なる混合液に核酸プローブを加える。プローブが 2本鎖の場合は熱などによる変性を 行う。支持体上に核酸プローブ溶液を数/ L滴下した後、数時間加熱操作 (通常 30
°C一 80°C)を行い、支持体上に固定化されているキヤプチヤーオリゴヌクレオチドと 核酸プローブでハイブリッドを形成させる。
[0063] 適当な濃度の SSC溶液またはテトラメチルアンモニゥムクロリド溶液中に支持体を 沈め、加熱 (通常 37°C— 70°C)し、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に 残す。このとき、 SDSなどを加えても良い。
[0064] ハイブリッドの検出には核酸プローブに標識されている蛍光物質またはハプテン等 を使用する。蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いてハイブリダ ィズした核酸プローブに標識された蛍光を検出する。 [0065] ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタ ンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ 'パーォキシダーゼなど の結合体 (酵素コンジュゲート）を含む溶液を支持体上に加え、室温で数 10分間反 応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、キヤプチ ヤーオリゴヌクレオチドを固定した領域以外の支持体の領域をカゼインゃゥシ血清ァ ルブミンなどのタンパクを用いて被覆することによって酵素コンジュゲートと支持体の 非特異的吸着を阻止することができる。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後 、支持体上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数 10分間放置することに よって行うことができる。
[0066] 酵素コンジュゲートと核酸プローブのハプテンとの結合反応後、ハプテンと結合しな 力、つた酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄することによつ て、支持体上にはターゲット核酸中のハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが 残ることになる。
[0067] この後酵素コンジュゲートに結合されたアルカリフォスファターゼまたはホースラディ ッシュ 'パーォキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するような化合物を添カロ することでハイブリッドを形成している部分だけが可視化される。
[0068] ここで用いられる化合物としては、ニトロブルーテトラゾリゥムクロライド、 5_ブロモ _4 —クロ口 _3—インドリルリン酸一 p—トルイジン塩）、 3, 3，， 5, 5，ーテトラメチルベンチジ ンなどが用いられる。
[0069] 多型の検出は、得られたハイブリダィゼーシヨンの結果をもとに、キヤプチヤーオリゴ ヌクレオチド毎に沈着した色素または蛍光を検出することで行う。具体的には、キヤプ チヤ一オリゴヌクレオチド毎の発色量および蛍光強度を、対応するキヤプチヤーオリ ゴヌクレオチドと比較し、その量の大きレ、方をハイブリダィゼーシヨン陽性と判定する。 量が同じときは共に陽性と判定する。また、その基準は特に制限されないが、用いる 標識物質等によって異なるため、検出系毎に基準をきめることが望ましい。
[0070] 上記判定を多型部位毎に行い、各々の多型またはその組み合わせがいずれかの タイプと一致したとき、その種の豚であると判定される。豚は 2倍体なので交雑種の場 合、 2種の交雑と判定されることもある。 [0071] 表 4一 6に、配列番号 3— 121に示す塩基配列を有するキヤプチヤーオリゴヌクレオ チドを固定化して用いたときの、ハイブリダィゼーシヨンシグナルと豚の種類の対応を 示す。ここで表 3は MC 1 R遺伝子のものを表 4は KIT遺伝子のものを示す。
[0072] [表 4] 4
Figure imgf000019_0001
[0073] [表 5]
表 5
ぶた種別 配列番号
メイシャン、パークシヤー 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 モンカイ 18 20 22 25 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 丁ュロック 19 21 22 25 26 28 31 32 34 36 38 40 43 45 丁ュロック 19 21 22 25 26 29 31 32 34 36 39 40 43 45 白ぶた 19 21 22 25 26 28 31 32 34 37 38 40 43 45 白ぶた 19 21 22 25 26 28 31 32 34 36 38 40 43 45 白ぶた 19 21 22 25 26 28 31 32 34 36 38 40 43 45 白ぶた 19 21 22 25 26 28 31 33 35 36 38 40 43 45
/、ンプシヤー 19 21 22 25 26 28 31 32 34 36 38 40 43 45 バークシヤー 18 20 23 25 27 28 31 32 34 36 38 41 42 45 ぶた種別 配列番号
メイシャン、バークシヤー 46 48 50 52 54 56 58 60 62 65 67 69 71 73 モンカイ 46 48 50 52 55 56 58 60 62 65 67 69 71 73 丁ュロック 47 48 50 52 55 57 58 60 63 66 68 69 72 73 丁ュロック 47 48 50 52 55 57 58 60 63 66 68 69 72 73 白ぶた 47 48 50 52 55 56 58 60 63 66 68 69 72 73 白ぶた 47 48 50 52 55 56 58 60 63 66 68 69 72 73 白ぶた 47 48 50 52 55 56 58 60 63 66 68 69 72 73 白ぶた 47 48 50 52 55 56 58 60 63 66 68 69 72 73 ハンプシャー 47 48 50 52 55 56 58 60 64 66 68 69 72 73 バークシヤー 46 49 51 53 54 56 59 61 62 65 68 70 72 74
表 6
ぶた種別 配列番号
メイシャン、パ一クシャ一 75 77 79 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 モンカイ 75 77 79 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 丁ュロック 76 77 80 82 85 86 89 91 93 95 97 99 101 102 丁ュロック 76 77 80 82 85 86 89 91 93 95 97 99 101 102 白ぶた 76 77 80 82 85 86 89 91 93 95 97 99 101 102 白ぶた 76 77 80 82 85 86 89 91 93 95 97 99 101 102 白ぶた 76 77 80 82 85 86 89 91 93 95 97 99 101 102 白ぶた 76 77 80 82 85 86 89 91 93 95 97 99 101 102 ハンプシャー 76 77 80 83 85 86 89 91 92 95 97 99 101 102 バ一クシャ一 76 78 81 82 84 87 88 91 92 95 97 99 100 103
ぶた種別 配列番号
メイシャン 一クシヤー 104 106 108 110 112 114 116 118 120
モンカイ 104 106 108 110 112 114 116 118 120
デュロック 105 106 109 110 113 115 116 118 120
丁ュロック 105 106 109 110 113 115 116 118 120
白ぶた 105 106 109 110 113 115 116 118 120
白ぶた 105 106 109 110 113 115 116 118 120
白ぶた 105 106 109 110 113 115 116 118 121
白ぶた 105 106 109 110 113 115 116 118 120
ハンプシャー 105 106 109 110 113 115 116 119 120
バ一クシヤー 104 107 109 111 113 115 117 118 120
¾74600 [0075] 本発明のキットは、キヤプチヤーオリゴヌクレオチドを含む。また、本発明のキットは 、核酸プローブを作製するためのプライマーまたは標識核酸プローブ、緩衝液、ハプ テンを認識する酵素コンジュゲート等のハイブリダィゼーシヨン用の試薬などを含める こと力 Sできる。
実施例
[0076] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
[0077] < 1 >オリゴヌクレオチドの合成
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Perkin— elmer Applied biosystems)を 用いて、オリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後、乾燥させた。このオリゴヌク レオチド乾燥体を、 10mM Tris-HCl (pH7. 5)、 ImM EDTA緩衝液を用いて 溶解し、 100pmol/ /i Lのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。この合成法は、キヤプ チヤ一オリゴヌクレオチド又はプライマーとして使用するいずれのオリゴヌクレオチドに 対しても同様である。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号 3— 125に 示す。これらのうち、配列番号 3— 121がキヤプチヤーオリゴヌクレオチドであり、配列 番号 122— 125がプライマーである。キヤプチヤーオリゴヌクレオチドについては上記 合成機を用いて 5 '末端にアミノ基を結合させ、プライマーについては 5 '側にローダミ ン標識した。
[0078] < 2 >支持体へのキヤプチヤーオリゴヌクレオチドのスポッティング
5，末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液 10 μ Lに対してマイクロスポッティ ング溶液（TeleChem International In ）を 10 μ L混合し、マイクロタイタープレ ート（Greiner Laboratory In ）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位 置にシラン化スライドグラス（Matsunami Glass Ind. Ltd. )を配置し、スポッティ ングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を 数秒間あて、その後紫外線を 30mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホット プレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。 0. 1 %ドデシル硫酸ナトリウム 水溶液でスライドグラスをすすいだ後、蒸留水ですすいだ。スライドグラスを 3% BS A (ゥシ血清アルブミン）を含む lOOmM Tris-HCl (pH7. 5) , lOOmM NaCl, 0. 1 % Triton X-100に室温で 30分間浸し、ブロッキングした。その後室温で乾 燥させた後、 10mM Tris-HCl (pH7. 5) , ImM EDTA緩衝液で洗浄した。ス ライドグラスを再度室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷喑所にて保存した。
[0079] < 3 >プローブ核酸の調製
豚の DNAを铸型として、 PCRによりプローブ核酸を調製した。
各種の豚から得られた血液 50 μ Lをマイクロチューブに入れ、これに 10mM Tris -HC1 ρΗ8. 0, 0. 1Μ NaCl, ImM EDTA, 0. 5% SDS, 500 μ g/ mL proteinase Kを 500 μ 1カ卩ぇ混和したのち、 37。Cでー晚インキュベートした。 フエノーノレ：クロロフオルム：イソアミノレァノレコーノレ（25： 24： 1)溶液を 500 μ Lカロえ、撹 拌した後遠心（12000rpm、 1分間）し、水相を回収した。この操作を 3回繰り返した。 得られた水相にクロロフオルム：イソアミルアルコール（24 : 1)溶液を 500 μ L加え、撹 拌した後遠心（12000rpm、 1分間）し、水相を回収した。この操作を 2回繰り返した。 得られた水相中の DNAをエタノール沈殿により回収し、乾燥させ後、 TEバッファー（ 10mM Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ7· 5)に溶解し、 PCRテンプレート溶液 とした。
[0080] PCR反応液の組成は、 Taqポリメレースを lUnit、プライマーを各 10pmol、反応用 緩衝液 5 μ 1、 dNTPを各 10nmol、テンプレート DNA溶液を 0· 5 /i 1、および滅菌水 をカロえて総量 50 μ ΐとし、 1つの PCRテンプレートについて MC1R遺伝子を増幅する ため（配列番号 122と 123のプライマー）と KIT遺伝子を増幅するため（配列番号 12 4と 125のプライマー） 2種類用意する。チューブに入れた溶液をサーマルサイクラ一 にセットして、 94°Cで 3分間加熱した後、 94°C : 45秒間、 60°C : 60秒間、 72°C : 1分 間の反応を 30サイクル行レ、、その後 72°C : 3分間反応させた。
[0081] 本実施例では、確認試験として、次に記載のァガロースゲルを用いた電気泳動を 行ったが、実際の臨床における鑑別の際にはこの操作は必須ではなレ、。 PCR反応 混合物を Ι μ ΐ取り、 6 X泳動色素（30%グリセロール、 0. 25%ブロモフエノールブル 一、 0. 25%キシレンシァノール）を 1 μ 1、蒸留水 4 μ 1と混和した。 2%ァガロースゲ ル上で、 100V、 90分間の条件で泳動させた後、 0. 5 z g/mlェチジゥムブロマイド を含む蒸留水に 30分間浸し、紫外線照射下でゲルを CCDカメラで撮影した。その 結果、所望の増幅断片が得られたことが確認された。 [0082] < 4 >ハイブリダィゼーシヨン
< 3 >で作製した全てのプローブ核酸溶液を混ぜ、その後、 4 μ 1取り、 Arraylt U nihyb Hybridization Solution (TeleChem International Inc. ) 16 i 1をカ卩 えて混合し、 100°Cで 10分間加熱処理を行った後、氷中に 5分間浸した。このプロ一 ブ核酸溶液を 5 μ 1とり、 < 2 >で作製したキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを固定化し たスライドグラスにのせ、その上にカバーグラスをのせた。これを保湿箱に入れ、さら に 37°Cに設定した恒温器に入れて 120分間静置した。スライドグラスを取り出し、す ばやく室温下で 2 X SSC, 0. 1%SDS溶液（2 X SSC : 0. 033M NaCl, 0. 03 3Mクェン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去した。スライドグラスを室温下で 2 SSC, 0. 10/0SDS溶 f夜 (こ 5分 fP浸す操作を 2回行レヽ、 37。Cの 0. 2 X SSC, 0 . 1 %SDS溶液（0. 2 X SSC : 0. 0033M NaCl, 0. 0033Mタエン酸ナ卜リウム） に 5分間浸す操作を 2回行い、最後に 2 X SSCに浸した。
[0083] < 5 >蛍光の検出
ハイブリダィゼーシヨンを終えたスライドグラスを 2 X SSCから取り出し、遠心機（Bee kman社製）にセットし、 2000i"pmで 1分間遠心した。次に ScanArray4000 (GSI Lumonics社製）にスライドグラスをセットし、蛍光検出を行った。
[0084] 以上の結果および DNAシーケンス法によるタイピングとの関係を表 7に示した。本 発明の方法により、豚の種別判定が可能なことが明らかである。
[0085] [表 7]
Figure imgf000024_0001
産業上の利用の可能性
本発明により、豚の種別判定を、効率よく、かつ高精度で行うことができる

Claims

請求の範囲
[1] 1種又は 2種以上のキヤプチヤーオリゴヌクレオチドを含み、これらのキヤプチヤーオ リゴヌクレオチドと被検体豚由来の核酸とのハイブリダィゼーシヨンにより検出される 多型又はその組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別するためのキットであ つて、前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、配列番号 1に示す塩基配列を基準と する KIT遺伝子の塩基配列において、 1159位及び 1209位に相当する位置のいず れか一方又は両方の位置における多型を検出し得るオリゴヌクレオチドを含むことを 特徴とするキット。
[2] 前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されていることを特徴とす る請求項 1に記載のキット。
[3] 前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、前記 KIT遺伝子の塩基配列において、 39 8位、 549位、 595位、 659位、 844位、 884位、 959位、 1313位、 1342位、 1632 位、 1724位、 1986位、 2179位、 2295位、 2313位、 2314位、 2360位、 2377位、 2391位、 2429位、 2449位、 2470位、 2472位、 2600位、 2611位、 2622位、 26 63位、 2674位、 2680位、 2717位、 2834位、 2840位、 2899位、 3020位、 3049 位、 3207位、 3221位、 3258位、 3296位、 3317位、 3323位、 3341位、 3373位、 3387位、 3420位、 3482位、 3597位、 3666位、 3705位、 3737位、 3773位、 38 84位、 3885位、 3886位、及び 3887位力 選ばれる 1又は 2以上の位置の多型を 検出し得るオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項 1又は 2に記載のキット。
[4] 前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター遺伝 子（以下、「MC1R遺伝子」という）における 1又は 2以上の位置における多型を検出 し得るオリゴヌクレオチドを含む請求項 1一 3のいずれか一項に記載のキット。
[5] 前記 MC1R遺伝子における多型力 配列番号 2に示す塩基配列において、 154位 、 176位、 234位、 241位、 361位、 367位、 598位、及び 600位力も選ばれる位置 に相当する位置における多型である請求項 4に記載のキット。
[6] 前記キヤプチヤーオリゴヌクレオチドは、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的 又は相同な塩基配列を有し、 10— 40塩基長である請求項 1一 5のいずれか一項に 記載のキット。
[7] 配列番号 1に示す塩基配列を基準とする KIT遺伝子の塩基配列において、 1159 位又は 1209位に相当する位置における多型をハイブリダィゼーシヨンにより検出し 得るオリゴヌクレオチド。
[8] 前記多型部位を含む領域の塩基配列に相補的又は相同な塩基配列を有し、 10— 40塩基長である請求項 7に記載のオリゴヌクレオチド。
[9] 被検体豚由来の核酸と、請求項 1一 6のいずれかに記載のキットに含まれるキヤプ チヤ一オリゴヌクレオチドとのハイブリダィゼーシヨンを行レ、、各々のキヤプチヤーオリ ゴヌクレオチドについて被検体豚由来の核酸とのハイブリッド形成の有無を検出し、 被検体豚の塩基配列中の多型を同定することによって、被検体豚の種別を判別する 方法。
[10] 被検体豚の KIT遺伝子中の 1又は 2以上の多型を検出し、検出される多型又はそ の組み合わせによって、同被検体豚の種別を判別する方法であって、前記多型は、 配列番号 1に示す塩基配列を基準とする KIT遺伝子の塩基配列にぉレ、て、 1159位 及び 1209位に相当する位置のいずれか一方又は両方の位置における多型を含む ことを特徴とする方法。
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