JP4315812B2

JP4315812B2 - 癌腫の分子診断および予後

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Publication number: JP4315812B2
Application number: JP2003571704A
Authority: JP
Inventors: タイッジ，ヘンリー
Original assignee: ザリサーチファンデーションオブステイトユニバーシティオブニューヨーク
Priority date: 2002-02-22
Filing date: 2003-02-21
Publication date: 2009-08-19
Anticipated expiration: 2023-02-21
Also published as: AU2003213247B2; EP1576349A2; WO2003073065A2; US7510832B2; JP2006510870A; CA2474700A1; DE60327468D1; ATE430210T1; AU2003213247A1; US20050164189A1; WO2003073065A3; EP1576349A4; EP1576349B1

Description

本発明は、腫瘍性疾患のスクリーニングにおける分子マーカー、ＢＣ２００ＲＮＡの使用に関する。ＢＣ２００ＲＮＡの発現をモニターし、癌腫の診断と予後の両方に利用する方法を使用することができる。

適切で、信頼でき、感受性の高い分子マーカーがないことが、がんの診断および予後に関する進歩を妨げてきた。病変を特定し、それらを特性付けするため、良性腫瘍と悪性腫瘍を区別するため、および所定の非侵襲性の癌腫が将来侵襲性になるかどうかの判定を可能にするためには、そうしたインジケータが必要である。

例えば、乳がんの検出において乳房撮影法を補足するために使用することができる、現在利用可能な信頼できる分子マーカーはない。これは、例えば、血液サンプルを簡単に分析することにより前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）状態を確定することができる前立腺がんとは対照的である。ＰＳＡは、前立腺がんのための分子マーカーであり（非特許文献１）、また、ＰＳＡ状態は、さほど信頼できる腫瘍のインジケータではない（比較的高い有病および無病誤診率を有する）が、前立腺の悪性度の臨床診断には日常的に使用されている。

Ｇａｒｎｉｃｋｅｔａｌ.,「前立腺がんとの戦い（ＣｏｍｂａｔｉｎｇＰｒｏｓｔａｔｅＣａｎｃｅｒ）」，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７９：７５−８３（１９９８）

腫瘍のためのマーカーは他にも知られている。例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）は、結腸直腸癌には予後的価値があり、乳癌では、ＣＥＡおよびＣＡ１５−３が、術前診断ではなく、術後マーカーとして使用されている（非特許文献２）。ＢRＣＡ１／２状態は、危険因子インジケータとして使用することができ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）状態は、再発および生残と相関しており（非特許文献３）、Ｋｉ−６７は、腫瘍の増殖分画の判定に有用な増殖マーカーである（非特許文献４）。

（Ｍｕｇｈａｌｅｔａｌ.,「転移性乳がんの治療中の癌胎児抗原連続プラズマ測定（ＳｅｒｉａｌＰｌａｓｍａＣａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓＤｕｒｉｎｇＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＭｅｔａｓｔａｔｉｃＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ）」，ＪＡＭＡ２４９：１８８１−１８８６（１９８３）Ｓｌａｍｏｎｅｔａｌ.,「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子の増幅と再発および生残との相関関係（ＨｕｍａｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ：ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆＲｅｌａｐｓｅａｎｄＳｕｒｖｉｖａｌＷｉｔｈＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨＥＲ−２／ｎｅｕＯｎｃｏｇｅｎｅ）」，Ｓｃｉｎｅｃｅ２３５：１７７−１８２（１９８７）Ｇｅｒｄｅｓ，「ヒト悪性疾患における免疫組織学的診断および予後評価に有用なＫｉ−６７および他の増殖マーカー（Ｋｉ−６７ａｎｄＯｔｈｅｒＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＭａｒｋｅｒｓＵｓｅｆｕｌｆｏｒＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａｎｄＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃＥｖａｌｕａｔｉｏｎs ｉｎＨｕｍａｎｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）」，Ｓｅｍｉｎ，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌ．１：１１９−２０６（１９９０）

しかし、これらのマーカーは、腫瘍の検出、診断および予後における有用性が限られているマーカーである。

ＢＣ２００ＲＮＡは、ヒトを含む霊長類の神経系において優勢に発現される２００ヌクレオチド長の翻訳不能ＲＮＡである。サルの脳からのＢＣ２００ＲＮＡの部分ヌクレオチド配列は、（非特許文献５）によって最初に報告された。この１３８ヌクレオチド配列は、Ａｌｕ左配列（ヒトおよび他の霊長類のゲノム全体にわたって何回も繰り返される配列）に実質的な相補性を示した。その後、完全長ＢＣ２００ＲＮＡの配列が、（非特許文献６）によって報告された。

ＷａｔｓｏｎａｎｄＳｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，７，３３２４−３３２７（１９７８）Ｔｉｅｄｇｅ１ｅｔａｌ.,「ヒトＢＣ２００ＲＮＡの一次構造、神経特異的発現および樹状定位（ＰｒｉｍａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎｅｕｒａｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄＤｅｎｄｒｉｔｉｃＬｏｃａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＢＣ２００ＲＮＡ）」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，２３８２−２３９０（１９９３）

ヒトＢＣ２００ＲＮＡの一次配列は、次のとおりである：

それ自体が転写のモジュレータである小さな神経非コーディング転写体ＢＣ２００ＲＮＡの発現(非特許文献７)は、厳しく調整される。そのＲＮＡは、神経以外の体細胞ではバックグラウンドレベルより高いレベルで通常検出されない（Ｔｉｅｄｇｅら、上記）。しかし、ＢＣ２００ＲＮＡ発現のこの厳しい神経特異的制御は、乳房の腫瘍を含む様々な腫瘍において解除される。ＢＣ２００ＲＮＡは、悪性疾患に随伴するものであり、神経以外の正常な体組織および良性腫瘍（乳房の線維腺腫など）では検出されない。（非特許文献８）

Ｗａｎｇｅｔａｌ.,「樹状ＢＣ１ＲＮＡ：転写開始の調整における機能的役割（ＤｅｎｄｒｉｔｉｃＢＣ１ＲＮＡ：ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＲｏｌｅｉｎＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ）」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，ｖｏｌ．２２，１０２３２−１０２４１頁（２００２）Ｌｉｎｅｔａｌ., 「乳がんにおける神経ＢＣ２００ＲＮＡの発現（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｅｕｒａｌＢＣ２００ＲＮＡｉｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ）」，ＥｒａｏｆＨｏｐｅＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｖｏｌ．１，ｐ．１２２（２０００年、国防総省（米）

（特許文献１）および（特許文献２）は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡの完全配列、および組織サンプルにおいてヒトＢＣ２００ＲＮＡの存在を特異的に検出するために使用することができるポリヌクレオチドプローブの使用を開示している。これらの各特許の内容は、本明細書に参照として取り入れられている。

米国特許第５，６７０，３１８号明細書米国特許第５，７３６，３２９号明細書

ＢＣ２００ＲＮＡの一次配列は、三つの構造ドメインに細分することができる。ドメインＩは、ヌクレオチド１〜１２２であり、また、霊長類のゲノムにおいて多数の複製が見出されるＡｌｕ反復要素に実質的に相同である。しかし、この領域には、ＡｌｕまたはＳＲＰ−ＲＮＡで見出すことができな二つの塩基、すなわち、４８および４９位のヌクレオチドを含み、これらを利用して、ＢＣ２００ＲＮＡ配列に対して特異的な増幅プライマーを開発することができる。ドメインＩＩは、ヌクレオチド１２３−１５８から成るＡ−リッチ領域である。ドメインＩＩＩは、組織中のＢＣ２００ＲＮＡを同定するために使用することができる、他の既知ヒト配列に相同でないユニーク配列を含む。

腫瘍病理学者は、腫瘍の悪性度の差はそれらの形態学的構造に反映されると、長い間考えてきた。腫瘍には三つの一般的な悪性度（低、中、高）があり、高悪性度は、最も進行性の腫瘍と関連する（非特許文献９）

Ｅｌｓｔｏｎｅｔａｌ., ＴｈｅＢｒｅａｓｔ，Ｃｈ．１７，３６５−３８３頁（１９９８）

腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）は、一般的であるが、腫瘍性疾患の異質なグループである。未治療のまま放置すると、約２５％のＤＣＩＳが、１５年以内に侵襲性の癌腫に発展する（非特許文献１０）。しかし、今までのところ、所定のＤＣＩＳが侵襲性である可能性を予測するための信頼できるインジケータ、分子などがない。従って、ほとんどの女性が、外科的にＤＣＩＳを除去してしまうことを選択すが、これは、多くの場合に不必要で、実質上、過剰治療に等しい（非特許文献１１）。

Ｅｌｓｔｏｎｅｔａｌ．，ＴｈｅＢｒｅａｓｔ，Ｃｈ．１４，２４９−２８１頁（１９９８）Ｅｒｎｓｔｅｒ，「乳房撮影法に関連した腺管上皮内癌の増加：ジレンマ（ＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＤｕｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａＩｎＳｉｔｕｉｎＲｅｌａｔｉｏｎｔｏＭａｍｍｏｇｒａｐｈｙ：ＡＤｉｌｅｍｍａ）」，ＮＩＨＣｏｎｓｅｎｓｕｓＤｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒＷｏｍｅｎＡｇｅｓ４０−４９，１４７−１５１頁（ＮＩＨ，１９９７）

明らかに、ＤＣＩＳを含むがんの信頼できる診断用インジケータは、治療決定を告知する際に医師および患者を助けになるという点で最も価値があるだろう。

本発明は、侵襲性の癌腫の診断するための方法および、まだ侵襲性でない癌腫が侵襲性の癌腫になる可能性が高い尤度を判定するための方法に関する。本発明は、サンプルの腫瘍悪性度を判定するための方法にも関する。

本方法は、ヒトから生理学的試験サンプルを入手すること；その試験サンプル中のＲＮＡが、標識シグナルを有する検出試薬と反応できるように、その試験サンプルを準備すること；ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する条件下で、その試験サンプルとその検出試薬を併せること；検出可能な反応生成物の量を、その標識シグナルにより測定すること；その標識シグナルレベルを、悪性度が高くない癌腫対照またはＢＣ２００ＲＮＡを発現しない正常な組織などの他のあらゆる適する対照からの標識シグナルと比較すること；および試験サンプルにおける高い標識シグナルを、その癌腫が侵襲性になる可能性が高いという判定と相関させることを含む。

本方法を侵襲性の癌腫の診断に利用する場合には、試験サンプルからの標識シグナルを非侵襲性の癌腫対照からの標識シグナルと比較する。非侵襲性の癌腫対照と比較して高い試験サンプルにおけるシグナルは、そのサンプルに侵襲性の癌腫が存在することを示している。

本方法を腫瘍悪性度の判定に向ける場合には、その試験サンプルにおける標識シグナルを、試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された悪性度が高くない癌腫対照および／または中等度の悪性度の癌腫対照における標識しシグナルと相関させて比較する。試験サンプルにおける標識シグナルと低悪性度の腫瘍対照における標識シグナルの相対的レベルが同じことは、その試験サンプルにおける低悪性度の癌腫を示す。低悪性度の癌腫からの標識シグナル量と比較して高い標識シグナル量がそのサンプルに存在するならば、その試験サンプルにおける少なくとも中等度の悪性度の癌腫を示す。こうした場合、その試験サンプルを、その試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された中等度の悪性度の癌腫対照と比較することができる。中等度の悪性度の癌腫と比較して高い標識シグナル量がそのサンプルに存在するならば、その試験サンプルにおける高悪性度の癌腫を示す。

一つの実施形態において、本発明の方法で利用される検出試薬は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブであり、ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する。

好ましくは、標識シグナルの量は、エマルジョン・オートラジオグラフィー、リン光イメージング、光学顕微鏡検査法、共焦点顕微鏡検査法、多陽子顕微鏡検査法および蛍光顕微鏡検査法から成る群より選択された技術によって測定する。定量分析を行って、標識シグナル強度を判定し、その後、それを癌腫の診断および予後に利用することができる。

好ましくは、本発明の方法に従って診断される癌腫および／または腫瘍は、腺管上皮内癌および上皮内小葉癌も含む上皮内癌；浸潤性腺管癌および浸潤性小葉癌（管状小葉癌など）も含む浸潤癌；粘液性癌腫；および髄様癌が挙げられるが、これらに限定されない乳癌でありうる。本発明の方法に従ってモニターされる他の癌腫には、皮膚癌、腎臓癌、耳下腺癌、肺癌、膀胱癌および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。

驚くべきことに、本発明に従って、ＢＣ２００ＲＮＡは、様々な癌腫を検出するために使用することができるばかりでなく、加えて、ＢＣ２００ＲＮＡのレベルをモニターすることにより、腫瘍悪性度、ならびに癌腫が侵襲性になる可能性が高い悪性度のものである尤度を判定することができるということが、判明した。

本発明に従ってモニターおよび診断することができる癌腫は、様々であり、それらには、浸潤性乳癌、例えば、浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）および浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）（管状小葉癌も含む）；上皮内癌、例えば、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）および上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）；粘液性癌腫；髄様癌；およびその他などの乳癌が挙げられるが、これらに限定されない。モニターおよび診断することができる他の癌腫には、皮膚癌、腎臓癌、耳下腺癌、肺癌、膀胱癌および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。

ＢＣ２００ＲＮＡは、二つの理由のため、増殖マーカーとして分類することができない。第一に、すべての正常な体細胞のうち、ニューロンだけが、ＢＣ２００ＲＮＡを発現する。大部分のニューロンは、分裂後であり、増殖しない。第二に、乳癌細胞などのがん細胞を除く増殖性体細胞は、ＢＣ２００ＲＮＡを発現しない。従って、ＢＣ２００の発現は、それ自体は増殖とは関係なく、むしろ特定の悪性疾患（特に、侵襲性の可能性を有するもの）に関係する。

一つの実施形態において、本発明は、癌腫が、侵襲性の癌腫になる可能性が高い悪性度のものである尤度を判定するための診断法を提供する。この方法は、侵襲性の腫瘍の診断にも使用することができる。この方法は、ヒトから生理学的試験サンプルを入手すること；その試験サンプル中のＲＮＡが、標識シグナルを有する検出試薬と反応できるように、その試験サンプルを準備すること；ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する条件下で、その試験サンプルとその検出試薬を併せる段階；検出可能な反応生成物の量を、その標識シグナルにより測定すること；その試験サンプルについての標識シグナル量を、その試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された悪性度が高くない癌腫対照からの標識シグナルと比較すること；および試験サンプルにおける高い標識シグナル量を、その癌腫が侵襲性になる可能性が高いという判定と相関させることを含む。

もう一つの実施形態において、本発明は、腫瘍悪性度を判定するための方法を提供する。この方法は、ヒトから生理学的試験サンプルを入手すること；その試験サンプル中のＲＮＡが、標識シグナルを有する検出試薬と反応できるように、その試験サンプルを準備すること；ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する条件下で、その試験サンプルとその検出試薬を併せる段階；検出可能な反応生成物の量を、その標識シグナルにより測定すること；およびその試験サンプルにおいて測定された標識シグナル量を、その試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された悪性度が高くない癌腫対照からの標識シグナルと比較することを含む。その試験サンプルにおける標識シグナルのレベルと、その試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された低悪性度の癌腫対照における標識シグナルのレベルが相対的に同じであることは、その試験サンプルにおける低悪性度の癌腫を示し；その試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された低悪性度の癌腫対照からの標識シグナルの量と比較して高いその試験サンプルにおける標識シグナルの量は、その試験サンプルにおける少なくとも中等度の悪性度の癌腫を示し；およびその試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された中等度の悪性度の癌腫対照と比較して高いその試験サンプルにおける標識シグナルの量は、その試験サンプルにおける高悪性度の癌腫を示す。

好ましくは、本発明の方法において利用される検出試薬は、ヒトＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブであり、ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する。最も好ましくは、その検出可能な反応生成物は、蛍光シグナルなどの標識シグナルを有する。

サンプル中のＢＣ２００ＲＮＡのレベルをモニターするために使用することができるオリゴヌクレオチドプローブの例は、（特許文献３）および（特許文献４）に記載されている。こうしたプローブは、ヒトＢＣ２００ＲＮＡのドメインＩＩＩのユニーク配列に相補的であるか、その対応する染色体ＤＮＡに相補的、すわち、その配列の少なくとも一部：

に相補的である。

それらのプローブは、塩基を約１０から６０含有する直鎖オリゴヌクレオチドでありうる。長さは、ＢＣ２００ＲＮＡとの結合が、他のポリヌクレオチドへの結合より好ましくなるような、妥当な特異性度をもたらすために充分でなければならない。

本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを指す。

本発明の範囲内の一つのプローブは、ＢＣ２００ＲＮＡのヌクレオチド１５６〜１８５に相補的である。この３０ヌクレオチドのプローブは、下記配列を有する：

もう一つの有用なプローブは、ヌクレオチド１５８〜１７８に相補的な２１ヌクレオチドのプローブ、すなわち、

である。目にも明らかなように、適するプローブは、それらが、特異性をもたらすために十分なユニークドメインＩＩＩの部分（すなわち、塩基少なくとも約１０）にも相補的であることを条件として、ドメインＩＩＩ以外のＢＣ２００ＲＮＡの部分と相補的であってもよい。プローブは、ドメインＩＩＩの部分のみに相補的であってもよい。ヌクレオチド１４６〜１４８にわたる部分のドメインＩＩに相補的である第二の種類のプローブを使用してもよい。上記プローブは、ＢＣ２００ＲＮＡの検出に、または増幅プライマーとして使用することができる。

本発明のもう一つの側面では、ＢＣ２００ＲＮＡまたはその対応するＤＮＡの４８位と４９位の二つのユニークヌクレオチドにわたるＡｌｕ繰り返し配列の部分に相補的であり、それと特異的にハイブリダイズするプローブを利用することができる。そうしたプローブの例は、ＢＣ２００ＲＮＡと結合することとなるアンチセンスプローブ：

および対応するＤＮＡ配列と結合することとなるセンスプローブ：

である。これらのプローブは、検出に、または増幅プライマーとして使用することができる。

本発明に従って利用されるプローブは、当該技術分野において公知の様々な技術のいずれかによって製造することができる。例えば、ＲＮＡプローブは、生体外転写により生成することができる。このアプローチでは、所望の配列を、先ず、適する転写ベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にクローニングする。このベクターは、転写が特定の位置で停止するように線形化されており、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡをそうした線形化テンプレートから転写する。プローブは、適切な放射性標識前駆体を反応混合物に添加することにより、^３５Ｓ標識または^３Ｈ標識することができる。その後、テンプレートＤＮＡをＤＮアーゼＩで消化する。ＲＮＡプローブは、ゲル濾過またはゲル電気泳動により、さらに精製することができる。

プローブをオリゴ標識によって製造することもできるが、この技術は、もっと長い核酸ポリマーのほうが適する。この方法では、二本鎖ＤＮＡを、先ず、変性する。その後、ランダム配列オリゴヌクレオチドを、テンプレートによるＤＮＡ合成のためのプライマーとして使用する。Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が、多くの場合、この用途に使用される。テンプレートがＲＮＡの場合には、逆転写酵素を使用することができる。プローブの標識は、放射性標識ヌクレオチド、例えば、［α−^３２Ｐ］ｄＮＴｐｓの導入によって達成される。

プローブを生成するためのもう一つのアプローチは、ニックトランスレーションである。この方法では、二本鎖ＤＮＡを使用する。ニック（一本の鎖の中の切れ目）は、ＤＮアーゼＩによって導入する。そのニック点におけるＤＮＡの３’末端にヌクレオチド残基を追加するために、同時にＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩを使用する。放射性標識前駆体ヌクレオチドを導入すると、プローブが均一に標識される。プローブは、両方の鎖を含有する。

一本鎖ＤＮＡプローブは、バクテリオファージＭ１３または類似のベクターから誘導されるテンプレートから作ることができる。その後、そのテンプレートの特定のセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩとともに使用して、そのテンプレートに相補的な放射標識鎖を生じる。そのプローブは、例えば、変性条件下でのゲル電気泳動により、精製する。

あらゆる所望の配列のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することもできる。オリゴヌクレオチドの自動合成には、固相法が日常的に使用されている。

本開示に従って有用なプローブは、標識することができる。様々な酵素を使用して、ＤＮＡ末端に放射性標識を取り付けることができる（ｄＮＴＰ前駆体を使用する）。二本鎖ＤＮＡの３’末端は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用することにより、標識することができる。平滑末端ＤＮＡまたはへこんだ３’末端が、適する基質である。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して、突出３’末端を標識することもできる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、^３２Ｐ−ホスフェート基をＤＮＡの５’末端に転移させることができる。この反応は、１本鎖オリゴヌクレオチドの標識に特に有用である。プローブは、標識された核酸および／または標識されたプライマーを適切なクローンからのプローブのＰＣＲ生成に使用するＰＣＲ標識法により、標識することもできる。（非特許文献１２）Ｋｅｌｌｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３：３８１−３８８（１９９２）参照。

Ｋｅｌｌｙｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３：３８１−３８８（１９９２）

本発明の方法は、上記のもののようなオリゴヌクレオチドプローブを利用して、ＢＣ２００ＲＮＡ（それ自体、癌腫を診断するために、および所定の癌腫が侵襲性の癌腫に進行する可能性が高いか否かを判定するために利用される）の存在について、組織をスクリーニングする。

このスクリーニング手順の基本的な方法論は、次の段階を含む：
（１）生理学的サンプルを入手する段階；
（２）そのサンプルを処理して、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡをハイブリダイザーションに利用できるようにする段階；
（３）その試験サンプルを、ヒトＢＣ２００ＲＮＡのドメインＩＩＩに特異的なプローブとハイブリダイズさせる段階；および
（４）ハイブリダイザーションの発生を分析する段階。

適する生理学的サンプルには、手術検体、血液および他の体液（乳頭分泌物、痰、性液および擦過標本を含むが、これらに限定されない）などの生検材料が挙げられる。

サンプル中の核酸がハイブリダイゼーションに利用できるようにしてあるならば、組織サンプルの処理に利用する方法は重要ではないが、幾つかの特定の選択肢には、価値がない。チオシアン酸グアニジン法、その後のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法によるＲＮＡの直接単離は、多くの場合、特に、生検材料からのＲＮＡの単離に、有効である。しかし、サンプルのサイズが小さい場合、ＲＮＡの増幅が望ましいこともある。

ＲＮＡの増幅は、先ず、サンプル中の細胞を溶解して、ＲＮＡをハイブリダイゼーションに利用できるようにすることにより、達成することができる。これは、（１）チオシアン酸グアニジニウムでのＲＮＡの抽出、その後の塩化セシウム中での遠心分離；（２）グアニジンＨＣｌおよび有機溶媒でのＲＮＡの抽出；または（３）弱洗浄剤（ＮＰ−４０）でのＲＮＡの抽出とプロテイナーゼ消化の併用により、達成される。これらおよび他のＲＮＡ抽出法は、（非特許文献１３）に記載されている。単離したＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換し、これを、その後、ＢＣ２００ＲＮＡ配列の３’末端に対して選択的なプローブを使用して増幅する。（特許文献５）参照。この特許の内容は、本明細書に参照として取り入れられている。ｃＤＮＡは、リガーゼに基づく方法（非特許文献１４）、または等温転写に基づく方法（非特許文献１５）を使用して増幅することもできる。増幅されたＤＮＡは、その後、適切なプローブによって直接検出することができる。

Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）Ｂａｒａｎｙｅｔａｌ．，「クローン化熱安定性リガーゼを使用する遺伝子病検出およびＤＮＡ増幅（ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｅａｓｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＤＮＡＡｍｐｌｉｃａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＣｌｏｎｅｄＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＬｉｇａｓｅ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，１８９−１９３（１９９１）Ｋｗｏｈｅｔａｌ．，「転写に基づく増幅システムおよびビードに基づくサンドイッチハイブリダイゼーション形式での増幅ヒト免疫不全ウイルス１型の検出（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｍｐｌｉｆｉｅｄＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓＴｙｐｅ１ＷｉｔｈａＢｅａｄ−ｂａｓｅｄＳａｎｄｗｉｃｈＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＦｏｒｍａｔ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，１１７３−１１７７（１９８９）（米国特許第４，６８３，２０２号明細書

このハイブリダイゼーションは、核酸をアッセイするために知られている非常に多数の手順のうちのいずれかを使用して行うことができる。これらには、様々なブロット法（すなわち、ドット、ノーザン、サザンなど）、ならびに（特許文献６）、（特許文献７）、（特許文献８）、（特許文献９）および（特許文献１０）に記載されているものなどのサンドイッチ系の技法が挙げられる（これらの特許各々の内容は、本明細書に参照として取り入れられている）。検出を助長するために、プローブは、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識もしくは発色標識などの標識、または固定化部分を有することができる。検出可能な標識または固定化部分のいずれかとして役立つ、ビオチンまたはジゴキシゲニンで変性したプローブは、特に有用である。

米国特許第４，４８６，５３９号明細書米国特許第４，７５１，１７７号明細書米国特許同第４，８６８，１０５号明細書米国特許同第４，８９４，３２５号明細書欧州特許公開第０２３８３３２号明細書

加えて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの他の技法を利用して、細針生検（ｆｉｎｅｎｅｅｄｌｅｂｉｏｐｓｙ：針をさして組織を取る検査）もしくは針生検（ｃｏｒｅｎｅｅｄｌｅｂｉｏｐｓｙ：腫瘍の中心の組織を少しくり貫いて行う組織検査）によって得られたもの、または血液もしくは乳頭分泌物などの体液から得られたものなどの少量サンプルにおいてＢＣ２００ＲＮＡを検出することができる。

通常のＰＣＲアッセイでは、対象となるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の５’および３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが設計される。熱サイクルの間に、ＤＮＡまたはＲＮＡは、熱変性される。その後、サンプルを、プライマーが、それらの特異的補体に結合し、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼによるヌクレオチド三リン酸の付加により伸張するアニールおよび伸張温度に持っていく。熱サイクルが繰り返されるにつれて、テンプレートＤＮＡまたはＲＮＡの量が増幅される。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用するものなどのＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲアンプリコン内のプライマー間の配列領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブが設計される。そのプローブは、その５’末端に蛍光レポーター色素を、およびその３’末端にクエンチャー色素を有する。そのプローブが無傷である時には、その蛍光放射は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）現象によりクエンチングされる。熱サイクリングの間に、そのプローブは、それらのプライマーのうちの一つの下流のターゲットＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする。ＴａｑＭａｎ（登録商標）の化学作用は、そのプローブからの蛍光色素を切断するＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。ＰＣＲ産物が蓄積するにつれて、蛍光シグナルが増加する。従って、このシグナルを測定することにより、増幅産物を定量することができ、それによって、サンプル中に存在するＲＮＡの定量が可能となる。ＰＣＲプライマーとの併用で、そのプローブは、ＢＣ２００ＲＮＡを分化させ、定量するアッセイにおいて、別の特異性レベルを生じる。

異なるプライマー対を利用して、ＲＴ−ＰＣＲによりＢＣ２００ＲＮＡを増幅することができる。ＢＣ２００ＲＮＡの５’位は、ヒトＡｌｕ−Ｊ反復要素に配列が似ている。しかし、ＢＣ２００ＲＮＡは、３５〜５０位の間の４つのヌクレオチドの違いおよび２つのタンデム塩基挿入により、これらの要素とは異なる。従って、一つの実施形態において、５’プライマーは、この領域をターゲットにするように設計される。ＢＣ２００ＲＮＡの６０個の３’の大部分のヌクレオチド（ヌクレオチド１４１〜２００）は、ユニークであり、ノーザンおよびサザン分析における特異的プローブとして首尾よく使用されている（非特許文献１６）。

Ｔｉｅｄｇｅｅｔａｌ．，「ヒトＢＣ２００ＲＮＡの一次構造、神経特異的発現および樹状定位（ＰｒｉｍａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎｅｕｒａｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄＤｅｎｄｒｉｔｉｃＬｏｃａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＢＣ２００ＲＮＡ）」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，２３８２−２３９０（１９９３）

好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲは、ＢＣ２００ＲＮＡが検出されるように行い、その蛍光シグナルを利用して、癌腫の侵襲性の可能性を判定する。

シグナル強度は、エマルジョン・オートラジオグラフィー、リン光イメージング、光学顕微鏡検査法、共焦点顕微鏡検査法（例えば、共焦点レーザー走査顕微鏡法）および多陽子顕微鏡検査法を含む（しかし、これらに限定されない）、当業者には公知の方法により判定される。非放射性標識法（例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニンを使用するもの）の場合、光学顕微鏡法または蛍光顕微鏡法を使用することができる。

その後、所定のサンプルについての標識強度を、悪性度が高くない癌腫対照からの標識シグナルと比較することができる。悪性度が高くない癌腫対照からのシグナルと比較して高い試験化合物についての標識シグナルは、所定のサンプルが、侵襲性になる可能性が高い癌腫を含有すると判定されることとなる。逆に言えば、悪性度が高くない癌腫対照からのシグナルと比較して低いまたは同等の標識シグナルは、所定のサンプルが、癌腫を有さないと、またはそのサンプルの供給源が腫瘍である場合には侵襲性になる可能性が低い癌腫を有すると、判定されることとなる。

同様に、試験サンプルの標識シグナルを、その試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された非侵襲性癌腫対照からの標識シグナルと比較することができる。非侵襲性癌腫対照からの標識シグナルと比較して高い試験サンプルのシグナルを利用して、侵襲性癌腫を診断することができる。逆に言えば、非侵襲性癌腫対照と比較して低いまたは同等のシグナルは、そのサンプルが、侵襲性癌腫を含有しないと判定されることになろう。

オートラジオグラフィーを使用して、試験サンプルにおけるシグナル強度を判定する一つの実施形態では、それらのオートラジオグラフは、好ましくは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈＳｏｆｔｗａｒｅ（ＵｎｉｖｅｒｓａｌＩｍａｇｉｎｇＣｏｒｐ．，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）またはＮＩＨＩｍａｇｅＳｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ)などの市販のまたは公的に利用可能な画像解析ソフトウエアを使用して、定量分析に付すことができる。共焦点および多プロトン顕微鏡検査法も定量分析のために使用することができる。手作業で数える方法も定量分析に使用することができ、これは、画像解析ソフトウエアの導入前の伝統的な方法である。

サンプルの得られた標識シグナルまたはシグナル強度は、オートラジオグラフにおける単位面積あたりの銀粒子の数と等価であり、標識シグナルの量と等価でもある相対単位である「オートラジオグラフの標識単位」または「ＡＬＵ」として表現することができる。サンプルのシグナル強度の定量分析においてオートラジオグラフィーと画像解析ソフトウエア（好ましくは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈＳｏｆｔｗａｒｅ）を併用する一つの実施形態では、約１０００ＡＬＵより大きい標識シグナルを有する試験サンプルを使用して、高悪性度のまたは侵襲性の癌腫を診断することができる。癌腫がまだ侵襲性でない場合、約１０００ＡＬＵより大きい標識シグナルを有する試験サンプルは、侵襲性の癌腫に進行するだろう癌腫を含有する確立が高い。逆に言えば、約１０００ＡＬＵ未満の標識シグナルを利用して、非侵襲性の癌腫、または癌腫が侵襲性の癌腫に進行する確立が低い悪性度が高くない癌腫を診断することができる。ＡＬＵは、相対単位であるので、サンプリング面積の違い、または使用する画像解析ソフトウエアの違いにより、数に違いが生じうる。しかし、当業者には容易にわかるように、相対単位を利用して、試験サンプルと対照を比較し、サンプルが、実際、侵襲性の癌腫もしくは侵襲性の癌腫に進行する可能性が高い癌腫を有するか否かを判定できる。

同様に、もう一つの実施形態において、本発明は、腫瘍を悪性度格付するための方法に関する。所定の腫瘍サンプルについての標識強度は、低悪性度の癌腫対照における標識シグナルと比較することができる。試験サンプルにおける標識シグナルレベルが、低悪性度の腫瘍対照の標識シグナルと相対的に同じであるならば、低悪性度の腫瘍を示す。しかし、低悪性度の腫瘍対照からの標識シグナル量と比較して高い標識シグナル量が試験サンプルに存在するならば、試験サンプルにおける少なくとも中等度の悪性度の腫瘍を示す。こうした場合、その後、試験サンプルを、試験サンプルと同じ段階で使用するように準備された中等度の悪性度の腫瘍対照と比較することができる。中等度の悪性度の腫瘍対照と比較して高い標識シグナル量がその試験サンプルに存在するならば、試験サンプルにおける高悪性度の腫瘍を示す。腫瘍中に存在するＢＣ２００ＲＮＡ量を判定することにより、腫瘍を悪性度格付することができ、その腫瘍が侵襲性になる可能性が高いか否かについて判定することができる。

一つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＤＣＩＳの診断および予後に使用される。ＤＣＩＳにおいて、ＢＣ２００ＲＮＡの発現は、腫瘍悪性度に依存する。比較ゲノムハイブリダイゼーションによって、ＤＣＩＳから侵襲性の癌腫への移行が、分化状態および悪性度に関係があるように見える特定の遺伝経路に従うことが証明された。（非特許文献１７）（非特許文献１８）

Ｂｕｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，「乳腺管上皮内癌の比較ゲノムハイブリダイゼーション − 多数の遺伝経路の証拠（ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃＨｙｇｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＤｕｃｔａｌＣａｒｃｉｎｏｍａＩｎＳｉｔｕｏｆｔｈｅＢｒｅａｓｔ − ＥｖｉｄｅｎｃｅｏｆＭｕｌｔｉｐｌｅＧｅｎｅｔｉｃＰａｔｈｗａｙｓ），１８７，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．３９６−４０２（１９９９）

」
Ｂｕｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，「侵襲性の乳がんの進化における遺伝経路の違いは、形態学的サブタイプの相違に関係する（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃＰａｔｈｗａｙｉｎｔｈｅＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＩｎｖａｓｉｖｅＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒａｒｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＷｉｔｈＤｉｓｔｉｎｃｔＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌＳｕｂｔｙｐｅｓ）」，１８９Ｊ．Ｐｔｈｏｌ．５２１−５２６（１９９９）

本発明のプローブは、ＢＣ２００ＲＮＡについて組織（乳房組織など）をスクリーニングするためのキットのパーツとして供給することができる。ＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうかの診断用反応生成物を生成するプローブまたは他の検出試薬に加えて、そうしたキットは、次のもののうちの一つ以上を含むことができる：
（１）スクリーニング手順の間に診断用反応生成物の核酸を付着させる固体支持体；
（２）サンプル中の核酸を増幅させるための増幅プライマーおよび酵素；
（３）その診断用反応生成物と反応させて、それを検出可能にする標識試薬；ならびに
（４）その生理学的サンプルを溶解して、ＲＮＡをハイブリダイゼーションに利用できるようにするために有効な溶液。

適する増幅プライマーには、実施例で特定されているもの、ならびに存在する場合にはＢＣ２００ＲＮＡのドメインＩＩＩとともに、ことによるとドメインＩＩおよびＩの一部を結果的に増幅することとなる他のものが挙げられる。特に好ましい５’増幅プライマーは、４８位および４９位でのユニークヌクレオチドを含むＢＣ２００ＲＮＡのドメインＩの一部または対応するｃＤＮＡに相補的であるものである。適する酵素には、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。

驚くべきこと、本発明に従って、乳癌腫瘍細胞によって発現されるＢＣ２００ＲＮＡの量が、腫瘍のタイプ、悪性度および段階と相関することを発見した。例えば、ＢＣ２００ＲＮＡは、侵襲性の腫瘍において高レベルで発現される。従って、ＢＣ２００ＲＮＡは、本発明に従って、乳癌を含む侵襲性の癌腫の診断および予後の分子インジケータとして使用することができる。ＢＣ２００ＲＮＡの発現レベルと腫瘍悪性度との相関関係は、侵襲性の可能性についての分子インジケータとして使用することができる。癌腫におけるＢＣ２００ＲＮＡレベルが高いことは、その患者が、将来、侵襲性の癌腫に罹患する尤度が高いことを示す。従って、ＢＣ２００ＲＮＡの発現は、腫瘍の進行の予測に価値のある手段（ツール）である。

本明細書に記載されている実施形態に様々な変更を施すことができることは理解されよう。従って、上の記載は、限定と解釈するのではなく、単に、好ましい実施形態の例示として解釈されうる。例えば、本発明は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブまたはＲＴ−ＰＣＲを使用して、乳癌などの癌腫に罹患しているもののＢＣ２００ＲＮＡレベルを検出するという観点で主として記載しているが、いずれの検出技術を使用しても、腫瘍性疾患についての有益なスクリーニング結果を獲得することができることは、ご理解いただけよう。例えば、ＢＣ２００ＲＮＡに対するＲＮＡ特異的抗体を、例えばＥＬＩＳＡアッセイに使用して、組織サンプルにおけるＢＣＲＮＡを検出することができる。（非特許文献１９）参照。ＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズするペプチド核酸は、診断試薬としても使用することができる。（非特許文献２０）参照。同様に、ＢＣ２００ＲＮＡを生体内で蛋白と複合させて、リボ核蛋白（「ＲＮＰ」）を形成することができる。その後、ＢＣ２００ＲＮＡに特異的な抗体を、イムノアッセイ検出計画の中で使用することができる。当業者は、本明細書に記載されている特徴の範囲および精神の中で、他の変形を思い描くことができよう。

Ｕｃｈｉｕｍｉｅｔａｌ．，「２８ＳリボソームＲＮＡのユニーク保存領域に特異的なヒト自己抗体は、延長因子１αおよび２とリボソームとの相互作用を阻害する（ＡＨｕｍａｎＡｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙＳｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒａＵｎｉｑｕｅＣｏｎｓｅｒｖｅｄＲｅｇｉｏｎｏｆ２８ＳＲｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡＩｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＥｌｏｎｇａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒｓ１ａｌｐｈａａｎｄ２ＷｉｔｈＲｉｂｏｓｏｍｅｓ）」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０５４−６２（１９９１）Ｈａｎｖｅｙｅｔａｌ．，「ペプチド核酸のアンチセンスおよびアンチジーン特性（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅａｎｄＡｎｔｉｇｅｎｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１４８１−１４８５（１９９２）

ＢＣ２００ＲＮＡの増幅
ＢＣ２００ＲＮＡの５’および３’領域を別々に増幅した。５’ＢＣ２００ＲＮＡ配列の増幅のために、チオシアン酸グアニジニウム法、続いてフェノール抽出およびＣｓＣｌ遠心分離を使用して１μｇの全ＲＮＡを単離し、熱安定性ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を製造業者のインストラクションに従って使用してｃＤＮＡの第一鎖に変換させた。この段階で使用したプライマーは、

であった。

次に、ｄＴＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を使用して生成物の３’末端をＴ末端にした。その末端処理したｃＤＮＡを、下記プライマー：

を使用し、３０サイクル（３０秒間９４℃で変性、１分間５５℃でアニーリング、２分間７２℃で伸張；最初の変性は、４分間９４℃でであり、最後の伸張は、１０分間７２℃でであった）でＰＣＲ増幅した（非特許文献２１）。その生成物を、下記アダプタープライマー：

を使用し、第二の３０サイクルセット（条件は、上記参照）でさらに増幅した。ＥｃｏＲＩで消化後、そのＰＣＲ生成物を、製造業者のマニュアルに従ってλ ＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。最初のオリゴヌクレオチドプローブ：

で１０^３個のプラークをスクリーニングし、６個の陽性クローンを配列した。

Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８−９００２（１９８８）

３’ＢＣ２００ＲＮＡ配列を増幅するために、ヒト新皮質からの１０μｇの全ＲＮＡを、ポリＡポリメラーゼを使用して、Ａ末端にした（非特許文献２２）。その後、末端処理したＲＮＡを、下記プライマー：

を使用して、ＭｅＨｇＯＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、逆転写酵素でｃＤＮＡの第一鎖に変換させた。ＰＣＲ増幅（上記参照）のために、このプライマーと下記プライマー：

を併用する。生成物をλ ＺＡＰＩＩにクローニングし（上記）、配列番号１３で同定された１４個のクローンを、酵素的連鎖停止反応を用いて配列した。

ＤｅＣｈｉａｒａｅｔａｌ．，「神経ＢＣ１ＲＮＡ：ｃＤＮＡクローンは、非反復配列内容を示す（ＮｅｕｒａｌＢＣ１ＲＮＡ：ｃＤＮＡＣｌｏｎｅｓＲｅｖａｌＮｏｎｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔｅｎｔ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，２６２４−２６２８（１９８７）

ＢＣ２００ＲＮＡ特異的プローブの生成
二つのタイプのプローブを通常どおり使用した。所望の配列のオリゴデオキシヌクレオチドを化学合成し、クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により精製した。その後、ヌクレオチドを５’末端のリン酸化により放射標識した。これは、γ^３２Ｐで標識されたＡＴＰを有する酵素ポリヌクレオチドキナーゼを使用することによって達成した。この放射性標識されたプローブ（比活性：＞１０^８ｃｐｍ／μｇ）と組み込まれていない標識とをゲル濾過によって分離し、そのプローブを１０^６ｃｐｍ／ｍＬの濃度で使用した。

加えて、ＲＮＡプローブを生体外転写により生成した。このアプローチでは、所望の配位列を、先ず、適する転写ベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にクローニングした。その後、このベクターを（転写が、所望の位置で終わるように）線形化し、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡをそうした線形化テンプレートから転写した。^３５Ｓ−または^３Ｈ−ＵＴＰが転写反応中に存在し、それ故、生じたプローブは、^３５Ｓ−または^３Ｈで標識されていた。その後、テンプレートＤＮＡをＤＮアーゼＩで消化して、蛋白質をフェノールで抽出し、それらのプローブをエタノールで沈殿させた。ＲＮＡプローブは、原位置ハイブリダイゼーションに使用した。

血液からＢＣ２００ＲＮＡを捕捉する（非特許文献２３）ために、ＢＣ１ＲＮＡおよびＢＣ２００ＲＮＡの濃縮および精製に以前使用されたビオチニル化２’Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（非特許文献２４）（非特許文献２５）を使用する。乳がん患者からの血液中のＢＣ２００ＲＮＡを分析するために、ＲＮＡを、ビオチン−ストレプタビジン結合によってマトリックスにカップリングしているアンチセンスオリゴリボヌクレオチドに捕捉させる。繰り返し洗浄した後、捕捉されたＢＣ２００ＲＮＡを溶離し、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅させる。

ＤｅＣｈｉａｒａｅｔａｌ．，「神経ＢＣ１ＲＮＡ：ｃＤＮＡクローンは、非反復配列内容を示す（ＮｅｕｒａｌＢＣ１ＲＮＡ：ｃＤＮＡＣｌｏｎｅｓＲｅｖａｌＮｏｎｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｎｔｅｎｔ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，２６２４−２６２８（１９８７）Ｉｒｉｂａｒｒｅｎｅｔａｌ．，「アンチセンスプローブとしての２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−ＡｌｋｙｌＯｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｓＡｎｔｉｓｅｎｓｅＰｒｏｂｅｓ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，７７４７−７７５１（１９９０）Ｌａｍｏｎｄｅｔａｌ．，「２’−Ｏ−アルキルＲＮＡから作ったアンチセンスオリゴヌクレオチド：それらの特性およびＲＮＡ生化学における応用（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＯｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＭａｄｅｏｆ２’−Ｏ−ＡｌｋｙｌＲＮＡ：ＴｈｅｉｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＲＮＡＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３２５，１２３−１２７（１９９３）

アニーリング温度の範囲およびサイクル数などのＰＣＲサイクリングパラメータを決定する（１２〜４０サイクル、対数期および静止期）。これに、ＰＣＲサンプルの電気泳動、フィルター移送、およびＢＣ２００ＲＮＡおよびシクロフィリンｍＲＮＡのためのプローブとのハイブリダイゼーションが続く。

最も有効なＰＣＲプライマーを選択し、最適なＰＣＲ条件を確立して、細針吸引生検および針生検（ｃｏｒｅｂｉｏｐｓｙ）から得られるＲＮＡを処理するために理想的な条件を決定する。ゲノムＤＮＡのサンプルを最も有効に取り出せる、日常的な短いまたは一段階のプロトコルを使用する。最適化したＲＴ−ＰＣＲ手順の価値を確かめるために、ヒト針生検材料のサンプルを試験する（直径１〜１．５ｍｍ、長さ１．７〜１．９ｃｍ）。通常の病理組織学的方法と並行して、ＰＣＲと原位置ハイブリダイゼーションの両方により、ＲＮＡ含量を分析するには、この組織量で充分である。

ＢＣ２００ＲＮＡは、短く、イントロンがないので、逆転写酵素（ＲＴ）を含有しない陰性対照をすべての実験サンプルに加える。分解したＲＮＡの場合または最適以下のＲＴ反応の場合には、偽陰性を検出するために、第二の陽性対照が必要である。第一鎖合成効率のための内部ゲージとして使用されるレポーターＲＮＡとなるシクロフィリンｍＲＮＡを選択する。以前の結果は、シクロフィリンｍＲＮＡが、正常組織および腫瘍組織で一様に同じ不変レベルで発現されることを示している（非特許文献２６）。この対照実験の目的は、個々のサンプルに対して行うがごとく全手順の総合的な効率をモニターすることである。

Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，「ヒト腫瘍における神経ＢＣ２００ＲＮＡの発現（ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｅｕｒａｌＢＣ２００ＲＮＡｉｎＨｕｍａｎＴｕｍｏｒｓ）」，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８３，３４５−３５１（１９９７）

シクロフィリンｍＲＮＡプライマーは、増幅効率についてのみならず、進行中のＢＣ２００ＲＮＡ増幅を干渉しないことについても試験する。ＢＣ２００ＲＮＡとシクロフィリンｍＲＮＡのプライマー対を選択して、同じまたは別の試験管で同様の効率で増幅する。プライマー対の効率を試験するために、Ｃｈｅｎらの上記論文が提案しているように、ノーザンまたは原位置ハイブリダイゼーションによって以前に試験されおり、且つ、サンプルごとのＢＣ２００ＲＮＡの相対シグナル（またはシクロフィリンｍＲＮＡ）が判っている正常組織および腫瘍組織からのＲＮＡサンプルを使用する。

ヒト乳房組織を評価のために準備した。組織を入手し、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを液体窒素中で凍結させることによりハイブリダイゼーションに利用できるようにした。サンプルを、Ｔｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＯＣＴ包埋剤（Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）に低温包埋して、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保管し、その後、（非特許文献２７）に記載されている手順に従って、ＢｒｉｇｈｔＭｉｃｒｏｔｏｍｅＣｒｙｏｓｔａｔ内で、１０μｍ厚で、切断する。切片を、ゼラチン／ポリ−Ｌ−リシン被覆スライドガラス上にて解凍−固定し、さらに加工するまで−８０℃で保管した。その後、サンプルを、上記実施例２に従って生成したヒトＢＣ２００ＲＮＡヒトＲＮＡのドメインＩＩＩに特異的な^３５Ｓ標識ＲＮＡプローブとの原位置ハイブリダイゼーションに付した。原位置ハイブリダイゼーションは、（非特許文献２８）に記載されているとおり行った。（非特許文献２９）に記載されているとおり、３７℃、０．１ｘＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール中で、最終的な非常に厳重な洗浄を行った。

Ｔｉｅｄｇｅ，Ｈ．，「原位置ハイブリダイゼーションにおける細胞および組織切断のための架橋剤としてのＵＶ線の使用（ＴｈｅＵｓｅｏｆＵＶＬｉｇｈｔａｓａＣｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇＡｇｅｎｔｆｏｒＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＳｅｃｔｉｏｎｓＩｎｉｎｓｉｔｕＨｙｇｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０，１４３−１４７（１９９１）Ｔｉｅｄｇｅｅｔａｌ．，「ヒトＢＣ２００ＲＮＡの一時構造、神経特異的発現および樹状定位（ＰｒｉｍａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎｅｕｒａｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄＤｅｎｄｒｉｃＬｏｃａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＢＣ２００ＲＮＡ）」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，２３８２−２３９０（１９９３）Ｔｉｅｄｇｅ，Ｈ．，「原位置ハイブリダイゼーションにおける細胞および組織切断のための架橋剤としてのＵＶ線の使用（ＴｈｅＵｓｅｏｆＵＶＬｉｇｈｔａｓａＣｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇＡｇｅｎｔｆｏｒＣｅｌｌｓａｎｄＴｉｓｓｕｅＳｅｃｔｉｏｎｓＩｎｉｎｓｉｔｕＨｙｇｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０，１４３−１４７（１９９１）

下の表１および２は、これらの乳房組織サンプルから得られたＢＣ２００ＲＮＡシグナルの半定量的評価を提供するものである。記号＋／−、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋は、検出されたＲＮＡのレベル増加を反映している。組織の診断、悪性度格付および分類は、がん病理学者によって独自に確認されたものである。

ＴＮＭ分類は、がんの広がりの程度を分類するために最も広く使用されている。ＴＮＭ分類は、腫瘍の大きさ、関係するリンパ節の数および遠隔転移の数に基づくものであり、腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）システムとしても知られている。（Ｘは、樹立していないことを意味する）。このシステムは、（非特許文献３０）に当初発表されたとおり、国際対癌連合（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎａｇａｉｎｓｔＣａｎｃｅｒ）および対癌米国合同委員会（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｉｎｔＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＣａｎｃｅｒ）により採用されている。

ｔｈｅ１９９２ＭａｎｕａｌｆｏｒＳｔａｇｉｎｇｏｆＣａｎｃｅｒ、第４版（Ｂｅａｈｒｓ，Ｏ．Ｈ．ら）、１４９〜１５４頁（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ１９９２）

上記サンプルについてのシグナル強度は、エマルジョン・オートラジオグラフィーによって判定した。詳細には、シグナル強度は、３つの悪性度が高くないＤＣＩＳサンプル、４つの高悪性度のＤＣＩＳサンプル、５つの正常（すなわち、腫瘍でない）組織サンプル、および５つの線維腺腫サンプルから得た。オートラジオグラフィー銀粒子密度の定量分析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエア（ＵｎｉｖｅｒｓａｌＩｍａｇｉｎｇＣｏｒｐ．，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）を使用して行った。定量的撮像の結果は、相対単位（ＡＬＵ）でのフォーマット平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）で得られた。悪性度が高くないＤＣＩＳについて判定された平均標識強度は、４０８±１５０ＡＬＵであり、これに対して、高悪性度のＤＣＩＳについての平均標識強度は、３２６２±９２３ＡＬＵであった。正常（すなわち、腫瘍でない）組織は、２０６±５７ＡＬＵの評点を得た。線維腺腫は、５０２±１２０ＡＬＵの平均標識強度を有した。統計的解析は、高悪性度のＤＣＩＳシグナルが、悪性度が高くないＤＣＩＳシグナルならびに正常組織シグナルとは有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示した。悪性度が高くないＤＣＩＳシグナルは、正常組織シグナルとさほど異ならなかった（Ｐ＝０．３１）。従って、ハイブリダイズされたＢＣ２００ＲＮＡの標識強度は、ＤＣＩＳが、侵襲性になる可能性が高い悪性度のものであるか否かを判定する際の、（増分マーカーではなく）絶対的マーカーとなる。

侵襲性の腺管癌（ＩＤＣ）（腺管癌ＮＳＴ）、および管状小葉癌を含む浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）では、高レベルのＢＣ２００ＲＮＡ発現も見出された。侵襲性の癌腫は、腫瘍のタイプ、悪性度および期に依存して、１８００〜４０００ＡＬＵという高い相対シグナル強度を有した。これらの値は、正常な組織シグナルおよび線維腺腫シグナルとは有意に異なるものだった（ｐ＜０．０５）。例えば、悪性度が高くない侵襲性の腺管癌は、１８２３±４７８ＡＬＵの評点を得（８件）、高悪性度の侵襲性の腺管癌は、２９５７±８１０ＡＬＵの得点を得た（８件）。両方の値は、正常組織シグナルおよび線維腺腫シグナルとは有意に異なった（ｐ＜０．０５）。

上記に基づき、本発明に従って、上に記載したとおりオートラジオグラフィーにより判定された約１０００ＡＬＵ以上の標識シグナルを利用して、侵襲性の癌腫に進行する確立が高い、高悪性度のＤＣＩを予測することができる。約１０００ＡＬＵ未満のシグナルを利用して、侵襲性の癌腫に進行する確立が低い、悪性度が高くないＤＣＩＳを予測することができる。約１０００ＡＬＵより大きいシグナル強度を利用して、ＩＤＣおよびＩＬＣなどの侵襲性の癌腫を診断することもできる。

上述の結果は、侵襲性の癌腫の診断ばかりでなく、癌腫が、侵襲性の癌腫に進行する可能性が高いか否かを判定するためにも、ＢＣ２００ＲＮＡレベルを利用することができることを示している。さらに、高悪性度のＤＣＩＳの標識シグナルは、悪性度が高くないＤＣＩＳより有意に高く、侵襲性の癌腫に典型的な標識強度に似通っており、実際、侵襲性の癌腫と区別できないことがわかった。

従って、ＢＣ２００ＲＮＡは、腫瘍悪性度（低悪性度対中等度の悪性度対高悪性度）のインジケータとして使用することもでき、且つ、侵襲性の癌腫の診断とまだ侵襲性でない癌腫の予後に利用することできる。

Claims

乳癌の腺管上皮内癌、上皮内小葉癌、浸潤癌、粘液性癌、又は髄様癌が侵襲性の癌になる可能性の程度を決定する方法であって、
ａ）乳癌細胞のあるヒトから得た生理学的試験サンプルを、該試験サンプル中のＲＮＡが標識シグナルを有する検出試薬と反応できるように準備する工程；
ｂ）ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうかを検出可能な反応生成物を生成する条件下で、該試験サンプルを該検出試薬と合わせる工程；
ｃ）検出可能な反応生成物の量を該標識シグナルにより測定する工程；
ｄ）工程ｃ）で測定した標識シグナル量を、該試験サンプルと同じ工程を使用することによって準備された悪性の程度が低い癌対照標準からの標識シグナルと比較する工程；および
ｅ）該試験サンプル中の上昇した標識シグナルの量を、該癌が侵襲性になる可能性の程度の決定と相関させる工程；からなることを特徴とする上記方法。
該浸潤癌が浸潤性腺管癌である請求項１記載の方法。
該浸潤癌が浸潤性小葉癌である請求項１記載の方法。
該浸潤性小葉癌が管状小葉癌である請求項３記載の方法。
該検出試薬がヒトＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブである請求項１記載の方法。
ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する請求項１記載の方法。
エマルジョン・オートラジオグラフィー、リン光イメージング、光学顕微鏡検査法、共焦点顕微鏡検査法、多陽子顕微鏡検査法および蛍光顕微鏡検査法から成る群より選択される技術によって、該標識シグナル量を測定する請求項１記載の方法。
該標識シグナル量をオートラジオグラフィーによって測定し、該試験サンプルと同じ工程を使用して準備された悪性の低い癌対照標準と比較して高められたシグナル強度を利用して、侵襲性の癌に進行する高い確率をもつ高い悪性度の癌を検定する請求項７記載の方法。
乳癌の腺管上皮内癌、上皮内小葉癌、浸潤癌、粘液性癌、又は髄様癌の腫瘍の程度を決定する方法であって、
ａ）乳癌細胞のあるヒトから得た生理学的試験サンプルを、該試験サンプル中のＲＮＡが標識シグナルを有する検出試薬と反応できるように準備する工程；
ｂ）ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する条件下で、該試験サンプルを該検出試薬と合わせる工程；
ｃ）検出可能な反応生成物の量を該標識シグナルにより測定する工程；および
ｄ）工程ｃ）で測定した標識シグナル量を、該試験サンプルと同じ工程を用いることによって準備された悪性度の低い程度の癌対照標準からの標識シグナルと比較する工程からなり；
該試験サンプル中の標識シグナルと、該試験サンプルと同じ工程を使用することによって準備された低い程度の癌対照標準との相対的同一のレベルは、侵襲性の癌に進行する低い可能性をもつ、該試験サンプル中の低い程度の癌を示し、
該試験サンプルと同じ工程を使用することによって準備された低い程度の癌対照標準からの標識シグナルの量と比べて、該試験サンプル中の標識シグナルの上昇した量は、侵襲性の癌に進行する中程度の可能性をもつ、該試験サンプル中の中程度の癌を示し；そして
該試験サンプルと同じ工程を使用することによって準備された中程度の癌対照標準と比べて、該試験サンプル中の標識シグナルの上昇した量は、侵襲性の癌腫に進行する、該試験サンプル中の高程度の癌を示すことを特徴とする上記方法。
前記検出試薬がヒトＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブである請求項９記載の方法。
ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する請求項９記載の方法。
乳癌の腺管上皮内癌、上皮内小葉癌、浸潤癌、粘液性癌、又は髄様癌の存在を決定する方法であって、
ａ）乳癌細胞があるヒトから得た生理学的試験サンプルを、該試験サンプル中のＲＮＡが標識シグナルを有する検出試薬と反応できるように準備する工程；
ｂ）ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する条件下で、該試験サンプルと該検出試薬とを組合せる工程；
ｃ）検出可能な反応生成物の量をその標識シグナルにより測定する工程；および
ｄ）工程ｃ）で測定した標識シグナル量を、該試験サンプルと同じ工程を使用して調整された悪性の程度が低い癌対照標準からの標識シグナルと比較する工程からなり；
該試験サンプルと同じ工程を使用することによって準備された非侵襲性対照標準の標識シグナルの量と比べて、該試験サンプル中の標識シグナルの上昇した量が侵襲性の癌を示すことを特徴とする上記方法。
前記検出試薬がヒトＢＣ２００ＲＮＡとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブである請求項１２記載の方法。
ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ヒトＢＣ２００ＲＮＡが存在するかどうか検出可能な反応生成物を生成する請求項１２記載の方法。
エマルジョン・オートラジオグラフィー、リン光イメージング、光学顕微鏡検査法、共焦点顕微鏡検査法、多陽子顕微鏡検査法および蛍光顕微鏡検査法から成る群より選択された技術によって、前記標識シグナル量を測定する請求項１２記載の方法。