JPH11243995A - 尿サンプル中の膀胱癌の検出 - Google Patents

尿サンプル中の膀胱癌の検出

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JPH11243995A
JPH11243995A JP10365689A JP36568998A JPH11243995A JP H11243995 A JPH11243995 A JP H11243995A JP 10365689 A JP10365689 A JP 10365689A JP 36568998 A JP36568998 A JP 36568998A JP H11243995 A JPH11243995 A JP H11243995A
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telomerase rna
seq
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telomerase
rna
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JP10365689A
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Thomas Dr Emrich
エンリッヒ トーマス
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Roche Diagnostics GmbH
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/158—Expression markers

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 膀胱癌の検出のための、高い感度および再現
性を有し、さらにサンプル収集および調製についてもル
ーチンの診断用途に適する方法、およびそれに適したキ
ットを提供すること。 【解決手段】 (a) 尿サンプルを調製し、(b) 該サンプ
ル中のテロメラーゼＲＮＡを測定する、各工程を含んで
なる、尿サンプル中の膀胱癌の検出方法；並びに、(a)
テロメラーゼＲＮＡを逆転写するためのプライマー、
(b) 逆転写のための試薬、(c) 逆転写によりテロメラー
ゼＲＮＡから得られたＤＮＡを増幅するためのプライマ
ー対、(d) 核酸増幅のための試薬、および(e) マーカー
基を含む、テロメラーゼＲＮＡの検出のための試薬キッ
ト。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、尿サンプル中の膀
胱癌細胞を検出するための方法並びにそれに適した試薬
に関する。
【０００２】
【従来の技術】膀胱の尿路上皮癌は最も多く見られる尿
路の悪性腫瘍であり、100,000人中約15人において発生
する。現在、膀胱癌の検出には侵襲的な細胞視的(cytos
copic)検査を要する。膀胱の尿路上皮癌を検出するため
の信頼できる非侵襲的な方法があれば、膀胱癌患者の診
断並びにアフターケアに新たな機会が開かれることにな
る。さらに、そのような方法は喫煙者や化学工業におけ
る労働者等の罹患の危険性のあるグループの人々をスク
リーニングするのにも有用であろう。
【０００３】ヒト・テロメラーゼは、テロメア(terome
r)末端のde novo合成を引き起こし得るリボヌクレオタ
ンパク質である。テロメアは染色体の末端の特異的構造
であり、真核生物においては、例えばヒトにおける配列
TTA GGGのような短い配列の多数の反復からなる。体細
胞においては、細胞の複製のたびに必ずテロメア末端が
短くなり、テロメアが一定の長さ未満になったとき、最
終的に細胞死を招く。
【０００４】これに対し、ウイルスで形質転換されてい
るか、あるいは腫瘍細胞のような不死化された細胞はテ
ロメア長の減少を示さない。これはテロメラーゼの活性
によるものである。これまでの知見によればテロメラー
ゼの発現は腫瘍細胞、生殖細胞および不死化細胞に限定
されているので、これは腫瘍の診断並びに腫瘍治療の攻
撃点の有望なパラメーターである。
【０００５】テロメラーゼをコードする遺伝子のＲＮＡ
ドメインの構造が最近マウス(Blascoら、Science 269
(1995), 1267-1270)およびヒト(Fengら、Science 269
(1995), 1236-1241)において決定された。ヒト・テロメ
ラーゼＲＮＡ(hTR)の遺伝子は第３染色体のq 26.3部分
に位置する(Soderら、Oncogene 14 (1997), 1013-1021;
Perkinsonら、Eur. J. Cancer 33 (1997), 727-734)。
種々の下等真核生物由来のテロメラーゼのタンパク質ド
メインも知られている(Collinsら、Cell 81 (1995), 67
7-686)。発現がテロメラーゼ活性と関連する相同タンパ
ク質をコードするｍＲＮＡが最近ヒトにおいて発見され
た(Nakamuraら、Science 277 (1997), 959-969; Meyers
onら、Cell 90 (1997), 785-795)。
【０００６】テロメラーゼ活性を測定することによる膀
胱癌の検出方法が知られている(Mullerら、Int. J. Onc
ol. 9 (1996), 1169-1173; Yoshidaら、Cancer 79 (199
7),362-369; Linら、Clin. Cancer Res. 2 (1996), 929
-932およびKinoshitaら、J.Natl. Cancer Inst. 89 (19
97), 724-730; Dalbagniら、Clinic Cancer Res. (199
7), 1593-1598; WO97/35871)。
【０００７】Linらは、膀胱癌患者からの組織サンプル
中のテロメラーゼ活性の検出を記載している。97.5%の
感度が観察されている。しかしこの方法は、サンプルが
侵襲的な手段によってしか得られず、臨床的ルーチンに
おける応用には適していないという欠点を有する。
【０００８】Mullerらは、膀胱癌患者からの組織サンプ
ルおよび膀胱洗浄液におけるテロメラーゼ活性の検出を
記載している。膀胱癌患者の尿中にはテロメラーゼ活性
は検出されなかった。Yoshidaらは、膀胱患者の尿のテ
ロメラーゼ活性の検出を記載している。62%の試験感度
が観察されている。Kinoshitaらも尿サンプル中のテロ
メラーゼ活性の検出を記載しており、ここでは55%の感
度が観察されている。Dalbagniらは尿サンプル中のテロ
メラーゼ活性の検出を記載している。この試験の感度は
それぞれの腫瘍のステージに応じて18〜50%であった。
【０００９】WO97/35871は、テロメラーゼ活性を測定す
ることによる尿サンプル中の膀胱癌細胞の検出方法を記
載している。サンプルを凍結させずに直接その後の処理
にかけた場合、87%の感度が記載されている。
【００１０】これらの先行技術に関しては、テロメラー
ゼ活性は膀胱癌の検出の有用である可能性のあるパラメ
ーターであるが、従来の非侵襲的な方法では信頼性のあ
る結果が得られなかったことは明らかである。種々の研
究者により得られた結果はそれぞれ互いに大きく異な
り、特に尿サンプル中のテロメラーゼ活性を測定した場
合にそうであり、これは再現性についての重大な問題を
示している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、先行技術の欠点を少なくとも部分的には排除した膀
胱癌の検出のための新規な非侵襲的方法を提供すること
である。特に、そのような方法は高い感度と再現性を有
し、さらにサンプル収集および調製についてもルーチン
の診断用途に適したものでなければならない。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的は、(a) 尿サン
プルを調製し、(b) 該サンプル中のテロメラーゼＲＮＡ
を測定する、各工程を含んでなる、尿サンプル中の膀胱
癌の検出方法により達成される。
【００１３】驚くべきことに、本発明の方法は、酸性の
pH、RNアーゼ、塩および尿素が存在する尿のような特異
なサンプル中のテロメラーゼＲＮＡの感度の高い再現性
のある検出を可能とする。本発明の方法を従来のテロメ
ラーゼ酵素活性の測定方法と比較すると、本発明による
テロメラーゼＲＮＡの測定は、同じタイプのサンプル調
製物では感度と再現性において有意な利点を有する。サ
ンプル中のテロメラーゼＲＮＡの存在は、特にテロメラ
ーゼＲＮＡの量が予め定められた閾値を越えた場合に、
膀胱癌の存在の指標となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の方法の工程(a)は、尿サ
ンプルを調製することを含む。この尿サンプルは好まし
くは哺乳動物から得たものである。特に好ましくはヒト
尿サンプルである。工程(a)は好ましくは、例えば遠心
分離により尿から細胞を単離し、それらを溶解すること
を含む。この溶解は例えば、0.01〜5重量%の非イオン性
あるいは両性界面活性剤（例えばCHAPS）を含む抽出バ
ッファーにより細胞を処理する界面活性剤抽出により行
うことができる。また細胞溶解には、例えば市販のRNAz
olキットによるＲＮＡ濃縮も含み得る。いずれの溶解法
も同等な結果が得られる。熱変性による細胞溶解も可能
である。
【００１５】細胞は好ましくは例えばRNAsinのようなRN
アーゼ阻害剤の存在下で行う。溶解後、サンプルを凍結
し、測定のために再解凍することができる。凍結は、好
ましくは液体窒素中でショック凍結により行う。凍結の
後、サンプルは-80℃の温度において数週間から数ヶ月
安定である。
【００１６】しかし、必ずしもサンプルを凍結しなけれ
ばならないという訳ではない。驚くべきことに、テロメ
ラーゼＲＮＡは、4℃あるいは室温で数日間貯蔵した後
で尿を処理しなくとも高い信頼度で検出できることが見
出された。尿サンプル中のテロメラーゼＲＮＡの酵素活
性は非常に短い貯蔵期間の後でも検出不可能になってし
まうので、これは予測されなかった知見である。サンプ
ルの収集およびサンプルの調製は通常異なる人員により
異なる場所で行われるので、この驚くべきサンプルの安
定性は診断におけるルーチンな用途に必須の条件であ
る。
【００１７】本発明の方法の工程(b)は、テロメラーゼ
ＲＮＡの測定、好ましくはヒト・テロメラーゼＲＮＡの
測定を含む。この測定は、マーカー基を用いずに、ある
いは放射性マーカー基または非放射性マーカー基を使用
して行うことができる。非放射性マーカー基が好ましく
使用される。公知のマーカー基はいずれも非放射性マー
カー基として使用することができ、例えば、検出抗体と
反応することができるヌクレオチド類似体あるいはハプ
テンのような免疫学的に反応性である基、ペルオキシダ
ーゼ、ガラクトシダーゼ、あるいはアルカリホスファタ
ーゼのような酵素、蛍光基、あるいは化学発光もしくは
電気化学発光基のような発光基、供与体-受容体系、あ
るいはNMR-活性マーカー基または電子高密度基等のその
他の検出基を使用することができる。免疫学的に反応性
である基が好ましく、例えばハロゲン誘導化ヌクレオチ
ド（例えば、Br-dUTP）のようなヌクレオチド類似体、
またはCH3-dCTPのような少なくとも1個の炭素原子を含
む有機基で誘導化したヌクレオチド、またはジゴキシゲ
ニン、ジゴキシン、フルオレセイン等のハプテン、アク
リジニウムエステルのような発光基、ルテニウム錯体の
ような発光金属錯体、フルオレセインのような蛍光基、
および蛍光共鳴エネルギー移動系のような供与体-受容
体系等がある。
【００１８】本発明の方法の工程(b)によるテロメラー
ゼＲＮＡの測定は、好ましくはテロメラーゼＲＮＡを相
補的ＤＮＡに転写する逆転写工程を含む。さらに、測定
は好ましくは核酸増幅工程も含む。増幅工程の種類は本
発明の方法にとって重要ではない。典型的には、増幅
は、核酸ポリメラーゼや核酸リガーゼのような核酸を重
合することができる適当な酵素を添加することにより行
う。耐熱性酵素を使用し、増幅を複数のサイクル行うこ
とが好ましい。酵素は特に好ましくは耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ、例えばTagポリメラーゼである。特に好まし
い増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。本発
明によるヒト・テロメラーゼＲＮＡの測定は特に好まし
くは逆転写とPCRの組合せを含む。
【００１９】増幅には、テロメラーゼＲＮＡあるいはそ
れから合成されるｃＤＮＡに相補的な2種のプライマー
を使用することが好ましい。ヒト・テロメラーゼＲＮＡ
の場合、適当なプライマー配列は前掲のFengらにより記
載されたヌクレオチド配列に基づいて選択することがで
きる。例えば、(a) 配列番号1および配列番号2に示した
ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド、および(b) 少
なくとも5ヌクレオチドの長さを有する、配列番号1およ
び配列番号2に示したヌクレオチド配列の部分配列を含
むヌクレオチド、から選択されるプライマー対を核酸増
幅に使用することができる。
【００２０】本発明の方法により、テロメラーゼＲＮＡ
を定性的にあるいは定量的に検出することができる。試
験においてテロメラーゼＲＮＡから得られた増幅産物が
特に予め決められた閾値を越える結果が得られた場合、
陽性であると判断する。閾値は、正常な患者にときとし
て見られる弱いシグナルが陰性に分類され、膀胱癌患者
から得られる強いシグナルが陽性に分類されるように特
定することが好ましい。癌の攻撃性(agressiveness)に
従ってシグナル強度が増加するので、テロメラーゼＲＮ
Ａを量的に検出することにより癌の分化の程度あるいは
ステージについて出すべき結論が得られる。
【００２１】一方、検出は、例えば非変性アガロースゲ
ル中での分離のような、大きさによる反応混合物の分離
を含むものとすることができる。大きさに加えて、増幅
産物のその他の特性も識別に使用することができ、例え
ば増幅産物の制限酵素部位の存在／不存在、溶融温度等
を使用することができる。
【００２２】あるいは、本発明の方法により得られた増
幅産物は前もって反応混合物を分離することなく分析す
ることもでき、例えば固相上への固定の後、あるいは均
一試験フォーマット（homogeneous test format）にお
けるオンライン検出により分析することができる。例え
ば反応容器の壁を固相とすることができる。さらに、粒
子状の固相を使用することもできる。固相は、好ましく
は、マイクロタイタープレート、微量反応容器、膜、マ
イクロチップ、バイオコア系、および場合によっては磁
性マイクロビーズから選択する。固定化の利点は、時間
を大幅に節約でき、手作業を少なくできることである。
さらに、サンプルの高いスループットおよび自動化（例
えばルーチンの分析のため）も可能である。
【００２３】増幅産物は原則として、任意の公知の方
法、例えば吸着結合により固相上に固定化することがで
きる。好ましくは、固定化は特異的な相互作用、例えば
アンカー基により得られる。適当なアンカー基の例とし
ては、固相結合抗体と反応できる免疫学的に反応性であ
る基、あるいは固定されたパートナーに高い親和性で結
合できるその他の基が挙げられる。アンカー基の好まし
い例としてはビオチンが挙げられ、これはアビジンある
いはストレプトアビジン被覆固相に高い親和性で結合で
きる。
【００２４】オンライン検出は例えば、供与体-受容体
検出系、あるいは均質検出法におけるアクリジニウムエ
ステル検出基により行うことができる。適当な試験形式
はArnold Jr.ら(Clin. Chem. 35 (1989), 1588-1594)に
より記載されている。マーカーあるいはアンカー基は本
発明の方法の種々の段階で増幅産物に導入することがで
きる。すなわち、例えば既にマーカー基および／または
アンカー基を含む1種または複数のプライマーを使用す
ることができる。また、標識されたヌクレオチドを増幅
の間に増幅産物中に導入することもできる。
【００２５】しかし本発明の好ましい態様においては、
増幅産物自体がアンカーおよび／またはマーカー基を含
む必要は全くない。これらの基は、試験条件下で増幅産
物に安定にハイブリダイズすることができ、この形態で
特異的検出ができる１種または複数のハイブリダイゼー
ションプローブに存在してもよい。固相への固定は、例
えば、１または複数のアンカー基を有する１種または複
数種の捕獲プローブを加えることにより行うことができ
る。またマーカープローブは対応する形式で増幅産物を
検出するのにも使用することができる。適当なハイブリ
ダイゼーションプローブの例は、アンカーまたはマーカ
ー基をその5'または3'末端に含むオリゴヌクレオチドで
ある。また、例えばペプチド核酸のような核酸類似体を
ハイブリダイゼーションプローブとして使用することも
できる(Nielsenら、Science 254(1991), 1497-1500およ
びDueholmら、J. Org. Chem. 59 (1994), 5767-5773)。
【００２６】テロメラーゼＲＮＡは、好ましくは増幅産
物中に含まれるマーカー基により、あるいは増幅産物に
結合したマーカープローブにより、公知の方法で検出す
る。検出は好ましくは、自動化測定装置において非放射
性マーカー基を使用して行う。マーカー基を比色測定お
よび／または分光測定法により、例えば基質の酵素変換
あるいは化学発光もしくは蛍光で検出する測定装置が好
ましい。
【００２７】本発明の方法は、好ましくは、テロメラー
ゼＲＮＡの測定に加えて、標準核酸および特にサンプル
中のテロメラーゼＲＮＡとは異なるＲＮＡを測定するよ
うに行う。核酸様の分子、例えば核酸類似体も標準核酸
として使用することができる。
【００２８】標準は、好ましくはそれぞれの生物により
構成的に発現されるＲＮＡ、例えばヒトrＲＮＡ、特に2
8S rＲＮＡ、β2-ミクログロブリンｍＲＮＡあるいはGA
PDH-ｍＲＮＡである。あるいは例えばサンプルの調製の
前、または増幅の前に外部からサンプルに加えられた核
酸、特にＲＮＡもまた、標準として使用することができ
る。さらには、例えば1または複数のヌクレオチド構築
ブロックの挿入および／または欠失による配列の変異の
ような１または複数の特徴に基づいて検出対象のテロメ
ラーゼＲＮＡとは区別できる修飾テロメラーゼＲＮＡも
また、標準として使用することができる。標準は好まし
くはヒト・テロメラーゼＲＮＡの測定に類似した方法で
測定され、例えば逆転写および／または核酸増幅を含ん
でもよい。標準は特に好ましくは逆転写とPCRの組合せ
を使用して測定される。
【００２９】ヒトβ2-ミクログロブリンＲＮＡを標準と
して測定する場合は、(a) 配列番号3および配列番号4に
示したヌクレオチド配列を有するヌクレオチド、および
(b) 少なくとも5ヌクレオチドの長さを有する、配列番
号3および配列番号4に示したヌクレオチド配列の部分配
列を含むヌクレオチド、から選択されるプライマー対を
核酸増幅に使用することが適当であることが判った。
【００３０】本発明の方法は、特に増幅副産物を分離す
ることなくテロメラーゼＲＮＡおよび（存在する場合に
は）標準の特異的検出を可能とする条件下にテロメラー
ゼＲＮＡおよび（場合により）標準を検出する場合は、
ワンポット反応として行うことができる。
【００３１】この特異的検出は、増幅産物が電気泳動に
より分離される場合には、電気泳動媒体における特徴的
な大きさのバンドを決定することにより簡単な方法によ
り行うことができる。標準を並行して測定する場合は、
増幅においてヒト・テロメラーゼＲＮＡ増幅産物の大き
さとは明確に区別される大きさの産物を生成するプライ
マー対をこの場合に使用することが便利である。特異的
な検出は、増幅産物のその他の特性に基づいて、対応す
る方法により行うこともできる。
【００３２】例えば固定化あるいはオンライン検出によ
り、前もって分離せずに増幅混合物の産物を分析する場
合は、ヒト・テロメラーゼＲＮＡ、標準と任意の増幅副
産物と区別は、例えば異なる標識および／またはアンカ
ー基(例えばそれぞれ異なる基を有するプライマー、捕
獲プローブおよび／またはマーカープローブ)を使用す
ること、そのような特異的検出を可能とするハイブリダ
イゼーション条件を選択すること、および／または標準
およびテロメラーゼＲＮＡ増幅産物を固相の異なる部位
または異なる固相上に固定すること等の種々の手段によ
り行うことができる。さらに、プライマー配列に相補的
な非標識オリゴヌクレオチドあるいは核酸類似体(競合
物質)を加えて、これらの配列領域をマスクし、捕獲あ
るいは検出プローブとのハイブリダイゼーションが増幅
産物の内部配列において特異的に起こるようにすること
により特異性を改善することができる。
【００３３】本発明のさらに別の態様は、(a) テロメラ
ーゼＲＮＡを逆転写するためのプライマー、(b) 逆転写
のための試薬、(c) 逆転写によりテロメラーゼＲＮＡか
ら得られたＤＮＡを増幅するためのプライマー対、(d)
核酸増幅のための試薬、および(e) 例えば非放射性マー
カー基のようなマーカー基、を含む、テロメラーゼＲＮ
Ａの検出のための試薬キットである。
【００３４】マーカー基は適当に標識されたヌクレオシ
ド三リン酸および／または標識プライマーの形態で存在
することができる。また、マーカー基は試験条件下で増
幅産物とハイブリダイズする１種または複数種のマーカ
ープローブ上に存在することもできる。
【００３５】上記試薬キットはさらに固相アンカー基お
よび固相を含むことができる。固相アンカー基は好まし
くはビオチンであり、固相はストレプトアビジンおよび
／またはアビジンで被覆されたものである。固相アンカ
ー基は、修飾ヌクレオシド三リン酸の形態で存在しても
よく、プライマー上に存在してもよい。あるいは、固相
アンカー基は増幅産物とハイブリダイズする捕獲プロー
ブ上に存在してもよい。
【００３６】あるいは、試薬キットは、検出基と、場合
によっては特に均一試験フォーマットでオンライン検出
を可能とするハイブリダイゼーションプローブとを含む
ものとすることができる。
【００３７】逆転写および核酸増幅のための試薬は、好
ましくは酵素、ヌクレオシド三リン酸、および任意にそ
れぞれの目的に適当なバッファー基質を含む。さらに、
本発明の試薬キットは、テロメラーゼＲＮＡとは異なる
標準核酸の逆転写のためのプライマー、および逆転写に
より標準から得られたＤＮＡを増幅するためのプライマ
ー対を含むものとすることができる。
【００３８】特に好ましい態様においては、試薬キット
は１種または複数種のハイブリダイゼーションプロー
ブ、例えばマーカーおよび／または固相アンカー基を含
み、かつ増幅産物あるいは標準を使用した場合にはその
増幅産物とハイブリダイズするマーカーおよび／または
捕獲プローブを含む。このマーカーおよび捕獲プローブ
は、好ましくはオリゴヌクレオチドおよび核酸類似体、
特にペプチド核酸から選択される。
【００３９】さらに試薬キットは、陽性および／または
陰性対照、並びに検出反応を定量するための内部標準、
および標準と増幅産物とを別々に検出するための対応す
る試薬も含むものとすることができる。本発明の試薬キ
ットは、例えば上記したような、膀胱癌の検出のための
非侵襲的な方法に使用するのに特に適している。
【００４０】
【実施例】本発明を以下の実施例および配列表によりさ
らに説明する。配列番号1および2は、ヒト・テロメラー
ゼＲＮＡを測定するための増幅プライマーを示す。配列
番号3および4は、β2-ミクログロブリンｍＲＮＡを標準
として測定するための増幅プライマーを示す。配列番号
5および6は、テロメラーゼ活性を測定するためのプライ
マーを示す。
【００４１】1.尿サンプルの収集および前処理 膀胱の尿路上皮癌と確認された30人の患者、その他の泌
尿器疾患(尿石症、尿道の感染症)を有する15人の患者、
膀胱癌のアフターケアにある3人の患者、および20人の
健康なボランティアからそれぞれ、朝2回目の尿のサン
プル100 mlを収集した。
【００４２】全てのサンプルのその後の処理は15分以内
に行った。サンプルを50 mlの2つのアリコートに分け
た。両方のアリコートを遠心分離し、PBSで2回洗浄し、
その後1つのサンプルをCHAPS抽出にかけ、他方をRNAzol
抽出にかけた。
【００４３】CHAPS抽出については、遠心分離した尿か
ら得た細胞ペレットを200 μlの溶解バッファー(10 mM
トリス-HCl、pH 7.5、1 mM MgCl2、1 mM EGTA 、0.1 mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド、5 mMβ-メルカ
プトエタノール、0.5% CHAPS, 10%グリセリン)を使用し
てKimらの方法(Science 266 (1994), 2011-2015)により
溶解した。その後溶解物を液体窒素中でショック凍結
し、-80℃で保存した。
【００４４】遠心分離した尿から得たペレットのRNAzol
抽出は製造者の説明書に従って行った(WAK-Chemie-Medi
cal GmbH, Bad Homburg, Germany)。溶解物を液体窒素
中でショック凍結し、-80℃で保存した。
【００４５】2.テロメラーゼ検出方法 2.1テロメラーゼ活性の検出(TRAPアッセイ) TRAPアッセイはKimらにより記載された方法(前掲)によ
り行った。サンプルのタンパク質含量はビュレット法を
用いて測定した。10μgのタンパク質濃縮物、20 mM ト
リス-HCl (pH 8.3)、1.5 mM MgCl2、63 mM KCl 、0.005
% Tween-20、1 mM EGTA 、50μMデオキシヌクレオチド
三リン酸、0.1 μg のオリゴヌクレオチドTS(配列番号
5: 5'-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3')、1 μgのT4g32 タ
ンパク質（Boehringer Mannheim)、および0.1 mg/mlウ
シ血清アルブミンを35℃で30分インキュベートした。1
μgのRNアーゼとインキュベートしたサンプルおよび溶
解バッファーまたはH2Oを含むブランクサンプルを陰性
対照として調べた。
【００４６】増幅のため、2.5 U Taq-ＤＮＡポリメラー
ゼ(Perkin-Elmer, Weiterstadt, Germany)および0.1μg
オリゴヌクレオチドCx(配列番号6: 3'-AAT CCC ATT CCC
ATTCCC ATT CCC-5')を50μｌのサンプル容量に加え
た。30回のPCRサイクル(94℃で30秒、50℃で30秒、72℃
で90秒)をサーモサイクラー(TC9600, Perkin-Elmer, We
iterstadt, Germany)中で行った。
【００４７】PCR産物は非放射性標識により検出した。
このため、Cxプライマーを蛍光染料FAM(Perkin-Elmer,
Weiterstadt, Germany)により標識した。GeneScan Soft
wareパッケージ(Perkin-Elmer, Weiterstadt, Germany)
を使用して、自動シークエネーター（sequenator）377
上で4.5%ポリアクリルアミドゲル/6M尿素シークエンシ
ングゲル中での電気泳動の後に蛍光増幅産物を検出し
た。
【００４８】並行してテロメラーゼPCR-ELISAキット(Bo
ehringer Mannheim, Mannheim, Germany)を使用し、ビ
オチン標識TSプライマーを使用して非放射性PCR産物を
検出した。
【００４９】2.2 RT-PCRによるヒト・テロメラーゼＲＮ
Ａ(hTR)の検出 RNAzol抽出物からの全部で2μgのＲＮＡあるいはCHAPS
抽出物からの全部で2μgのタンパク質を使用してRT-PCR
を行った。PCRは、TitanTM One Tube RT PCRシステム(B
oehringer Mannheim)からの試薬とそれぞれについて以
下に記載するプライマー対の150μMを含む反応混合物の
23μlを加えた後に行った。変性工程(94℃で6分)および
逆転写(65℃で30分)の後、追加の短い変性工程およびPC
R(94℃で30秒、65℃で1分、伸長: 60℃で7分)を25サイ
クル行った。
【００５０】テロメラーゼＲＮＡを検出するため、プラ
イマー対TE-hTR 5.3(配列番号1: 5'-AAC TGA GAA GGG C
GT AGG CGC CGT GC-3')およびTE-hTR 3.1(配列番号2:
5'-GTT TGC TCT AGA ATG AAC GGT GGA AG-3')を使用し
て長さ111 bpの増幅産物を得た。プライマー対TE-β2M
5.2(配列番号3: 5'-TTC ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-
3')および(配列番号4: 5'-GGC ATC TTC AAA CCT CCA TG
A TG-3')を内部標準として使用してβ2-ミクログロブリ
ンｍＲＮＡを検出し、119 bpの産物を得た。PCR産物の
非放射性検出のために、それぞれプライマーのいずれか
一つ(TE-hTR 5.3またはTE-β2M 5.2)をFAM(Perkin-Elme
r Company)で標識した。PCR産物の電気泳動と検出は2.1
の項に記載したように行った。
【００５１】膀胱癌からのヒト組織サンプルおよびヒト
膀胱癌細胞系J82 (ATCC HTB1)からの細胞のサンプルを
陽性対照として使用した。この細胞系は10%ウシ胎児血
清、2% L-グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシ
ンを含むDMEM (Gibco)で培養した。
【００５２】3.結果 J82細胞および膀胱癌からの組織サンプルにおいてCHAPS
溶解物中並びにRNAzol抽出により得られたＲＮＡ調製物
中に多量のヒト・テロメラーゼＲＮＡ(hTR)が検出され
た。これらのサンプル中においては高いテロメラーゼ活
性も見られた。hTRの測定については、119 bp(β2-ミク
ログロブリンｍＲＮＡの存在)および111bp(hTRの存在)
の明確なバンドを有するサンプルのみを陽性と分類し
た。119 bpのバンドを有し、111 bpのバンドを有してい
ない(hTRの不在)サンプルは陰性と分類した。
【００５３】テロメラーゼ陽性サンプルのTRAPアッセイ
により、GeneScan分析の後、特徴的な6 bpラダーが示さ
れた。テロメラーゼPCR ELISAにおいて、テロメラーゼ
陽性サンプルは250および2,000の間の吸収(A450-A690)
を示した。RNアーゼで処理したサンプルはテロメラーゼ
活性を示さなかった。ブランクサンプル(溶解バッファ
ーまたは水)もテロメラーゼ活性を示さなかった。テロ
メラーゼPCR ELISAにおいてテロメラーゼ陰性サンプル
および対照は100未満の吸収を示した。TRAP産物の検出
の両方法(GeneScan分析またはテロメラーゼPCR ELISA)
は同等な結果を与えた。
【００５４】RT-PCRを使用して、膀胱癌と確認された患
者からの30の尿サンプル中25(82%)に検出可能な量のhTR
が見出された。テロメラーゼ活性は2つの症例のみに見
られた(7%)。RT-PCRにより、hTRは健康なボランティア
からの20のサンプル中3つに見られた(15%)。
【００５５】悪性疾患を有していないが、公知の良性の
泌尿器疾患、例えば尿路結石、泌尿器の感染等を有する
患者においては、hTRは全部で15のサンプル中4つに見ら
れた(27%)。泌尿器感染および初期には検出可能なhTRを
有していた一人の女性患者においては、感染を治療した
後にはhTRは検出されなかった。テロメラーゼ活性はい
ずれの患者にも検出されなかった。
【００５６】膀胱癌のアフターケアの途中の3名の患者
のサンプルを調べた。悪性疾患の再発が見られなかった
これらの患者においてはいずれもhTRあるいはテロメラ
ーゼ活性は検出されなかった。結果を以下の表にまとめ
る。表１は、臨床病理学的分類と、組織学的に確認され
た膀胱癌の患者からの尿サンプル中におけるhTRおよび
テロメラーゼ活性の検出の結果を示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】表2は、膀胱癌患者、良性泌尿器疾患患
者、および健常者の尿におけるhTRの検出の結果を編集
したものである。
【００５９】
【表２】サンプル hTR‐陽性サンプル hTR‐陰性サンプル 合計 統計値 膀胱癌から 25(83％) 5 30の尿 良性疾患 4(27％) 11 15からの尿 正常尿 3(15％) 17 20 感度 83 ％ 陽性予測値 81 ％
【００６０】表3は、膀胱癌患者からの組織サンプル、
膀胱洗浄液、および尿中のテロメラーゼ活性を調べた3
組の異なる著者の刊行物からの結果を比較したものであ
る。
【００６１】
【表３】サンプル Mullerら Yoshidaら Kinoshitaら 組織 96％ 86％ 98 ％ 膀胱洗浄液 73% − 84 ％ 尿 0％ 62％ 55 ％
【００６２】表2および表3の比較は、本発明の方法が先
行技術のその他の非侵襲的な方法よりも有意に優れてい
ることを示している。hTR試験により得られた別の結果
を以下の表4および5に示す。表4は、膀胱癌と確認され
た患者の組織サンプル、膀胱洗浄液、および尿サンプル
中のhRTの検出の結果を示す。表5は、確認された膀胱
癌、良性泌尿器疾患(尿路結石、泌尿器感染)患者、およ
び健康なボランティアの尿サンプルにおけるhTRの検出
の結果を示す。
【００６３】
【表４】サンプル hTR‐陽性サンプル hTR‐陰性サンプル 合計 組織 27(96 ％) 1 28 膀胱洗浄液 25(89 ％) 3 28 尿 23(82％) 5 28
【００６４】
【表５】サンプル hTR‐陽性サンプル hTR‐陰性サンプル 合計 膀胱癌から 36(80 ％) 9 45 の尿 良性疾患 2(22 ％) 7 9 からの尿 正常尿 2( 7 ％) 26 28
【００６５】これらの結果も、本発明の方法の高い感度
および高い陽性予測値を裏付けるものである。
【００６６】実施例2 101〜106個のテロメラーゼ陽性J82細胞を50 mlの尿に加
えた後、細胞を実施例1に記載したように単離し、RT-PC
Rによりヒト・テロメラーゼＲＮＡ成分の存在について
調べた。50 mlの尿あたり104個以上の細胞により明確な
陽性の結果が得られた。
【００６７】並行した試験において、スパイクした尿サ
ンプルを4℃において貯蔵し、その後実施例1に記載した
ように処理し、RT-PCRによりヒト・テロメラーゼＲＮＡ
成分の存在について調べた。48時間の保存の後、この場
合も50 mlの尿あたり104個以上の細胞により明確な陽性
の結果が得られた。4℃または室温での3日間の貯蔵およ
びその後の上記のような処理の後、膀胱癌患者の尿サン
プルではテロメラーゼＲＮＡ成分が依然として明確に検
出できた。
【００６８】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Mannheim GmbH <120> Detection of urinary bladder carcinoma in a
urine sample <130> PA98-455 <160> 6 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 aactgagaag ggcgtaggcg ccgtgc 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 gtttgctcta gaatgaacgg tggaag 26 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 ttcaccccca ctgaaaaaga tga 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 ggcatcttca aacctccatg atg 23 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 aatccgtcga gcagagtt 18 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 cccttaccct tacccttacc ctta 24
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：オリゴヌクレオチド 配列番号２：オリゴヌクレオチド 配列番号３：オリゴヌクレオチド 配列番号４：オリゴヌクレオチド 配列番号５：オリゴヌクレオチド 配列番号６：オリゴヌクレオチド 配列番号７：オリゴヌクレオチド

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) 尿サンプルを調製し、(b) 該サンプ
    ル中のテロメラーゼＲＮＡを測定する、各工程を含んで
    なる、尿サンプル中の膀胱癌の検出方法。
  2. 【請求項２】 前記工程(a)が、尿サンプルから細胞を
    単離し、それらを溶解することを含むことを特徴とす
    る、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記テロメラーゼＲＮＡが非放射性マー
    カー基により測定されることを特徴とする、請求項１ま
    たは２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記テロメラーゼＲＮＡの測定が核酸増
    幅工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれ
    か１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記テロメラーゼＲＮＡの測定が逆転写
    工程を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか
    １項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 ヒト・テロメラーゼＲＮＡの測定におい
    て、(a) 配列番号1および配列番号2に示したヌクレオチ
    ド配列を有するヌクレオチド、および(b) 少なくとも5
    ヌクレオチドの長さを有する、配列番号1および配列番
    号2に示したヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレ
    オチド、から選択されるプライマー対を核酸増幅に使用
    することを特徴とする、請求項４または５に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 反応混合物を分離することなく増幅産物
    を分析することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか
    1項記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記増幅産物が固相に固定されることを
    特徴とする、請求項7に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記増幅産物が均一試験フォーマット
    （homogeneous test format）におけるオンライン検出
    により測定されることを特徴とする、請求項７に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】 サンプル中のテロメラーゼＲＮＡに加
    えて、それとは異なる標準核酸を測定することを特徴と
    する、請求項１〜９のいずれか1項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ヒト標準ＲＮＡとしてβ2-ミクログロ
    ブリンＲＮＡを測定するために、(a) 配列番号3および
    配列番号4に示したヌクレオチド配列を有するヌクレオ
    チド、および(b) 少なくとも5ヌクレオチドの長さを有
    する、配列番号3および配列番号4に示したヌクレオチド
    配列の部分配列を含むヌクレオチド、から選択されるプ
    ライマー対を使用することを特徴とする、請求項10に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 測定をワンポット反応として行うこと
    を特徴とする、請求項１〜11のいずれか1項記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】 増幅副産物を分離することなくテロメ
    ラーゼＲＮＡおよび（存在する場合には）標準核酸の特
    異的検出を可能とする条件下で、テロメラーゼＲＮＡお
    よび場合により標準核酸を検出することを特徴とする、
    請求項１〜12のいずれか1項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 (a) テロメラーゼＲＮＡを逆転写する
    ためのプライマー、(b) 逆転写のための試薬、(c) 逆転
    写によりテロメラーゼＲＮＡから得られたＤＮＡを増幅
    するためのプライマー対、(d) 核酸増幅のための試薬、
    および(e) マーカー基、を含む、テロメラーゼＲＮＡの
    検出のための試薬キット。
  15. 【請求項１５】 膀胱癌の非侵襲的な検出方法における
    請求項14に記載の試薬キットの使用。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜14のいずれか1項に記載の
    方法における、請求項15に記載の使用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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IT1318504B1 (it) * 2000-05-08 2003-08-27 Talent Srl Metodo e apparecchiatura per la diagnosi precoce di tumori vescicalisu campioni di urina.
EP1158055A1 (fr) * 2000-05-26 2001-11-28 Xu Qi University of Teaxs Laboratoire de Leucémie Chen Méthode pour le diagnostic de cancers
DE102022131984B4 (de) 2022-12-02 2024-08-22 Universitätsklinikum Jena, Körperschaft des öffentlichen Rechts Verfahren zum in vitro-Nachweis eines Harnblasenkarzinoms in einer Urinprobe

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972598A (en) * 1992-09-17 1999-10-26 Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods for preventing multidrug resistance in cancer cells
RO117328B1 (ro) * 1994-07-07 2002-01-30 Geron Corp Componenta rna a telomerazei de mamifere, plasmida recombinanta, de exprimare a acesteia, si metoda pentru detectarea prezentei unei stari neoplazice
DE19681033D2 (de) * 1995-11-16 1999-03-18 Michael W Dahm Verfahren zur Quantifizierung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
JPH09262100A (ja) * 1996-03-27 1997-10-07 Mount Sinai School Medicine City Univ New York テロメラーゼ活性の存在を測定することによる尿試料中のヒト膀胱癌細胞の検出方法

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