JPH03119999A - 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応で核酸を検出するため
の方法に関する。本発明は、ゲノム、細菌またはウィル
スＤＮＡに関連する核酸を興味の対象とする診断アッセ
イまたは遺伝子研究で核酸を検出するために使用するこ
とができる。

〔従来の技術〕

近年、核酸プローブ法は、研究者が試験試料中に非常に
少量存在する種々の疾患、生物体または遺伝子の特徴の
検出にその価値を見い出すにっれ急速に発達した。プロ
ーブの使用は、相補性の概念に基づく。ＤＮＡでは、２
本の鎖が相補的ヌクレオチド間で水素結合によって相互
に結合している（ヌクレオチド対としても知られている
）。

このＤＮＡ複合物は通常安定であるが、水素結合を破壊
する条件によってそれらの鎖は分離（変性）することが
できる。解離された一本鎖は相補的配列のヌクレオチド
類を有する他の鎖と再結合しうるだけであろう。このハ
イブリッド形成工程は溶液中または固体支持体上で起こ
りうる。

標的生物体または細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの標的核酸
配列は、全体的な鎖がほんの小さな部分である可能性が
あＤ、殆どの既知標識ＤＮＡプローブを使用してもその
存在を検出することが非常に困難である。プローブの感
度や核酸合成の改良を初めとする多くの研究はこの課題
を解決するために行われてきた。

当該技術分野における有意な進展は、米国特許筒４，６
８３，１９５号および同４，６８３，２０２号明細書に
記載されている。広範囲にわたり詳細に論することおけ
る核酸断片の検出は放射性同位体標識デオキシリボヌク
レオシド三リン酸の使用によって行われている。放射性
同位体も標識プローブも同様に調製されている。

しかしながら、この技術ではＰＣＲ検出方法で一様でな
いプライマー濃度の使用またはそれが特定のアッセイで
提供するかも知れない利点を考慮しそこなっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

核酸検出用標識として放射性同位体の使用は既知であＤ
、そして一定の利点を提供するかも知れないが、簡便で
、安全でかつ単純な方法の製品や保存期限の長い診断試
験キットにおいては相当な欠点を有する。放射性同位体
の使用に由来する危険性が取り扱い上の難点であること
は明白である。

医院や遠隔地で使用する目的で試験キット中にそれらを
包装することは容易でないであろう。さらに、核酸プロ
ーブで普通に使用される同位体は短い（すなわち、２な
いし３日）半減期を有する。

従って、それらは保存期限が制限されてきた。

放射性同位体の使用によって提起される課題を回避する
ことが有利であろう。このような手段は、種々の免疫学
的なアッセイに普通に使用されている酵素標識によって
提供されるかも知れない。しかしながら、ペルオキシダ
ーゼを初めとする多くの酵素は、熱感受性であり高温で
失活する。ＰＣＲ法では、検出前にプライマーエクステ
ンション産物の変性を特徴とする特定の工程で高温をし
ばしば必要とする。変性工程で失活を避けるべく注意が
はられれなかった場合にはその変性中に酵素標識が失活
されうる可能性がある。従って、診断試験キットが許容
される保存期限を有すると共に、核酸検出の安全で、簡
便でかつ単純な方法を提供する手段について絶えること
のない欲求が存在する。

〔課題を解決するための手段〕

従来方法の課題は、次の工程を含んでなる２つの相補鎖
を有する核酸の検出方法を用いて解決された。

Ａ、ハイブリッド形成条件下で変性された核酸の相補鎖
に実質的に相補的である一組のプライマーを使用してプ
ライマーエクステンション産物を形成する工程であって
、エクステンション産物がそれらの相補体から分離され
たとき前記エクステンション産物の合成用鋳型として働
（ことができ、そして前記各プライマーが少なくとも２
：工のモル比で存在することを特徴とする工程、Ｂ、前
記プライマーエクステンション産物が合成された鋳型か
らそれらを分離する工程、Ｃ６前記分離されたプライマ
ーエクステンション産物を増幅条件にかける工程、なら
びにＤ、工程Ｃで形成された増幅産物のさらなる変性を
伴うことなく、過多の前記プライマーによって形成され
た前記プライマーエクステンションの存在を比色的また
は蛍光的に検出する工程であって、前記検出が基質の存
在下で酵素標識試薬を使用して検出可能な比色シグナル
または蛍光シグナルを提供するように行われ、前記試薬
が前記検出されたプライマーエクステンション産物に相
補的であるか、または組み合わさって存在することがで
きることを特徴とする工程。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明は、試験被検体中で予定された（すなわち、標的
）１種以上の核酸に存在する特異的な核酸配列１種以上
の検出に向けられる。このような試料としては細胞質、
ウィルス体、毛髪、体液または検出することができる細
菌、ウィルス、ゲノムＤＮＡもしくはゲノムＲＮＡを含
有する他の物質が挙げられる。

本発明は、使用される反応工程数に対し指数的量で予定
された核酸配列少なくとも１種を生産する連鎖反応と組
み合わせた場合に特に有用である。

産物は、使用された特異的核酸末端に対応する末端を有
する個々の核酸複製物であろう。精製または未精製のい
ずれかの核酸起源が提供される出発原料として利用する
ことができ、それは増幅または検出を目差す特異的核酸
を含むかまたは含むことが予測される。必要があれば核
酸混合物を使用することができる。複製せしめられる配
列はフラグメントまたは核酸全体であることができる。

さらに、増幅せしめる各配列に対する一組（または対）
のプライマーを使用することによって１種を越える核酸
配列を同時に増幅することができる。

これらの配列は同一または相違する核酸であることがで
きる。

核酸は、プラスミドまたは植物、動物またはヒトのいず
れかを起源とする天然に見い出されるＤＮＡを初めとす
る各種起源から得ることができる。それは、血液、末梢
血単球、組織または当該技術分野で既知の他の起源を初
めとする各種組織から抽出することができる。この発明
は、惑染個体内およびその間で異質性がいたるところに
存在しているウィルスによって感染された流体および細
胞から抽出されるウィルスＤＮＡ　（例、ヒト乳頭腫ウ
ィルス）、ＲＮＡウィルスおよびレトロウィルス（例、
ｆＨＶ−１）の増幅および検出にとって特に有用である
。

ＤＮＡは、多くのものは当該技術分野で周知のものであ
って、その方法がＤＮＡを分解しない限りいずれか適当
な方法を使用して被検体から単離される。例えば、Ｋａ
ｎら、框１勘１丈ご１．影狂。

１０８０〜ｌ０８４ページ（１９７７）やＮａｔｕｒｅ
、　２５１．３９２〜３９３ページ（１９７４）に記載
されるように、ＤＮＡが分解される傾向を低減した温度
およびｐＨで緩衝化されたプロテアーゼまたはプロテア
−ゼＫを使用して細胞からＤＮＡは抽出されうる。他の
抽出法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌｏｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２）、ヨーロッハ特許公開第１
４５３５６号、同２４０１９１号および同２４５９４５
号公報ならびにＮｕｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）＋　　１５（１１）、　
　５５５３〜５５５６ページ、１９７８および５ａｉｋ
ｉら、旦Ｌりは山型腫び品、　１００８〜１０１２ペー
ジ（１９８５）に記載されている。

抽出されたＤＮＡは、透析、クロマトグラフィ、相補的
核酸を使用する親和性捕捉によるが、または当業者に自
明の他の適当な方法によって精製することができる。

単離されたＤＮＡが得られると、それは関連する工程数
に対し指数的な量の分子を生産する増幅方法にかけられ
る。数種のＤＮＡ分子を興味の対象とする場合には、本
発明の増幅方法を使用してそれらのすべてを複製するこ
とができるものと理解しなければならない。最終的結果
物は、その後評価のための類別手段にかけることができ
る多量の検出可能な核酸である。

通常使用される増幅方法は、米国特許第４，６８３．１
９５号および同第４，６８３．２０２号（前述）にかな
り詳細に記載されている。

プライマーは、一般的に、興味の対象とする核酸配列に
完全に相補的であるが、ブライミングやプライマーエク
ステンション産物の生成に著しく悪影響を及ぼさない場
合、標的とプライマー間にある程度のミスマツチが存在
してもよい。このことは、「実質的に相補的」によって
表わされる。

この発明における増幅では個々の核酸に特異的な一対（
−！Ｊｌ）のプライマーを使用することができる。この
ような対のプライマーでは、プライマーのモル濃度が一
様でないことが必須であＤ、般に２：１を越えるモル比
にある。好ましくは、モル比が少なくとも５：１であっ
て、必要によりさらに大きな比率であることもできる。

プライマ一対の各々について多量に存在するプライマー
は、過多に存在するプライマーとみなしている。与えら
れた標的核酸について適切なモル比は、標的核酸量、使
用される増幅周期数および検出試薬の感度に依存するで
あろうし、当業者によって容易に決定されるであろう。

その比は、ポリメラーゼ連鎖反応における効率的な増幅
および変性を必要とすることなく１種のプライマーエク
ステンション産物の効率的な検出のために設定すること
が重要である。

与えられたプライマ一対において少量で存在するプライ
マーの量もまた、公知文献および適当な実験から当業者
によって容易に決定されるであろう。一般的に、それは
、少なくとも０．００１マイクロモル濃度の量で存在し
、ｏ、ｏｏｓ〜０．５マイクロモル濃度であることが好
ましい。一般的に、この量が標的鎖の十分な増幅を提供
するのに有効である。

プライマー類は、通常−本領である。各プライマーの正
確な鎖長は、考慮されている用途、標的核酸の複雑さ、
反応温度およびプライマーの起源に応じて変動しうる。

一般的に、この発明で使用されるプライマー類は、１５
〜５０個のヌクレオチドを有し、そして好ましくは、そ
れらは２０〜３０個のヌクレオチドを有するであろう。

本発明で有用なプライマー類は各種起源から得るか、あ
るいは、例えば、八ＢＩ　ＤＮＡシンセサイザー　（Ｓ
ｙｎ　ｔｈｅｓ　１ｚｅｒ）　（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍから入手可能）またはＢｉｏｓｅａｒｃ
ｈ　（商標）　８６００シリーズ、８７００シリーズも
しくは８８００シリーズのシンセサイザー（Ｍｉｌｌｉ
ｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、より人手可能
）およびそれらの既知の使用方法を初めとする既知の１
支法および装置を使用して調製することができる。

生物学的起源から単離された天然に見０出されるプライ
マー類もまた有用である（例えば制限エンドヌクレアー
ゼ消化物）。

標的ＤＮＡが抽出され（必要があれば）そして変性され
た時、それらの核酸鎖は、プライマー類と標的ＤＮＡ鎖
のハイブリッド形成産物の混合物が生成されるような条
件下で本明細書に記載されるプライマ一対と接触される
。このような条件は、米国特許第４，６８３，２０２号
明細書に記載されるような増幅に通常使用されるもので
ある。次に、プライマーエクステンション産物が少なく
とも１種のハイブリッド形成産物と共に生成され、次い
で追加のプライが施され、エクステンション産物が生成
される。増幅の最終周期後、過多のプライマーによって
生成された産物は、最終的に加熱（または変性）工程を
必要としない適当な方法で検出される。

プライマーエクステンション産物は、−１Ｇに、ｐＨ７
〜９に緩衝化された水性溶液でプライマーを使用するこ
とによって調製することができる。この合成混合液に適
当量のデオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ　、　ｄ
ＣＴＰ　、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰも加えられ、次い
で変性が必要な場合には、得られた溶液が１０分未満９
０〜１００”Ｃに加熱される。この加熱後、熔液が好ま
しくは室温まで冷却され、次いでプライマーエクステン
ション産物の生成を誘導するのに適する剤（または触媒
）が導入される。この誘導剤は、一般に重合剤として当
該技術分野で知られている。これらの産物を生成するた
めの反応は、既知の条件下で行われる（一般に、室温か
ら重合がもはや起らなくなるまでの温度）。

重合剤は、酵素（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、タレノウポリメラーゼ、
逆転写酵素および当該技術分野で既知の他の酵素）を初
めとするプライマーエクステンション産物の合成を遂行
するように作用するいずれかの化合物または試薬類の組
み合わせであってよい。特に、有用な酵素は、クローン
化されたかまたは天然の、例えば、種々の好熱細菌株か
ら得られる熱安定性酵素である。

好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアチフス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ肥彫１国竪）またはサーマス・サーモフィ
ラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈ肛賎餅旦旦）から単離され
るか、あるいはヨーロッパ特許公開第２５８０１７号お
よび国際公開第８９１０６６９１号公報に記載されるよ
うなりローユング法によってゲノムから合成的に調製さ
れたＤＮＡポリメラーゼである。

新たに合成された核酸鎖とそれらの個々のプライマー類
を含んでなる新たに生成されたプライマーエクステンシ
ョン産物は、本発明の方法の次の工程で使用される最初
の標的類と二本鎖分子を形成する。次に、これらの核酸
鎖は前述のように変性することによって分離されて一本
鎖分子類を提供し、そして前述のようにその上で新たな
核酸が合成される。この増幅工程の進行を維持するのに
追加の試薬が必要であるかも知れないが、その後の殆ど
のエクステンション産物はプライマーと結合した特異的
核酸配列（すなわち、相補産物）からなるであろう。

標準的な分離およびエクステンション産物の合成工程を
必要なだけ繰り返して使用し、例えば検出に必要とする
所定量の特異的核酸を生成することができる。一般に、
一連の工程（周期として通常知られている）は少なくと
も一度、好ましくは１５〜５０度繰り返すことができる
。増幅処理のある時点で少量で存在するプライマーは消
費されてしまうであろうが、もう一種のプライマーによ
って増幅は進行する。従って、過多のプライマーエクス
テンション産物の一種がもう一種の産物より多く生成さ
れるであろう。この過多の産物が本発明によって検出す
ることができる。

最初の核酸またはその混合物から特定の核酸を１種より
多く生成することが望まれる場合には、上述される一般
的な工程で適当な数組のプライマー類を使用する。

通常、ひとたび所定量の過多のプライマーエクステンシ
ョン産物が発生したならば、適当な酵素基質の存在下で
直接的または間接的に比色シグナルまたは蛍光シグナル
を提供する酵素標識試薬を使用して前記産物を検出する
ことができる。有用な酵素と基質は以下により詳細に検
討する。

過多のプライマーから生成されたプライマーエクステン
ション産物の検出は、標準的なドットブロッ）　（ｄｏ
ｔ　ｂｌｏｔ）処理および装置を初めとする適当な技法
を使用して行うことができる。

−の態様では、試薬が、検出されるプライマーエクステ
ンション産物の核酸配列少なくとも１つと相補的である
酵素標識プローブである。このようなプローブ類は、当
該技術分野で既知の手段および化学、例えば、ペルオキ
シダーゼ標識プローブを公表する技術文献の代表的なも
のである国際公開第８９１０２９３２号公報に記載され
るような手段を使用して調製することができる。このよ
うなプローブ類が、過多に存在するプライマーエクステ
ンション産物とハイブリッドを形成し、そして得られた
ハイブリッド形成産物が適当な手段、例えば、ポリマー
ビーズに結合されたアビジンを有する不溶性試薬のよう
な捕捉試薬を使用することによってハイブリッドを形成
しなかった物質と分離された後、そのハイブリッド形成
産物を検出することができる。

もう一つの態様では、酵素標識試薬が特異的パインディ
ング部分に結合した酵素を含んでなる。

得られた結合体は、過多に存在するプライマーエクステ
ンシゴン産物上の対応する受容体とパインディング部分
との複合化によって興味の対象とするプライマーエクス
テンション産物を伴うことができる。例えば、アビジン
とペルオキシダーゼ結合体を使用して過多に存在するビ
オチン化プライマーエクステンション産物と複合体を形
成することができる。他の特異的バインデイン・グ複合
体を同様に設計し使用することもできる（例えば、垢と
レクチンおよび抗体とハプテン）。このような物質およ
び調製手段は当該技術分野で周知である。

ビオチン化プライマーエクステンション産物とアビジン
−ペルオキシダーゼ結合体の得られた複合体は、そのプ
ライマーエクステンション産物に相補的である捕捉プロ
ーブを使用して未複合化物質から分離することができる
。捕捉プローブは当該技術分野で周知であＤ、オリゴヌ
クレオチドが適当に結合されたポリマー粒子が挙げられ
る。

不溶化されたハイブリッド形成産物の分離が必要である
場合には、遠心、濾過および洗浄を初めとするいずれか
適当な分離手段を使用することができる。好ましくは、
微孔質濾過膜が使用され、このものは診断試験キットの
一部として供給される。特に有用な微孔質濾過膜として
は、Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐから市販されているポリアミド
膜〔例えば、Ｕｌｔｉｐｏｒｅ　（商標）　、Ｌｏｐｒ
ｏｄｙｎｅ（商標）またはＢｉｏｃｌｙｎｅ（商標）膜
〕が挙げられる。必要があればこれらの膜は、タンパク
質類（例えばカゼイン、スクシニル化カゼイン）または
非イオン界面活性剤を塗布してもよい。

これらの膜は、流体と可溶性物質を集めるのに適する容
器類を伴う分離支持体として使用することができる。ま
た、それらは試験装置の一部として固定されていること
が好ましい。各種の装置が米国特許第３．８２５．４１
０号、同３，８８８．６２９号、同３．９７０，４２９
号および同４，４４６．２３２号明細書に記載されるも
のを初めとして当該技術分野で既知である。特に有用な
装置は、ヨーロッパ特許公開第３０８２３１号公報で記
載されている。

酵素標識試薬とプライマーエクステンション産物との接
触と共に、適当な基質と検出可能な比色シグナルまたは
蛍光シグナルを発生するのに必要ないずれか他の試薬類
が供給される。有用な酵素標識としては、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられる。

ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが好ま
しく、ペルオキシダーゼが最も好ましいものである。

有用な基質と色素供給試薬は、与えられる酵素について
当該技術分野で既知である。例えば、ペルオキシダーゼ
について有用な色素供給試薬としては、テトラメチルベ
ンジジンおよびその誘導体、ならびに米国特許第４，０
８９，７４７号に記載されているトリアリールイミダゾ
ールロイコ染料のようなロイコ染料が挙げられる。特に
有用な色素供給組成物としては、例えば、特開平１−１
００４５３号公報に記載される特定の安定化剤との組み
合わせで使用されるトリアリールイミダゾールロイコ染
料が挙げられる。

不溶性物質中の色素の存在が試験された被検体における
標的ＤＮＡの存在の指標となる。色素は、しばしば機器
を用いることなく肉眼的に観察することができるが、幾
つかの例では、色素濃度が希薄であるかまたは電磁スペ
クトルの可視領域外にあるため適正な検出に適する検出
機器（すなわち、分光光度計）が必要である。これを行
うための方法は、当該技術分野で周知である。

この発明の方法を使用して感染症、遺伝子疾患またはガ
ンのような細胞性疾患に関連する核酸を増幅または検出
することができる。各種感染症は、細菌、酵母、プロト
シアまたはウィルスのような生物体に関する臨床被検体
中の少量ＤＮＡの存在によって診断することができる。

−の態様では、２つの相補鎖を有する核酸の検出方法が
下記工程を含んでなる。

Ａ、プライマー類とそれらの相補的核酸鎖のハイブリッ
ド形成産物を生成するようなハイブリッド形成条件下で
、変性された核酸の相補鎖とデオキシリボヌクレオシド
−５′−三リン酸、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ　姐竪山旦）またはそれのゲノム由来のクロー
ンから単離されたＤＮＡポリメラーゼおよび前記変性さ
れた核酸鎖に実質的に相補的である一組のプライマーを
接触させる工程であって、エクステンション産物の相補
体から分離した場合にそれらが前記エクステンション産
物の合成鋳型として働くことができそして前記プライマ
ー類が少なくとも５：１のモル比で存在する工程、 Ｂ、前記プライマーエクステンション産物が合成された
鋳型からそれらを分離する工程、Ｃ９前記分離されたプ
ライマーエクステンション産物を少なくとも１５周期の
増幅条件にかける工程、ならびに Ｄ、工程Ｃで生成された増幅産物のさらなる変性を伴う
ことなく、過多に存在するプライマーを使用して生成さ
れたプライマーエクステンション産物の存在を比色的に
検出する工程であって、この検出が、ペルオキシダーゼ
応答性ロイコ染料と過酸化水素の存在下で色素を提供す
ることができ、検出されるプライマーエクステンション
産物と組み合わさって存在しうるペルオキシダーゼ標識
試薬と、検出されるプライマーエクステンション産物に
相補的な捕捉プローブを使用して行われる工程。

〔実施例〕

これらの例では、酵素標識試薬、捕捉プローブおよび比
色検出ならびに２つの種々の一様でないプライマー比を
使用する本発明の方法を示す。この方法では増幅後に最
終的な変性工程を含まない。

林−料 ＤＮＡ試料は、ＨＬＡホモ接合リンす芽球細胞系Ｌ　Ｂ
　Ｆ　（ＧＭ　０３１６３＋　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　ＣｅｌｌＤｅｐｏｓｉｔｏｒｙ−
Ｃａｍｄｅｎ、　Ｎ、Ｊ、−より入手）からプロテイナ
ーゼに消化および標準的な手順を用いるフェノール／ク
ロロホルム抽出によって単離した。

使用したプライマー類は、標準的な略号Ａ（アデニン）
、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）およびＣ（シトシン）
を用いる下記の配列を有していた。

プライマー１（（−）鎖に相補性〕 ５　　’　　−Ｘ−ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡ
ＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧ−３’プライマー２（（＋）鎖に
相補性〕 ５　’　−Ｘ−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＧＣＡＧＣ
ＧＧＴＡＧＡＧＴＴＧ−３’上式中、Ｘは、国際公開第
８９１０２９３１号公報に記載された方法を用い、アミ
ノテトラエチレングリコールスペーサー基を介して結合
したビオチンを表わす。

捕捉プローブは、前記（−）鎖に相補的なオリゴヌクレ
オチドが共有結合したポリ（スチレンーコーアクリル酸
）（７０：　３０、モル比、平均直径０．７マイクロメ
ーター）のポリマー粒子形成物から構成した。このオリ
ゴヌクレオチドは、下記配列を有する。

５　　’　　−Ｙ−ＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣ
ＴＴＡＧＡＴＴＴＧ−３’上式中、Ｙは、国際公開第８
９１０２９３１号公報に記載される手順によって調製さ
れたアミノテトラエチレングリコールスペーサー基を表
わす。

これらのポリマー粒子は、標準的な乳化重合法を使用し
て調製し、次いでアミノテトラエチレングリコールスペ
ーサー基および３−（ジメチルアミノ）プロピルエチル
カルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミド試薬を用
いる標準的な化学方法を使用して前記粒子にオリゴヌク
レオチドを結合した。

５ｕｒｅｃｅｌｌ　（商標）使い捨て試験装置を使用し
た。

それは、カゼインを塗布した（約１　ｇ／ｒｒｒ）　１
．２マイクロメーターの組子寸法のＢｉｏｄｙｎｅ（商
標）Ａナイロン微孔質膜を含む。

色素供給組成物は、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキ
シフェニル）　−４、５−ビス（４−メトキシフェニル
）−イミダゾールロイコ染料（０，００８重四％）、ポ
リ（ビニルピロリドン）（Ｉｌｉｆｆｉ％）、リン酸ナ
トリウム（１０ミリモル濃度、ρ１１６．８　）、ジエ
チレントリアミン五酢酸（１０マイクロモル濃度）、４
′−ヒドロキシアセタニリド（２ミリモル濃度）および
過酸化水素（１０ミリモル濃度）を含めた。

アッセイ ＬＢＦ細胞系由来のＤＮＡを、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（５ミリモル濃度、ｐＨ
８，３）、塩化マグネシウム（２，５ミリモル濃度）、
各ｄＮＴＰ　（それぞれ１７５マイクロモル濃度）、サ
ーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ剪９±国川）
から単離用れたＤＮＡポリメラーゼ（２国際車位）、（
＋）鎖に相補的なプライマー（０，２マイクロモル濃度
）および（−）鎖に相対的な少量のプライマー（０，０
２かまたは０．０４マイクロモル濃度）を含有する１０
０Ｉ反応器中で増幅した。

増幅処理は、市販のＰｅｒｋｉｎ　　Ｅｌｍｅｒ　Ｔｈ
ｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒを使用して３０周期（各周期は
、９５°Ｃで３０秒間の変性、５５°Ｃで３０秒間のハ
イブリダイゼーションおよび７０°Ｃで６０秒間のプラ
イマーエクステンションを含んでなる）行った。過多の
プライマーから得られた二本鎖ＤＮＡ産物は、最終加熱
工程で変性しなかった。

対照増幅は、プライマー類を等しい量で使用し最終変性
工程を５分間９５°Ｃで行った以外は同じ試薬と方法を
用いて行った。

増幅された産物の検出は、前述のポリメラーゼ連鎖反応
混合物（１００ＩＪ１）を、リン酸ナトリウム（８，５
ミリモル濃度、ｐＨ７，４）、塩化ナトリウム（１４９
ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル
濃度）およびトリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）　（商標）Ｘ
−１００非イオン界面活性剤（０，１重量％）を含む溶
液の最終容量３０１１１中で捕捉プローブ（２００ｎ）
と混合することによって行った。この混合物を１０分間
４２°Ｃでインキュベートして過多の（−）鎖に前記プ
ローブをハイブリッド形成させた。得られた懸濁液を５
ｕｒｅｃｅｌｌ　（商標）使い捨て試験装置に加え、そ
の試験装置の試験ウェル中の膜上に不溶化生成物を集め
た。この不溶化生成物を予め５５°Ｃに加温した、リン
酸ナトリウム（８，５ミリモル濃度）、塩化ナトリウム
（１４９ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１
ミリモル濃度）およびドデシル硫酸ナトリウム（０，５
重量％）の溶液で洗浄した。

次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン結合体（
２，３ｎｇ）　　（Ｋｏｄａｋ　５ｅｅ−Ｑｕｅｎｃｅ
　（商標）ＨＬＡ　　ＤＱ＆　ａ転子プローブキットと
して入手可能〕を前記試験装置に加えて不溶化ビオチニ
ル化プライマーエクステンション産物と反応させた。こ
の試験装置を２分間約２０〜２５°Ｃでインキュベート
し、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンシ
ル硫酸ナトリウム（２，４重量％）、塩化ナトリウム（
０，５モル濃度）および１−メチル−２−ピロリドン（
１０重量％）の溶液（２００ｍ）で洗浄した。

次に、色素供給組成物（５０ＪＩＩ）を加え、次いで５
分間２０〜２５°Ｃでインキュベートした。アッセイの
結果（対照と本発明と共に）を、０から５の尺度（５が
最高の色素濃度である）を用いる視覚的な色素の読みを
下記表に示す。

対照のアッセイは許容できる視覚的なシグナルを提供す
るが、これは酵素標識試薬が変性工程後に集められた生
成物に加えられたために可能であったにすぎない。これ
が特定アッセイに対する制限である。本発明は、加熱工
程が酵素標識の有効性を損ねるであろう増幅後の最終的
な変性を必要とすることなく、酵素標識試薬を用いて満
足すべき分析結果を得るための手段を提供することが明
らかである。従って、それが酵素標識試薬を使用するア
ッセイに対し一層多くの適用性を付与する。

人 対照１　　　　　１　　：　　１　　　　４．５例１　
　５　：　１　　４．５ 例２　　１０７１　　４．５ 〔発明の効果〕 本発明は数々の利点を提供するので、核酸検出の技術分
野を進歩させる。本発明は、低濃度で標的核酸に対して
安全かつ感度よ〈実施するための簡便で単純な方法であ
る。それは、許容される半減期を有する簡単な診断試験
キットを用いて実施することができ、医院や他の試験場
で不必要な危害を与えないであろう。

これらの利点は、標的核酸の存在を示す比色シグナルま
たは蛍光シグナルを提供するのに使用することができる
酵素検出試薬を用いることによって達成される。それら
の欠点を伴う放射性同位体が避けられる。さらに、酵素
検出試薬が増幅処理中で一様でない量のプライマー類と
組み合わせて使用されるので、過多のプライマーに由来
する産物の検出前の変性を避けることができる。こうし
て熱感受性酵素は失活から保護される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ．ハイブリッド形成条件下で変性された核酸の相
   補鎖に実質的に相補的である一組のプライマーを使用し
   てプライマーエクステンション産物を形成する工程であ
   って、エクステンション産物がそれらの相補体から分離
   されたとき前記エクステンション産物の合成用鋳型とし
   て働くことができ、そして前記各プライマーが少なくと
   も２：１のモル比で存在することを特徴とする工程、 Ｂ、前記プライマーエクステンション産物が合成された
   鋳型からそれらを分離する工程、Ｃ、前記分離されたプ
   ライマーエクステンション産物を増幅条件にかける工程
   、ならびにＤ、工程Ｃで形成された増幅産物のさらなる
   変性を伴うことなく、過多の前記プライマーによって形
   成された前記プライマーエクステンションの存在を比色
   的または蛍光的に検出する工程であって、前記検出が基
   質の存在下で酵素標識試薬を使用して検出可能な比色シ
   グナルまたは蛍光シグナルを提供するように行われ、前
   記試薬が前記検出されたプライマーエクステンション産
   物に相補的であるか、または組み合わさって存在するこ
   とができることを特徴とする工程、を含んでなる２つの
   相補鎖を有する核酸の検出方法。