JPH02299600A - 固相捕捉手段を使用する核酸の検出方法および診断キット - Google Patents
固相捕捉手段を使用する核酸の検出方法および診断キットInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は診断試験キットならびにオリゴヌクレオチドプ
ライマー、標識したプローブおよび増幅手順を使用する
1種以上の特定の核酸配列を検出するための方法に関す
る。この方法は、検出前に増幅生成物を捕捉するための
特有の手順を含む。
ライマー、標識したプローブおよび増幅手順を使用する
1種以上の特定の核酸配列を検出するための方法に関す
る。この方法は、検出前に増幅生成物を捕捉するための
特有の手順を含む。
本発明は法医学的調査ならびに遺伝疾患および感染症の
検出において使用することができる。
検出において使用することができる。
試験試料中に極めて少量存在する各種の疾病、生物体ま
たは遺伝的特徴の検出について、核酸プローブ技術の有
用性を研究者が見い出すにつれ、その技術は近年急速に
進歩してきた。プローブの使用は相補性概念に基礎をお
いている。例えば、DNAは二本鎖であり、これらの鎖
は相補的ヌクレオチド(また、ヌクレオチド対としても
知られる)間で水素結合によって相互にパインディンク
される。
たは遺伝的特徴の検出について、核酸プローブ技術の有
用性を研究者が見い出すにつれ、その技術は近年急速に
進歩してきた。プローブの使用は相補性概念に基礎をお
いている。例えば、DNAは二本鎖であり、これらの鎖
は相補的ヌクレオチド(また、ヌクレオチド対としても
知られる)間で水素結合によって相互にパインディンク
される。
DNA複合体は、一般に安定であるが、水素結合を崩壊
する条件下で分離(または変性)することができる。分
離した一本鎖は、相補的なヌクレオチド配列を有する他
の鎖とのみ再会合しつる。
する条件下で分離(または変性)することができる。分
離した一本鎖は、相補的なヌクレオチド配列を有する他
の鎖とのみ再会合しつる。
このハイブリダイゼーション(またはハイブリッド化)
は、溶液中または固体材料上で生じうる。
は、溶液中または固体材料上で生じうる。
一般にRNAは一本鎖であり変性を必要としないであろ
う。それもまた、相補的なヌクレオチド配列を有する他
の鎖またはその一部分とハイブリッドしうる。
う。それもまた、相補的なヌクレオチド配列を有する他
の鎖またはその一部分とハイブリッドしうる。
標的生物体または細胞のDNAまたはRNAの標的核酸
配列は全体の鎖中で小さな部分に限られる場合があるの
で、殆どの既知の標識したプローブを使用してその存在
を検出することは非常に困難である。この課題を解決す
るために行われてきた多くの研究は、プローブの感度の
改良と核酸の合成を含む。
配列は全体の鎖中で小さな部分に限られる場合があるの
で、殆どの既知の標識したプローブを使用してその存在
を検出することは非常に困難である。この課題を解決す
るために行われてきた多くの研究は、プローブの感度の
改良と核酸の合成を含む。
当該技術分野の顕著な進歩は、米国特許第4、683.
202号明細書に記載された方法にみられる。
202号明細書に記載された方法にみられる。
その方法に関して広範囲にわたる詳細な説明はなされて
いないが、それは、重合試薬(例えば、ポリメラーゼ)
および4種のヌクレオチド三リン酸ならびにプライマー
から形成されたエクステンション生成物の存在下で核酸
の鋳型にプライマーをハイブリッド化する増幅技術であ
る。これらの生成物は、それらのその後の検出を容易に
する目的で多種多量に存在する核酸を増幅する周期的な
反応にふいて変性されそして鋳型として使用されている
。米国特許第4.683.202号明細書の増幅手順は
、少量の標的核酸配列から多量の検出可能な物質を生成
するためにできるだけ長時間かけて周期的に実施される
可能性がある。
いないが、それは、重合試薬(例えば、ポリメラーゼ)
および4種のヌクレオチド三リン酸ならびにプライマー
から形成されたエクステンション生成物の存在下で核酸
の鋳型にプライマーをハイブリッド化する増幅技術であ
る。これらの生成物は、それらのその後の検出を容易に
する目的で多種多量に存在する核酸を増幅する周期的な
反応にふいて変性されそして鋳型として使用されている
。米国特許第4.683.202号明細書の増幅手順は
、少量の標的核酸配列から多量の検出可能な物質を生成
するためにできるだけ長時間かけて周期的に実施される
可能性がある。
標的配列が検出可能な量まで十分に増幅してしまえば、
検出様式が重要となる。検出に関する多くの技術は、前
記特許(カラム15)に記載されており、ラジオアイソ
トープ、ビオチン、もしくは酵素で標識されたプローブ
(ビオチン−アビジン結合を介してプローブに結合され
る、カラム26を参照)またはゲル電気泳動の使用を含
む。
検出様式が重要となる。検出に関する多くの技術は、前
記特許(カラム15)に記載されており、ラジオアイソ
トープ、ビオチン、もしくは酵素で標識されたプローブ
(ビオチン−アビジン結合を介してプローブに結合され
る、カラム26を参照)またはゲル電気泳動の使用を含
む。
従来技術に既知の標識したプライマーの使用には固有の
利点が存在するとはいえ、さらなる改良、例えば標識し
たプライマーの構築を簡略化して検出方法を容易にする
ことが望まれる。
利点が存在するとはいえ、さらなる改良、例えば標識し
たプライマーの構築を簡略化して検出方法を容易にする
ことが望まれる。
本発明は、標識したプライマーを使用する増幅および核
酸の検出に重要な改良を提供する。
酸の検出に重要な改良を提供する。
従って、本発明は、予め方向づけされた核酸であって、
2つの相補的鎮を有する特定の核酸配列の検出方法にお
いて、 A、予め方向づけされた核酸を含むことが予測される被
験体を、特定の核酸配列順に相補的な第一および第二オ
リゴヌクレオチドプライマーであって少なくともその第
一プライマーを特異的バインディングリガンドで標識し
ているプライマー類と接触させ、その第一および第二プ
ライマーとその相補的な核酸鎖のハイブリッド化生成物
の混合物を形成する工程、 B、前記ハイブリッド化生成物における第一および第二
プライマー・エクステンション生成物であってそれらの
相補体(complement)から分離した場合に前
記プライマー・エクステンション生成物類の合成用鋳型
として役立てることができる前記エクステンション生成
物類を形成する工程、C,プライマー・エクステンショ
ン生成物類が合成された鋳型からそれらを分離する工程
、D、前記分離したプライマー・エクステンション生成
物類および被験体を追加の第一および第二プライマーと
接触させ、相補的な生成物を形成するために特定の核酸
配列の増幅をもたらす工程、E、工程りで形成した相補
的な生成物からプライマー・エクステンション生成物類
を分離する工程、 F、工程Eで分離した第一プライマー・エクステンショ
ン生成物を、それに相補的である検出可能に標識したオ
リゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識したプ
ローブと第一プライマー・エクステンションとの生成物
を形成する工程、ならびに G、被験体中に予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして工程Fで形成した相補的な生成物の検出工程、
を含んでなり、さらに、検出工程G前に、第一プライマ
ーの特異的バインディングリガンドが固体支持体材料に
結合した受容体と複合体を形成する工程を供給すること
を特徴とする方法を提供する。
2つの相補的鎮を有する特定の核酸配列の検出方法にお
いて、 A、予め方向づけされた核酸を含むことが予測される被
験体を、特定の核酸配列順に相補的な第一および第二オ
リゴヌクレオチドプライマーであって少なくともその第
一プライマーを特異的バインディングリガンドで標識し
ているプライマー類と接触させ、その第一および第二プ
ライマーとその相補的な核酸鎖のハイブリッド化生成物
の混合物を形成する工程、 B、前記ハイブリッド化生成物における第一および第二
プライマー・エクステンション生成物であってそれらの
相補体(complement)から分離した場合に前
記プライマー・エクステンション生成物類の合成用鋳型
として役立てることができる前記エクステンション生成
物類を形成する工程、C,プライマー・エクステンショ
ン生成物類が合成された鋳型からそれらを分離する工程
、D、前記分離したプライマー・エクステンション生成
物類および被験体を追加の第一および第二プライマーと
接触させ、相補的な生成物を形成するために特定の核酸
配列の増幅をもたらす工程、E、工程りで形成した相補
的な生成物からプライマー・エクステンション生成物類
を分離する工程、 F、工程Eで分離した第一プライマー・エクステンショ
ン生成物を、それに相補的である検出可能に標識したオ
リゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識したプ
ローブと第一プライマー・エクステンションとの生成物
を形成する工程、ならびに G、被験体中に予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして工程Fで形成した相補的な生成物の検出工程、
を含んでなり、さらに、検出工程G前に、第一プライマ
ーの特異的バインディングリガンドが固体支持体材料に
結合した受容体と複合体を形成する工程を供給すること
を特徴とする方法を提供する。
また、本発明は、予め方向づけされた核酸であって、2
つの相補的な鎖を有する特定の核酸配列の検出方法であ
って、 A、予め方向づけされた核酸を含むことが予測される被
験体を、 (1)前記特定の核酸配列鎖に相補的な第一および第二
オリゴヌクレオチドプライマーであって、少なくともそ
の第一プライマーは特異的バインディングリガンドで標
識しているプライマー類、ならびに (2)その特異的バインディングリガンドを結合するた
めに受容体を有する固体支持体材料と接触させ、 少なくとも第一プライマーが前記特異的リガンドと受容
体の複合体を介して前記支持体材料に結合される第一お
よび第二プライマーとその相補的な鎖とのハイブリッド
化生成物の混合物を形成する工程、 B、前記ハイブリッド化生成物における第一および第二
プライマー・エクステンション生成物であって、それら
の相補体から分離した場合に前記プライマー・エクステ
ンション生成物類の合成用鋳型として役立てうる前記エ
クステンション生成物類を形成する工程、 C1第一プライマー・エクステンション生成物を不溶性
とし前記プライマー・エクステンション生成物類を合成
した鋳型からそれらを分離する工程、 D、この分離したプライマー・エクステンション生成物
類および被験体を追加の第一および第二プライマーと接
触させ、相補的な生成物を形成するために被験体核酸配
列の増幅をもたらす工程、E、工程りで形成した相補的
な生成物からプライマー・エクステンション生成物類を
分離する工程、 F、工程Eで分離した不溶性第一プライマー・エクステ
ンション生成物を、それに相補的である検出可能に標識
したオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識
したプローブと不溶性第一プライマー・エクステンショ
ン生成物との生成物を形成する工程、ならびに G、被験体中の予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして工程Fで形成した不溶性の相補的な生成物を検
出する工程、を含んでなる方法を提供する。
つの相補的な鎖を有する特定の核酸配列の検出方法であ
って、 A、予め方向づけされた核酸を含むことが予測される被
験体を、 (1)前記特定の核酸配列鎖に相補的な第一および第二
オリゴヌクレオチドプライマーであって、少なくともそ
の第一プライマーは特異的バインディングリガンドで標
識しているプライマー類、ならびに (2)その特異的バインディングリガンドを結合するた
めに受容体を有する固体支持体材料と接触させ、 少なくとも第一プライマーが前記特異的リガンドと受容
体の複合体を介して前記支持体材料に結合される第一お
よび第二プライマーとその相補的な鎖とのハイブリッド
化生成物の混合物を形成する工程、 B、前記ハイブリッド化生成物における第一および第二
プライマー・エクステンション生成物であって、それら
の相補体から分離した場合に前記プライマー・エクステ
ンション生成物類の合成用鋳型として役立てうる前記エ
クステンション生成物類を形成する工程、 C1第一プライマー・エクステンション生成物を不溶性
とし前記プライマー・エクステンション生成物類を合成
した鋳型からそれらを分離する工程、 D、この分離したプライマー・エクステンション生成物
類および被験体を追加の第一および第二プライマーと接
触させ、相補的な生成物を形成するために被験体核酸配
列の増幅をもたらす工程、E、工程りで形成した相補的
な生成物からプライマー・エクステンション生成物類を
分離する工程、 F、工程Eで分離した不溶性第一プライマー・エクステ
ンション生成物を、それに相補的である検出可能に標識
したオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識
したプローブと不溶性第一プライマー・エクステンショ
ン生成物との生成物を形成する工程、ならびに G、被験体中の予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして工程Fで形成した不溶性の相補的な生成物を検
出する工程、を含んでなる方法を提供する。
本発明は、また、オリゴヌクレオチドプライマーを結合
したポリマー粒子の水性懸濁物であって、特異的バイン
ディングリガンドとその受容体との特異的バインディン
グ複合体を介してその粒子に前記プライマーが結合して
いる水性懸濁物をも提供する。
したポリマー粒子の水性懸濁物であって、特異的バイン
ディングリガンドとその受容体との特異的バインディン
グ複合体を介してその粒子に前記プライマーが結合して
いる水性懸濁物をも提供する。
さらに本発明は、
(a)予め方向づけされた核酸配列の個々の鎮に相補的
な第一および第二オリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、そのプライマー類の少なくとも1つは特異的バイン
ディングリガンドによって標識されている前記プライマ
ー類、 (b、)固体支持体材料に結合し、そしてキット中で独
立した包装としてかまたは前記プライマー類の一つの特
異的バインディングリガンドと複合化するように供給さ
れた特異的バインディングリガンドに対する受容体、 (c)プライマー・エクステンションのための重合試薬
、ならびに (d)デオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP。
な第一および第二オリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、そのプライマー類の少なくとも1つは特異的バイン
ディングリガンドによって標識されている前記プライマ
ー類、 (b、)固体支持体材料に結合し、そしてキット中で独
立した包装としてかまたは前記プライマー類の一つの特
異的バインディングリガンドと複合化するように供給さ
れた特異的バインディングリガンドに対する受容体、 (c)プライマー・エクステンションのための重合試薬
、ならびに (d)デオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP。
clcTP 、 dGTPおよびdTTP、を含んでな
る診断試験キットを提供する。
る診断試験キットを提供する。
検出のためにプライマー、プローブまたはオリゴ断片に
関して本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」の語
は、2個以上の、好ましくは3個より多くのデオキシリ
ボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドをいう。限定さ
れるものでないが、正確なサイズは、オリゴヌクレオチ
ドの最終的な使用または機能を含む多くの因子により左
右される。オリゴヌクレオチドは、合成的にまたはクロ
ーニングによって誘導されうる。
関して本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」の語
は、2個以上の、好ましくは3個より多くのデオキシリ
ボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドをいう。限定さ
れるものでないが、正確なサイズは、オリゴヌクレオチ
ドの最終的な使用または機能を含む多くの因子により左
右される。オリゴヌクレオチドは、合成的にまたはクロ
ーニングによって誘導されうる。
「プライマー」の語は、核酸鎖が相補的なプライマー・
エクステンション生成物の合成を誘導する条件下におか
れたとき、合成開始点として機能することができる天然
または合成的に生成されたオリゴヌクレオチドをいう。
エクステンション生成物の合成を誘導する条件下におか
れたとき、合成開始点として機能することができる天然
または合成的に生成されたオリゴヌクレオチドをいう。
かかる条件には、ヌクレオチド(例えば、4種の標準的
なデオキシリボヌクレオシド三リン酸)およびDNAポ
リメラーゼのような重合試薬ならびに適当な温度および
pHが含まれる。
なデオキシリボヌクレオシド三リン酸)およびDNAポ
リメラーゼのような重合試薬ならびに適当な温度および
pHが含まれる。
−の態様では、プライマーは二本鎖と一本領領く15)
域の隣接域に標識した核酸を含む。−末鎖領域は、そこ
でハイブリッド化する鋳型鎖に対して十分に相補的であ
る核酸配列を含む。プライマーの二本領領域または尾部
は、検出可能なシグナルを発生することができるかまた
はエクステンション生成物を捕捉もしくは固定する上で
有用な検出可能成分で標識することができる。これらの
プライマー、有用な標識および調製方法に関するさらな
る詳細は当該技術分野で知られている。
でハイブリッド化する鋳型鎖に対して十分に相補的であ
る核酸配列を含む。プライマーの二本領領域または尾部
は、検出可能なシグナルを発生することができるかまた
はエクステンション生成物を捕捉もしくは固定する上で
有用な検出可能成分で標識することができる。これらの
プライマー、有用な標識および調製方法に関するさらな
る詳細は当該技術分野で知られている。
もう一つのそして好ましい態様では、プライマーは完全
な一本鎖である。好ましくは、プライマーは一本鎖オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドである。それは、重合試薬
の存在下でエクステンション生成物の合成を生ずるのに
十分な鎖長でなければならないが、その正確なサイズは
考慮されている用途、標的配列の複雑さ、反応温度およ
びプライマーの起源に応じて変動しろる。一般的に、こ
の発明で使用される各プライマーは、15〜40個のヌ
クレオチド、好ましくは20〜25個のヌクレオチドを
有するであろう。
な一本鎖である。好ましくは、プライマーは一本鎖オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドである。それは、重合試薬
の存在下でエクステンション生成物の合成を生ずるのに
十分な鎖長でなければならないが、その正確なサイズは
考慮されている用途、標的配列の複雑さ、反応温度およ
びプライマーの起源に応じて変動しろる。一般的に、こ
の発明で使用される各プライマーは、15〜40個のヌ
クレオチド、好ましくは20〜25個のヌクレオチドを
有するであろう。
本発明で使用されるプライマーは、増幅されるそれぞれ
特定の配列の各種の鎖に「本質的」に相補的であるもの
が選ばれる。これは、それらの各自の鎖とハイブリッド
して目的のハイフ゛リッド化生成物を形成するのに、そ
れらが十分な相補性でなければならないことを意味する
。それらがノ\イブリダイゼーションおよびエクステン
ション生成物の形成を阻害しない限り非相補的な塩基が
それらの中に組み込まれていてもよい。増幅効率におい
て最高の結果を得るには、プライマー類が適切な相補性
を有することが好ましい。
特定の配列の各種の鎖に「本質的」に相補的であるもの
が選ばれる。これは、それらの各自の鎖とハイブリッド
して目的のハイフ゛リッド化生成物を形成するのに、そ
れらが十分な相補性でなければならないことを意味する
。それらがノ\イブリダイゼーションおよびエクステン
ション生成物の形成を阻害しない限り非相補的な塩基が
それらの中に組み込まれていてもよい。増幅効率におい
て最高の結果を得るには、プライマー類が適切な相補性
を有することが好ましい。
本発明は、被験体で予め方向づけされた同一または相違
する核酸中に存在する1種以上の特定の核酸配列の検出
に向けられる。これらの被験体としては、細胞質物質、
ウィルス体、毛、体液または検出することができる遺伝
子DNAまたはRNAを含むその他の材料を挙げること
ができる。このような検出の主要目的はヒトの診断にあ
るが、DNAまたはメツセンジャーRNAのクローニン
グ効率を向上し、あるいは化学合物で得られた核酸混合
物から多量の目的配列を得る目的にも本発明を使用する
ことができる。
する核酸中に存在する1種以上の特定の核酸配列の検出
に向けられる。これらの被験体としては、細胞質物質、
ウィルス体、毛、体液または検出することができる遺伝
子DNAまたはRNAを含むその他の材料を挙げること
ができる。このような検出の主要目的はヒトの診断にあ
るが、DNAまたはメツセンジャーRNAのクローニン
グ効率を向上し、あるいは化学合物で得られた核酸混合
物から多量の目的配列を得る目的にも本発明を使用する
ことができる。
本発明は、必要とされる反応工程の数に関連し指数関数
的な量で特定の核酸配列少なくとも1種を生ずるための
連鎖(chain)反応を伴う。生成物は、使用される
特異的なプライマーの両端に対応する末端を有する別個
に二つが相補的に結合した核酸となるであろう。精製し
たまたは精製していないどのような核酸起源も、それが
検出の標的となる特定の、核酸配列を含むかまたは含む
ことが予測されるかぎりは出発原料として利用すること
ができる。場合によって核酸混合物を使用することがで
きる。複製される配列は、断片であるか完全な核酸であ
ってもよい。さらに、1種より多くの核酸配列を、増幅
される各配列に対する特殊なプライマーセットと標識し
たプローブを使用することによって同時に増幅すること
ができる。配列は同一または相違する核酸であることが
可能である。
的な量で特定の核酸配列少なくとも1種を生ずるための
連鎖(chain)反応を伴う。生成物は、使用される
特異的なプライマーの両端に対応する末端を有する別個
に二つが相補的に結合した核酸となるであろう。精製し
たまたは精製していないどのような核酸起源も、それが
検出の標的となる特定の、核酸配列を含むかまたは含む
ことが予測されるかぎりは出発原料として利用すること
ができる。場合によって核酸混合物を使用することがで
きる。複製される配列は、断片であるか完全な核酸であ
ってもよい。さらに、1種より多くの核酸配列を、増幅
される各配列に対する特殊なプライマーセットと標識し
たプローブを使用することによって同時に増幅すること
ができる。配列は同一または相違する核酸であることが
可能である。
各プライマーセットが個々のセットに対して特異的にバ
インディングするりガントを有するならば、各配列は個
々にまたはまとめて検出することができる。場合により
、各セットの両プライマーとも特異的バインディングリ
ガンドで標識してもよい。
インディングするりガントを有するならば、各配列は個
々にまたはまとめて検出することができる。場合により
、各セットの両プライマーとも特異的バインディングリ
ガンドで標識してもよい。
核酸は、プラスミド、いずれかの起源(例えば、細菌、
酵母、ウィルス、植物および高等動物、ヒト)に由来す
る天然のDNAまたはRNAから得ることができる。そ
れは、血液、組織材料または当該技術分野で既知の他の
起源を含む多様な組織から既知の方法を使用して抽出す
ることが可能である。本発明は、ウィルスまたはいずれ
かの生物体細胞に見られる核酸配列、例えば、細菌DN
A、ウィルスRNAまたは細菌もしくはウィルス感染細
胞に見られるDNAもしくはRNAの検出に特に有用で
ある。この発明は、HIV−Iまたは他のレトロウィル
スが感染した細胞由来のDNAの検出に特に有用である
。
酵母、ウィルス、植物および高等動物、ヒト)に由来す
る天然のDNAまたはRNAから得ることができる。そ
れは、血液、組織材料または当該技術分野で既知の他の
起源を含む多様な組織から既知の方法を使用して抽出す
ることが可能である。本発明は、ウィルスまたはいずれ
かの生物体細胞に見られる核酸配列、例えば、細菌DN
A、ウィルスRNAまたは細菌もしくはウィルス感染細
胞に見られるDNAもしくはRNAの検出に特に有用で
ある。この発明は、HIV−Iまたは他のレトロウィル
スが感染した細胞由来のDNAの検出に特に有用である
。
本発明の実施に際して使用されるプライマー類(または
それらのセット)の少なくとも1つは、特異的バインデ
ィングリガンドによって標識される。「標識した(され
る)」の語は、前記リガンドが前記プライマーに簡単に
脱離しないような状態で結合されていることを意味する
。殆どの場合に、これは直接または間接にプライマーに
対し前記リガンドが化学的に結合されていることを意味
する。これを行う方法は、結合される成分に応じて変わ
りうる。特異的パインディンクリガントとしては、ビオ
チンもしくはその誘導体、アビジン、ストレプトアビジ
ンもしくはその誘導体、レクチン、糖、蛋白質、ハプテ
ン、薬剤または免疫学的種(例えば、抗体もしくは抗原
物質)を挙げることができる。免疫学的種とは、(1)
ある物質が免疫担当宿主に提供された場合にその物質き
バインディングしうる特異的抗体の産生をもたらすか、
または(2)その使用で抗原−抗体反応に関与する種を
産生ずるような抗体を意味する。
それらのセット)の少なくとも1つは、特異的バインデ
ィングリガンドによって標識される。「標識した(され
る)」の語は、前記リガンドが前記プライマーに簡単に
脱離しないような状態で結合されていることを意味する
。殆どの場合に、これは直接または間接にプライマーに
対し前記リガンドが化学的に結合されていることを意味
する。これを行う方法は、結合される成分に応じて変わ
りうる。特異的パインディンクリガントとしては、ビオ
チンもしくはその誘導体、アビジン、ストレプトアビジ
ンもしくはその誘導体、レクチン、糖、蛋白質、ハプテ
ン、薬剤または免疫学的種(例えば、抗体もしくは抗原
物質)を挙げることができる。免疫学的種とは、(1)
ある物質が免疫担当宿主に提供された場合にその物質き
バインディングしうる特異的抗体の産生をもたらすか、
または(2)その使用で抗原−抗体反応に関与する種を
産生ずるような抗体を意味する。
これらのリガンドのすべては、プライマーに直接または
介在連結基を介してそれを結合するのに利用できる反応
性基を有する。
介在連結基を介してそれを結合するのに利用できる反応
性基を有する。
特異的バインディングリガンドは、それが対応する受容
体分子と特異的かつ優先的に複合化して特異的バインデ
ィング複合体を形成するのでそのように定義される。殆
どの場合にこの複合体は不可逆的であるが、一定の条件
下ではこの複合体形成が可逆的になる可能性がある。こ
の複合体は、複合化時に可溶性であってもまた不溶性で
あってもよいが、本発明を実施する上では、増幅複合化
生成物を複合化していない物質から分離するために、最
緯的には複合体をある時点く複合化時に不溶性でない場
合)で不溶性にしうるであろう。
体分子と特異的かつ優先的に複合化して特異的バインデ
ィング複合体を形成するのでそのように定義される。殆
どの場合にこの複合体は不可逆的であるが、一定の条件
下ではこの複合体形成が可逆的になる可能性がある。こ
の複合体は、複合化時に可溶性であってもまた不溶性で
あってもよいが、本発明を実施する上では、増幅複合化
生成物を複合化していない物質から分離するために、最
緯的には複合体をある時点く複合化時に不溶性でない場
合)で不溶性にしうるであろう。
受容体分子は、相対的に特異的バインディングリガンド
とのみ複合体を形成するものであり、目的のリガンドが
選ばれたならば自ずと明らかになるであろう。例えば、
リガンドがビオチンまたはその誘導体である場合には、
受容体分子はアビジン、ストレプトアビジンまたはそれ
らの誘導体である。その成分が抗原性物質である場合に
は、受容体は抗体である。また、リガンドが抗体である
場合には、受容体はその抗体に対する抗原性物質または
抗−抗体である。レクチンに対する受容体は糖である。
とのみ複合体を形成するものであり、目的のリガンドが
選ばれたならば自ずと明らかになるであろう。例えば、
リガンドがビオチンまたはその誘導体である場合には、
受容体分子はアビジン、ストレプトアビジンまたはそれ
らの誘導体である。その成分が抗原性物質である場合に
は、受容体は抗体である。また、リガンドが抗体である
場合には、受容体はその抗体に対する抗原性物質または
抗−抗体である。レクチンに対する受容体は糖である。
他のりガント−受容体の組み合わせは、本明細書から入
手しうる教示内容を理解する当業者であれば容易に決定
することができるであろう。多数の特異的バインディン
グリガンド−受容体の組み合わせが存在するので、本発
明はまた、各セットが他のリガンドの対応する受容体−
リガントのバインディングを妨げない相違する特異的バ
インディングリガンドを伴うプライマーを有するならば
、相違するプライマーのセットを使用することによって
複数(2種以上)の特定の核酸配列の検出に使用するこ
とができる。従って、1種の核酸配列の検出にビオチン
−アビジン複合体を使用し、一方、レクチン−糖複合体
を使用して同時に他の特定の配列を検出することができ
る。
手しうる教示内容を理解する当業者であれば容易に決定
することができるであろう。多数の特異的バインディン
グリガンド−受容体の組み合わせが存在するので、本発
明はまた、各セットが他のリガンドの対応する受容体−
リガントのバインディングを妨げない相違する特異的バ
インディングリガンドを伴うプライマーを有するならば
、相違するプライマーのセットを使用することによって
複数(2種以上)の特定の核酸配列の検出に使用するこ
とができる。従って、1種の核酸配列の検出にビオチン
−アビジン複合体を使用し、一方、レクチン−糖複合体
を使用して同時に他の特定の配列を検出することができ
る。
本発明は、2つの相補的な鎖を有する特定の核酸の検出
に利用できる。既に興味を喚起した殆どの核酸配列が、
DNAに見られるように二本鎖である。しかしながら、
mRNAのような二本鎖核酸配列も、逆転写酵素を使用
してそれを二本鎖配列に転化した後同様に検出すること
ができる。
に利用できる。既に興味を喚起した殆どの核酸配列が、
DNAに見られるように二本鎖である。しかしながら、
mRNAのような二本鎖核酸配列も、逆転写酵素を使用
してそれを二本鎖配列に転化した後同様に検出すること
ができる。
特定の核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核酸
を使用して生成される。その酸が2つの鎖を含む場合に
は、プライマー・エクステンション生成物の形成と別の
段階かまたは同時にその鎖を分離すること(いわゆる、
脱ハイブリダイゼーションまたは変性)が必要である。
を使用して生成される。その酸が2つの鎖を含む場合に
は、プライマー・エクステンション生成物の形成と別の
段階かまたは同時にその鎖を分離すること(いわゆる、
脱ハイブリダイゼーションまたは変性)が必要である。
変性は、従来技術文献に記載されているような、いずれ
かの適当な物理的、化学的または酵素的手段を使用して
行うことができる。適当な温度に加熱することが好まし
い方法である。
かの適当な物理的、化学的または酵素的手段を使用して
行うことができる。適当な温度に加熱することが好まし
い方法である。
使用目的の分離した鎖が人手可能になったならば、追加
の核酸鎖の合成はpH7〜9に緩衝化した水性溶液中で
2種以上のプライマー(少なくとも1つは前述のように
標識されている)を使用して実施することができる。好
ましくは2種のプライマーの過剰モル量が緩衝液に添加
され、具体的な量は従来技術文献に示されている。また
、適当量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP
、 dCTP。
の核酸鎖の合成はpH7〜9に緩衝化した水性溶液中で
2種以上のプライマー(少なくとも1つは前述のように
標識されている)を使用して実施することができる。好
ましくは2種のプライマーの過剰モル量が緩衝液に添加
され、具体的な量は従来技術文献に示されている。また
、適当量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP
、 dCTP。
(IGTPおよびdTTPが合成混合物に添加され、得
られた溶液は、10分未満、好ましくは1〜4分間90
〜100℃に加熱される。−この加熱後、前記溶液は、
好ましくは室温まで冷却され、次いでプライマー・エク
ステンション生成物の形成を誘導くまたは促進)するた
めの適当な試薬が導入される。この誘導試薬は、当該技
術分野で重合試薬として一般に知れている。これらの生
成物を調製するための反応は、既知の条件下(一般に、
室温からもはや重合が起こらなくなる温度までの間)で
行われる。
られた溶液は、10分未満、好ましくは1〜4分間90
〜100℃に加熱される。−この加熱後、前記溶液は、
好ましくは室温まで冷却され、次いでプライマー・エク
ステンション生成物の形成を誘導くまたは促進)するた
めの適当な試薬が導入される。この誘導試薬は、当該技
術分野で重合試薬として一般に知れている。これらの生
成物を調製するための反応は、既知の条件下(一般に、
室温からもはや重合が起こらなくなる温度までの間)で
行われる。
重合試薬は、プライマー・エクステンション生成物の合
成を達成する機能を有するいずれかの化合物または試薬
類の組み合わせであってよく、酵素(例えば、大腸菌D
NAポリメラーゼI、T4DN八ポリメラーゼ、タレノ
ウポリメラーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で既知
の他のもの)が含まれる。特に有用な酵素としては、ク
ローンまたは天然源の熱安定性酵素、例えば、各種サー
マス(Thermus) 屑紙菌株に由来するものが挙
げられる。他の重合試薬は、米国特許第4.683.2
02号明細書に記載されている。
成を達成する機能を有するいずれかの化合物または試薬
類の組み合わせであってよく、酵素(例えば、大腸菌D
NAポリメラーゼI、T4DN八ポリメラーゼ、タレノ
ウポリメラーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で既知
の他のもの)が含まれる。特に有用な酵素としては、ク
ローンまたは天然源の熱安定性酵素、例えば、各種サー
マス(Thermus) 屑紙菌株に由来するものが挙
げられる。他の重合試薬は、米国特許第4.683.2
02号明細書に記載されている。
好ましい熱安定性酵素としては、ヨーロッパ特許公開第
258017号公報(1988年3月2日付公開)に記
載されるようなサーマス・アクアティカス(Therm
us aquaticus)に由来するDNAポリメ
ラーゼが挙げられる。これらのポリメラーゼは、一般に
86.000〜90.000ダルトンの分子量を有する
。
258017号公報(1988年3月2日付公開)に記
載されるようなサーマス・アクアティカス(Therm
us aquaticus)に由来するDNAポリメ
ラーゼが挙げられる。これらのポリメラーゼは、一般に
86.000〜90.000ダルトンの分子量を有する
。
他の利用可能な酵素は、Ross iらの5yst、
Appl。
Appl。
Microbiol、 7 (2〜3)、 337〜
341ページ、1986に公表されている。数多くの利
用可能な酵素が市販されている。一般に、エクステンシ
ョン生成物の合成は、各プライマーの3′末端で開始し
、合成が停止するまで鋳型に沿って5’−3’方向に進
められる。いくつかの重合試薬(例えば、逆転写酵素)
は、鋳型に沿って3′から5′の方向に進めるであろう
。
341ページ、1986に公表されている。数多くの利
用可能な酵素が市販されている。一般に、エクステンシ
ョン生成物の合成は、各プライマーの3′末端で開始し
、合成が停止するまで鋳型に沿って5’−3’方向に進
められる。いくつかの重合試薬(例えば、逆転写酵素)
は、鋳型に沿って3′から5′の方向に進めるであろう
。
新たに合成した鎖とそれらの個々のプライマー類を含む
新たに形成したプライマー・エクステンション生成物は
、その方法の次の工程で使用される最初の標的鎖を有す
る二本鎖分子を形成する。
新たに形成したプライマー・エクステンション生成物は
、その方法の次の工程で使用される最初の標的鎖を有す
る二本鎖分子を形成する。
次に、これらの鎖は前述のような変性によって分離され
て一本鎖分子とされ、その上で前述のように新たな核酸
が合成される。この増幅手順の進行を維持するために追
加の試薬類を必要とする場合もあり、その後、これらの
エクステンション生成物の殆どは2種のプライマー(す
なわち、相補的な生成物)によってバインディングされ
た特定の核酸配列から構成されるであろう。
て一本鎖分子とされ、その上で前述のように新たな核酸
が合成される。この増幅手順の進行を維持するために追
加の試薬類を必要とする場合もあり、その後、これらの
エクステンション生成物の殆どは2種のプライマー(す
なわち、相補的な生成物)によってバインディングされ
た特定の核酸配列から構成されるであろう。
鎖の分離およびエクステンション生成物合成工程は必要
に応じて繰り返えされ、使用、例えば検出に必要な目的
量の特定の核酸を生成する。一般に、一連の工程は最低
1回、そして好ましくは最低10〜30回繰り返えされ
る。
に応じて繰り返えされ、使用、例えば検出に必要な目的
量の特定の核酸を生成する。一般に、一連の工程は最低
1回、そして好ましくは最低10〜30回繰り返えされ
る。
第一の核酸またはその混合物から1種より多くの特定の
核酸を生成する必要がある場合には、適当数のプライマ
ーセットが前記全般的な手順で使用される プライマー・エクステンション生成物少なくとも1種が
生じた後、この発明の方法におけるいずれかの時点で、
その生成物は検出可能に標識したプローブ(後述する)
とハイプツト化することができる。プローブとエクステ
ンション生成物のこの接触は、リガントと受容体の複合
体化の前または後に起こしうる。
核酸を生成する必要がある場合には、適当数のプライマ
ーセットが前記全般的な手順で使用される プライマー・エクステンション生成物少なくとも1種が
生じた後、この発明の方法におけるいずれかの時点で、
その生成物は検出可能に標識したプローブ(後述する)
とハイプツト化することができる。プローブとエクステ
ンション生成物のこの接触は、リガントと受容体の複合
体化の前または後に起こしうる。
一般に、目的の核酸配列の所定量が生じたならば、その
最後にプライマー・エクステンション生成物が分離され
、第一プライマー・エクステンション生成物くすなわち
、標識したプライマーから調製されたもの)は、検出の
ために標識されそしてそれに相補的であるオリゴヌクレ
オチドプローブと接触され、生成物を形成する。このプ
ローブは、標的核酸配列に相補的な核酸配列である。こ
のプローブは、いずれか適当な核酸の鎖長を有してよい
が、好ましくは10〜30個の核酸である。それは、特
異的バインディングリガンドとその受容体の複合体化を
妨げないいずれか適当で検出可能な物質により標識され
る(通常、5′末端)。
最後にプライマー・エクステンション生成物が分離され
、第一プライマー・エクステンション生成物くすなわち
、標識したプライマーから調製されたもの)は、検出の
ために標識されそしてそれに相補的であるオリゴヌクレ
オチドプローブと接触され、生成物を形成する。このプ
ローブは、標的核酸配列に相補的な核酸配列である。こ
のプローブは、いずれか適当な核酸の鎖長を有してよい
が、好ましくは10〜30個の核酸である。それは、特
異的バインディングリガンドとその受容体の複合体化を
妨げないいずれか適当で検出可能な物質により標識され
る(通常、5′末端)。
標識を結合させる方法およびプローブを調製する方法は
、例えば、AgrawalらのNucleic Ac1
cl虱、 14.6227〜6245ページ(1986
)右よびプライマーに特異的バインディングリガンドを
結合することに関する前記文献に記載されるような従来
技術で周知である。利用可能な標識としては、うジオア
イソトープ、電子密度の高い試薬、発色体、蛍光体、リ
ン光成分、フェリチンおよび他の磁性粒子、化学発光成
分ならびに酵素(これが好ましい)が挙げられる。利用
可能な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリホスファクーゼおよ
び当該技術分野で既知の他のものが挙げられる。このよ
うな酵素に対する基質および色素生成組成物は周知であ
る。
、例えば、AgrawalらのNucleic Ac1
cl虱、 14.6227〜6245ページ(1986
)右よびプライマーに特異的バインディングリガンドを
結合することに関する前記文献に記載されるような従来
技術で周知である。利用可能な標識としては、うジオア
イソトープ、電子密度の高い試薬、発色体、蛍光体、リ
ン光成分、フェリチンおよび他の磁性粒子、化学発光成
分ならびに酵素(これが好ましい)が挙げられる。利用
可能な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリホスファクーゼおよ
び当該技術分野で既知の他のものが挙げられる。このよ
うな酵素に対する基質および色素生成組成物は周知であ
る。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであり
、アッセイのある時点で、過酸化水素および適当な色素
生成組成物が添加され、検出可能な色素が提供される。
、アッセイのある時点で、過酸化水素および適当な色素
生成組成物が添加され、検出可能な色素が提供される。
例えば、利用可能な色素供給性試薬類としては、トリア
リールイミダゾールロイコ染料(米国特許第4.089
.747号明細書に記載されるような)またはペルオキ
シダーゼおよび過酸化水素の存在下で反応して色素を提
供する他の化合物のような、テトラメチルベンジジンお
よびその誘導体ならびにロイコ染料が挙げられる。
リールイミダゾールロイコ染料(米国特許第4.089
.747号明細書に記載されるような)またはペルオキ
シダーゼおよび過酸化水素の存在下で反応して色素を提
供する他の化合物のような、テトラメチルベンジジンお
よびその誘導体ならびにロイコ染料が挙げられる。
特に有用な色素供給性組成物は、特開平1−10045
3号(1989年4月18日付公開)公報に記載されて
いる。
3号(1989年4月18日付公開)公報に記載されて
いる。
相補的生成物におけるプローブの存在の検出は、適切な
既知の検出装置および方法を使用して遂行することがで
きる。ある種のプローブは、検出装置を使用することな
く肉眼で観察しろるであろう。
既知の検出装置および方法を使用して遂行することがで
きる。ある種のプローブは、検出装置を使用することな
く肉眼で観察しろるであろう。
本発明の方法にとって、適当な容器中で実施することも
また有用である。殆ど加工されていない容器としては試
験管、フラスコまたはビーカーが挙げられるが、より精
巧な容器は前記方法を実行するについて自動化手順を容
易にするた約に仕上げられる。例えば、方法を実施する
間中一定の温度特性を提供する目的で組み立てられたキ
ュベツトは、同時係属中の特願昭63−297168号
(1988年11月24日付出願)明細書に記載されそ
して特許請求されている。他の有用な容器は、この発明
の方法の自動化または使い捨て用として適当に加工され
うる。
また有用である。殆ど加工されていない容器としては試
験管、フラスコまたはビーカーが挙げられるが、より精
巧な容器は前記方法を実行するについて自動化手順を容
易にするた約に仕上げられる。例えば、方法を実施する
間中一定の温度特性を提供する目的で組み立てられたキ
ュベツトは、同時係属中の特願昭63−297168号
(1988年11月24日付出願)明細書に記載されそ
して特許請求されている。他の有用な容器は、この発明
の方法の自動化または使い捨て用として適当に加工され
うる。
相補的な生成物中のプローブを検出するには、相補的な
生成物の反応媒体中の他の物質から分離することがしば
しば重要になる。これは、第一プライマーの特異的バイ
ンディングリガンド(今や、第一エクステンション生成
物または相補的な生成物の一部となっている)を固体支
持体材料に結合した受容体と複合体形成を可能にするこ
とによって行われる。得られる不溶化した複合体生成物
は、濾過、遠心または他の適当な分離手段によって複合
体となっていない物質から分離することができる。
生成物の反応媒体中の他の物質から分離することがしば
しば重要になる。これは、第一プライマーの特異的バイ
ンディングリガンド(今や、第一エクステンション生成
物または相補的な生成物の一部となっている)を固体支
持体材料に結合した受容体と複合体形成を可能にするこ
とによって行われる。得られる不溶化した複合体生成物
は、濾過、遠心または他の適当な分離手段によって複合
体となっていない物質から分離することができる。
−の特に有用な分離手段としては、ポリアミド膜(例え
ば、商品名LoprodyneまたはBiodyne膜
)のような微孔質濾過膜が挙げられる。それらは塗布し
ないで使用するか、または界面活性剤もしくは分析手順
を容易にする他の物質を塗布して使用することができる
。−の態様では、膜それ自体が第一プライマー・エクス
テンション生成物を捕捉するためにそれに付着した(吸
収または共有結合によって)受容体分子を有する。
ば、商品名LoprodyneまたはBiodyne膜
)のような微孔質濾過膜が挙げられる。それらは塗布し
ないで使用するか、または界面活性剤もしくは分析手順
を容易にする他の物質を塗布して使用することができる
。−の態様では、膜それ自体が第一プライマー・エクス
テンション生成物を捕捉するためにそれに付着した(吸
収または共有結合によって)受容体分子を有する。
次に、複合体化した生成物は、使用されるプローブの種
類に応じて前記手段により検出可能である。複合体化は
相補的な生成物の検出前に起こさなければならないが、
その時期前の複合体化のタイミングは限定的でない。よ
り詳細については後述するように、複合体化はプライマ
ー・エクステンション生成物の形成前後のいずれで生じ
てもよい。
類に応じて前記手段により検出可能である。複合体化は
相補的な生成物の検出前に起こさなければならないが、
その時期前の複合体化のタイミングは限定的でない。よ
り詳細については後述するように、複合体化はプライマ
ー・エクステンション生成物の形成前後のいずれで生じ
てもよい。
受容体は、複合体化した生成物と複合体化していない物
質の分離を促進するある種の固体支持体材料に結合され
る。例えば、固体支持体としては、微量滴定板、試験管
、ビーカー、ビーズ、フィルム、メンブランフィルタ−
1濾紙、ゲル、磁性粒子またはガラス繊維が挙げられる
。それは、ガラス、セラミック、金属、天然もしくは合
成ポリマー、セルロース材料、濾過材料および当業者に
自明の他の材料を含む多様な材料で作製することができ
る。特に有用な固体支持体材料は、平均粒子サイズ(径
)0.1〜10廁を有するポリマービーズである。受容
体は、吸収および共有結合を含むいずれか適当な方法で
支持体材料に結合される。殆どの場合に、共有結合が好
ましい。これらの結合手段は当該技術分野で周知である
。
質の分離を促進するある種の固体支持体材料に結合され
る。例えば、固体支持体としては、微量滴定板、試験管
、ビーカー、ビーズ、フィルム、メンブランフィルタ−
1濾紙、ゲル、磁性粒子またはガラス繊維が挙げられる
。それは、ガラス、セラミック、金属、天然もしくは合
成ポリマー、セルロース材料、濾過材料および当業者に
自明の他の材料を含む多様な材料で作製することができ
る。特に有用な固体支持体材料は、平均粒子サイズ(径
)0.1〜10廁を有するポリマービーズである。受容
体は、吸収および共有結合を含むいずれか適当な方法で
支持体材料に結合される。殆どの場合に、共有結合が好
ましい。これらの結合手段は当該技術分野で周知である
。
好ましい態様では、固体支持体材料は、反応性受容体分
子と直接的または間接的に反応しうるペンダント反応性
基を有するポリマー材料から作製される。「直接的」な
反応とは、ペンダント反応性基が連結または介在分子を
伴うことなく受容体分子の反応性アミン基またはスルフ
ヒドリル基に直接反応することを意味する。また、受容
体または特異的バインディングリガンドのいずれか一方
または両方を、そのリガンドと受容体が相互に複合体を
形成する部位に変化が悪影響を及ぼさない限り、結合の
ための反応性部位を提供する目的で化学的に変性しても
よい。例えば、ビオチンは固体支持体と直接的に結合で
きない可能性があるが、適当な反応性基(例えば、コハ
ク酸イミドオキシカルボニル基、マレイミドオキシカル
ボニル基またはN′−ブロモアセチルヒドラジノカルボ
ニル基)を有する適当なビオチン誘導体は、そのビオチ
ン誘導体と反応するアミノ基を提供するためにカゼイン
のような蛋白質で前処理した支持体と結合することがで
きる。さらに、受容体分子は固体支持体に蛋白質、ペプ
チド、ポリペプチド、ジアミンまたはジメルカプタンで
あってもよい連結成分を介して「間接的」に結合されう
る。
子と直接的または間接的に反応しうるペンダント反応性
基を有するポリマー材料から作製される。「直接的」な
反応とは、ペンダント反応性基が連結または介在分子を
伴うことなく受容体分子の反応性アミン基またはスルフ
ヒドリル基に直接反応することを意味する。また、受容
体または特異的バインディングリガンドのいずれか一方
または両方を、そのリガンドと受容体が相互に複合体を
形成する部位に変化が悪影響を及ぼさない限り、結合の
ための反応性部位を提供する目的で化学的に変性しても
よい。例えば、ビオチンは固体支持体と直接的に結合で
きない可能性があるが、適当な反応性基(例えば、コハ
ク酸イミドオキシカルボニル基、マレイミドオキシカル
ボニル基またはN′−ブロモアセチルヒドラジノカルボ
ニル基)を有する適当なビオチン誘導体は、そのビオチ
ン誘導体と反応するアミノ基を提供するためにカゼイン
のような蛋白質で前処理した支持体と結合することがで
きる。さらに、受容体分子は固体支持体に蛋白質、ペプ
チド、ポリペプチド、ジアミンまたはジメルカプタンで
あってもよい連結成分を介して「間接的」に結合されう
る。
好ましい態様では、少なくとも第一プライマーはビオチ
ンまたはビオチン誘導体で標識されており、固体支持体
に結合される受容体はアビジンまたはアビジン誘導体で
ある。アビジン誘導体としては、ストレプトアビジン、
スクシニル化アビジンおよび単量体アビジンが挙げられ
る。ビオチン誘導体としては、ビオチン−ε−N−リジ
ン、ビオシチンヒドラジド、2−イミノビオチンのアミ
ンもしくはスルフヒドリル誘導体およびビオチニル−ε
−アミノカプロン酸ヒドラジドが挙げられる。他のビオ
チン誘導体、例えばビオチン−N−ヒドロキシコハク酸
イミドエステル、ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−
N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、スルホコハク
酸イミジル−6−(ビオチンアミド)ヘキサノエート、
N−ヒドロキシコハク酸イミドイミノビオチン、ビオチ
ンブロモアセチルヒドラジド、p−ジアゾベンゾイルビ
オチンおよび3−(N−マレイミドプロピオニル)ビオ
チンはまた、連結性蛋白質を固体支持体に適当に結合し
た後、その蛋白質に結合することができる。
ンまたはビオチン誘導体で標識されており、固体支持体
に結合される受容体はアビジンまたはアビジン誘導体で
ある。アビジン誘導体としては、ストレプトアビジン、
スクシニル化アビジンおよび単量体アビジンが挙げられ
る。ビオチン誘導体としては、ビオチン−ε−N−リジ
ン、ビオシチンヒドラジド、2−イミノビオチンのアミ
ンもしくはスルフヒドリル誘導体およびビオチニル−ε
−アミノカプロン酸ヒドラジドが挙げられる。他のビオ
チン誘導体、例えばビオチン−N−ヒドロキシコハク酸
イミドエステル、ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−
N−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、スルホコハク
酸イミジル−6−(ビオチンアミド)ヘキサノエート、
N−ヒドロキシコハク酸イミドイミノビオチン、ビオチ
ンブロモアセチルヒドラジド、p−ジアゾベンゾイルビ
オチンおよび3−(N−マレイミドプロピオニル)ビオ
チンはまた、連結性蛋白質を固体支持体に適当に結合し
た後、その蛋白質に結合することができる。
固体支持体は、受容体分子を結合するための適当な反応
性基を担持することができる。このような基は、支持体
材料の一部であるか、またはその材料の化学的処理に起
因するものであってよい。
性基を担持することができる。このような基は、支持体
材料の一部であるか、またはその材料の化学的処理に起
因するものであってよい。
利用可能な反応性基としては、カルボキシ、アミン、ス
ルフヒドリル、アルデヒド、活性化2−置換エチルスル
ホニル、ビニルスルホニル、活性ハロゲン原子、ニドロ
アリールおよび当業者に容易に明らかとなる他の基が挙
げられる。
ルフヒドリル、アルデヒド、活性化2−置換エチルスル
ホニル、ビニルスルホニル、活性ハロゲン原子、ニドロ
アリールおよび当業者に容易に明らかとなる他の基が挙
げられる。
特に有用な固体支持体材料は、1個以上の次の反応性基
(活性化2−置換エチレンスルホニル、ビニルスルホニ
ルまたは活性ハロゲン)を有する1種以上のα・β−エ
チレン系不飽和重合性モノマーに由来するポリマー粒子
である。このような粒子は、一般に、0.01amより
大きい平均粒子径を有する。好ましくは、平均粒子径は
0.1〜10tnnの範囲内である。
(活性化2−置換エチレンスルホニル、ビニルスルホニ
ルまたは活性ハロゲン)を有する1種以上のα・β−エ
チレン系不飽和重合性モノマーに由来するポリマー粒子
である。このような粒子は、一般に、0.01amより
大きい平均粒子径を有する。好ましくは、平均粒子径は
0.1〜10tnnの範囲内である。
−の態様では、第一プライマーはプライマー・エクステ
ンションの形成前に不溶化される。固体支持体材料がポ
リマー粒子である場合には、第一プライマーが粒子の水
性懸濁液に供給され、プライマーの特異的バインディン
グリガンドとその粒子に結合された受容体から形成され
る特異的バインディング複合体を介してそのプライマー
がポリマー粒子にバインディングされうる。この懸濁物
には、緩衝剤、沈殿防止剤、安定剤または乳化剤を含む
他の用可能な添加剤を含めることができる。
ンションの形成前に不溶化される。固体支持体材料がポ
リマー粒子である場合には、第一プライマーが粒子の水
性懸濁液に供給され、プライマーの特異的バインディン
グリガンドとその粒子に結合された受容体から形成され
る特異的バインディング複合体を介してそのプライマー
がポリマー粒子にバインディングされうる。この懸濁物
には、緩衝剤、沈殿防止剤、安定剤または乳化剤を含む
他の用可能な添加剤を含めることができる。
固体のパーセントは、懸濁物の重量%当たり、一般に少
なくとも0.01重量%、好ましくは0.1〜25重量
%である。他方、特異的バインディングリガンドを担持
する第一プライマーと不溶性受容体は、前記方法で使用
する前に個別に供給して混合し、不溶性受容体に対して
プライマーを複合体化することもできる。
なくとも0.01重量%、好ましくは0.1〜25重量
%である。他方、特異的バインディングリガンドを担持
する第一プライマーと不溶性受容体は、前記方法で使用
する前に個別に供給して混合し、不溶性受容体に対して
プライマーを複合体化することもできる。
この発明の別の態様では、予め方向づけされた核酸配列
の2つの相補的な鎖を有する特定の核酸配列の検出方法
は下記の工程を含んでなる:A、予め方向づけされた核
酸を含むことが予測される被験体を、特定の核酸配列鋼
と相補的であり、かつ少なくとも第一オリゴヌクレオチ
ドプライマーは特異的バインディングリガンドで標識さ
れている第一および第二オリゴヌクレオチドプライマー
と接触させ、その第一および第二プライマーとその相補
的な鎖とのハイブリッド化生成物の混合物を形成する工
程、 B、前記特異的ハイブリッド化生成物における第一およ
び第二プライマー・エクステンション生成物であって、
それらの相補体から分離した場合に前記プライマー・エ
クステンション生成物類の合成用鋳型として役立てうる
前記エクステンション生成物類の形成工程、 C1それらのプライマー・エクステンション生成物が合
成された鋳型からそれらを分離する工程、D、前記分離
したプライマー・エクステンション生成物類および被験
体を追加の第一および第二プライマーと接触させ、相補
的な生成物を形成するために特定の核酸配列の増幅をも
たらす工程、E、工程りで形成した相補的な生成物から
プライマー・エクステンション生成物類を分離する工程
、 F、工程Eで分離した第一プライマー・エクステンショ
ン生成物を、それに相補的である検出可能に標識したオ
リゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識したプ
ローブと第一プライマー・エクステンション生成物との
生成物を形成する工程、 G、工程Fで形成した相補的な生成物を第一プライマー
の特異的バインディングリガンドに対する受容体を結合
した固体支持体材料と接触させ、そうすることにより前
記特異的バインディングリガンドとそれに対する受容体
との複合体化を介して前記プローブと第一プライマーと
の相補的な生成物を不溶化する工程、ならびに H9被験体中の予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして、工程Gで形成した不溶化した相補的な生成物
を検出する工程。
の2つの相補的な鎖を有する特定の核酸配列の検出方法
は下記の工程を含んでなる:A、予め方向づけされた核
酸を含むことが予測される被験体を、特定の核酸配列鋼
と相補的であり、かつ少なくとも第一オリゴヌクレオチ
ドプライマーは特異的バインディングリガンドで標識さ
れている第一および第二オリゴヌクレオチドプライマー
と接触させ、その第一および第二プライマーとその相補
的な鎖とのハイブリッド化生成物の混合物を形成する工
程、 B、前記特異的ハイブリッド化生成物における第一およ
び第二プライマー・エクステンション生成物であって、
それらの相補体から分離した場合に前記プライマー・エ
クステンション生成物類の合成用鋳型として役立てうる
前記エクステンション生成物類の形成工程、 C1それらのプライマー・エクステンション生成物が合
成された鋳型からそれらを分離する工程、D、前記分離
したプライマー・エクステンション生成物類および被験
体を追加の第一および第二プライマーと接触させ、相補
的な生成物を形成するために特定の核酸配列の増幅をも
たらす工程、E、工程りで形成した相補的な生成物から
プライマー・エクステンション生成物類を分離する工程
、 F、工程Eで分離した第一プライマー・エクステンショ
ン生成物を、それに相補的である検出可能に標識したオ
リゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識したプ
ローブと第一プライマー・エクステンション生成物との
生成物を形成する工程、 G、工程Fで形成した相補的な生成物を第一プライマー
の特異的バインディングリガンドに対する受容体を結合
した固体支持体材料と接触させ、そうすることにより前
記特異的バインディングリガンドとそれに対する受容体
との複合体化を介して前記プローブと第一プライマーと
の相補的な生成物を不溶化する工程、ならびに H9被験体中の予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして、工程Gで形成した不溶化した相補的な生成物
を検出する工程。
本明細書に記載される方法は、感染性疾患、遺伝病また
はガンのような細胞性疾患に関連する特定の核酸配列の
検出法または特性決定法を提供するために使用すること
ができる。それはまた、法医学的調査およびDNAタイ
ピングで使用することも可能であろう。この発明の目的
とする遺伝病には、いずれかの生物体に由来するゲノム
DNA中の特殊な欠失または突然変異、例えば、錐状赤
血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミア、β−サラセ
ミアふよび当業者に容易に明らかな他の疾患が含まれる
。各種の感染症は、生物体(それが酵母、細菌またはウ
ィルスであるかどうか)を特徴付ける臨床試料中に少量
で存在する特定のDNA配列によって診断することがで
きる。限定されるものでないが、検出することができる
それらの細菌としては、サルモネラ(Salmonel
la)、クラミジア(chlamydia) 、淋菌(
Gonorrhea) 、赤痢菌(Shigella)
およびリステリア(Listeria)属に属する菌が
挙げられる。限定されるものでないが、検出回能なウィ
ルスとしては、ヘルペスウィルス、肝炎ウィルスならび
にHTLV−Iおよび旧V−Iのようなレトロウィルス
が挙げられる。原生動物の寄生体、酵母およびカビもま
た検出可能である。
はガンのような細胞性疾患に関連する特定の核酸配列の
検出法または特性決定法を提供するために使用すること
ができる。それはまた、法医学的調査およびDNAタイ
ピングで使用することも可能であろう。この発明の目的
とする遺伝病には、いずれかの生物体に由来するゲノム
DNA中の特殊な欠失または突然変異、例えば、錐状赤
血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミア、β−サラセ
ミアふよび当業者に容易に明らかな他の疾患が含まれる
。各種の感染症は、生物体(それが酵母、細菌またはウ
ィルスであるかどうか)を特徴付ける臨床試料中に少量
で存在する特定のDNA配列によって診断することがで
きる。限定されるものでないが、検出することができる
それらの細菌としては、サルモネラ(Salmonel
la)、クラミジア(chlamydia) 、淋菌(
Gonorrhea) 、赤痢菌(Shigella)
およびリステリア(Listeria)属に属する菌が
挙げられる。限定されるものでないが、検出回能なウィ
ルスとしては、ヘルペスウィルス、肝炎ウィルスならび
にHTLV−Iおよび旧V−Iのようなレトロウィルス
が挙げられる。原生動物の寄生体、酵母およびカビもま
た検出可能である。
他の検出可能な種は当業者にとって容易に明らかであろ
う。本発明は、試験試料中の旧V−Iのようなレトロウ
ィルスの存在の検出に有用である。
う。本発明は、試験試料中の旧V−Iのようなレトロウ
ィルスの存在の検出に有用である。
この発明の診断試験キットは概括的に前述した。
このキットの重要な成分は、第一および第二オリゴヌク
レオチドプライマーであって、それらの少なくとも1つ
は特異的バインディングリガンドで標識されており、こ
れらのプライマーは使用者にとって興味のある予め方向
づけされた核酸配列鎖と相補的であるプライマー類を含
む。このキットは、目的の各核酸配列に対するプライマ
ーセントを含めることも可能である。
レオチドプライマーであって、それらの少なくとも1つ
は特異的バインディングリガンドで標識されており、こ
れらのプライマーは使用者にとって興味のある予め方向
づけされた核酸配列鎖と相補的であるプライマー類を含
む。このキットは、目的の各核酸配列に対するプライマ
ーセントを含めることも可能である。
このキットはまた、特異的バインディングリガントに対
する受容体であって、固体支持体材料(前述したような
)に共有結合した受容体も含む。
する受容体であって、固体支持体材料(前述したような
)に共有結合した受容体も含む。
この受容体は、個別に包装したものとしてか、またはプ
ライマーの−の特異的バインディングリガンドと複合体
を形成させてキット中に供給することができる。
ライマーの−の特異的バインディングリガンドと複合体
を形成させてキット中に供給することができる。
さらに、このキットは前述のようなプライマー・エクス
テンションを誘導するための試薬、例えば、ポリメラー
ゼならびにデオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP
、 dCTP 、 dGTPおよびdTTPのそれぞ
れを一般に個別の容器中に含む。
テンションを誘導するための試薬、例えば、ポリメラー
ゼならびにデオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP
、 dCTP 、 dGTPおよびdTTPのそれぞ
れを一般に個別の容器中に含む。
これらのキットの成分は適当な方法で包装され、そして
場合によって、本発明を実施する上で利用されうる酵素
基質、色素供給性組成物、ピペット、キュベツト、説明
書、緩衝剤、洗液、希釈剤ならびにその他の試薬、物質
および装置を含めてもよい。これらの追加の成分は、当
該技術分野で周知である。
場合によって、本発明を実施する上で利用されうる酵素
基質、色素供給性組成物、ピペット、キュベツト、説明
書、緩衝剤、洗液、希釈剤ならびにその他の試薬、物質
および装置を含めてもよい。これらの追加の成分は、当
該技術分野で周知である。
以下の例は、この発明の実施を具体的に説明する目的で
示すが、いずれかの方法に本発明を限定することを意味
するものでない。
示すが、いずれかの方法に本発明を限定することを意味
するものでない。
これらの例では、ここで使用されるプライマーおよびプ
ローブは以下のように調製され、示した核酸配列を有し
ていた。当該技術分野で標準とされるように、個々の核
酸塩基を特定する文字によってその配列は特定した〔す
なわち、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G
)およびシトシン(c)〕。
ローブは以下のように調製され、示した核酸配列を有し
ていた。当該技術分野で標準とされるように、個々の核
酸塩基を特定する文字によってその配列は特定した〔す
なわち、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G
)およびシトシン(c)〕。
例1〜3のためのプライマー(+および−)後述するI
IIL−I DNA標的配列に対するプライマー類は、
それぞれ下記のようなヌクレオチド配列を有する: X−TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAG
八ATGCおよびX −へTへへTCCへ[へCT八へ
CCCAGT八へG八へA八へへ〔上記配列中、Xは、
国際公開第2931号公報(1989)に記載されるよ
うに調製して結合したビオチンテトラエチレングリコー
ルのスペサーアームを表す〕。
IIL−I DNA標的配列に対するプライマー類は、
それぞれ下記のようなヌクレオチド配列を有する: X−TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAG
八ATGCおよびX −へTへへTCCへ[へCT八へ
CCCAGT八へG八へA八へへ〔上記配列中、Xは、
国際公開第2931号公報(1989)に記載されるよ
うに調製して結合したビオチンテトラエチレングリコー
ルのスペサーアームを表す〕。
例1〜3のための旧L−I標的
例1〜3で検出されるDNA標的は、標準的手順を使用
して、II+V−Iゲノムの影■領域(クンバク殻)の
180個のヌクレオチドセグメントをM13ベクター誘
導体にクローン化して調製した。
して、II+V−Iゲノムの影■領域(クンバク殻)の
180個のヌクレオチドセグメントをM13ベクター誘
導体にクローン化して調製した。
例1〜3のためのプローブ
例1〜3で使用されるDNAプローブは、下記のような
ヌクレオチド配列を有していた:Y −ATCCTGG
G八TTAA八Tへ八A八TへGTへAへAATGへ〔
上記配列中、Yは、国際公開第2932号(1989)
公報の教えに従ってマール・サック(mal 5ac)
HNS八プへピルチオールリンカ−アームを使用してオ
リゴヌクレオチドに連結したワサビペルオキシダーゼを
表す〕。
ヌクレオチド配列を有していた:Y −ATCCTGG
G八TTAA八Tへ八A八TへGTへAへAATGへ〔
上記配列中、Yは、国際公開第2932号(1989)
公報の教えに従ってマール・サック(mal 5ac)
HNS八プへピルチオールリンカ−アームを使用してオ
リゴヌクレオチドに連結したワサビペルオキシダーゼを
表す〕。
例4のためのプライマー(+および−)後述するヒト白
血球抗原(HLA) DNA標的配列に対するプライマ
ー類は、それぞれ下記の核酸配列を有する: X−GTGCTGC八GGTGTへAACTTGTAC
CAGおよびX −CACGGATCCGGTAGCA
GCGGTAGAGTTG〔上記配列中、Xは前記定義
した意味を有する〕。
血球抗原(HLA) DNA標的配列に対するプライマ
ー類は、それぞれ下記の核酸配列を有する: X−GTGCTGC八GGTGTへAACTTGTAC
CAGおよびX −CACGGATCCGGTAGCA
GCGGTAGAGTTG〔上記配列中、Xは前記定義
した意味を有する〕。
から抽出したDNAである。
例4のためのプローブ
例4で使用されるDNAプローブは、下記のヌクレオチ
ド配列を有していた: Y −TTCCGCAGATTTAGAAG八T〔上記
配列中、Yは、国際公開へ2932号(1989)公報
の教えに従ってmal sac HNSAテトラエチレ
ングリコールチオールリンカ−アームを使用してオリゴ
ヌクレオチドに連結したワサビペルオキシダーゼを表す
〕。
ド配列を有していた: Y −TTCCGCAGATTTAGAAG八T〔上記
配列中、Yは、国際公開へ2932号(1989)公報
の教えに従ってmal sac HNSAテトラエチレ
ングリコールチオールリンカ−アームを使用してオリゴ
ヌクレオチドに連結したワサビペルオキシダーゼを表す
〕。
例5のためのプライマー(+および−)後述のヒトβ−
グロビンDNA標的配列に対するプライマーは、それぞ
れ下記の核酸配列を有する: X−ACAC八八CへへTGTTCACTAGCおよび
X−CA八へTTC八へCCACGTTG八へC〔上記
配列中、Xは前記に定義した意味を有する〕。
グロビンDNA標的配列に対するプライマーは、それぞ
れ下記の核酸配列を有する: X−ACAC八八CへへTGTTCACTAGCおよび
X−CA八へTTC八へCCACGTTG八へC〔上記
配列中、Xは前記に定義した意味を有する〕。
例5のためのヒトβ−グロビン標的
例5で検出されるDNA標的は、ヒト全血試料から抽出
したβ−グロビンDNAである。
したβ−グロビンDNAである。
例5のだめのプローブ
例5で使用されるDNAプローブは、下記のヌクレオチ
ド配列を有する: Y−CCTGAGGAGGAAGTCT〔上記配列中、
Yは、国際公開第2932号(1989>公報の教えに
従ってmat sac HNSAテトラエチレングリコ
ールチオールリンカ−アームを使用してオリゴヌクレオ
チドに連結したワサビペルオキシダーゼを表す〕。
ド配列を有する: Y−CCTGAGGAGGAAGTCT〔上記配列中、
Yは、国際公開第2932号(1989>公報の教えに
従ってmat sac HNSAテトラエチレングリコ
ールチオールリンカ−アームを使用してオリゴヌクレオ
チドに連結したワサビペルオキシダーゼを表す〕。
以下の各側で使用されるロイコ染料組成物は下記の成分
を有していた: 2− <4−ヒドロキシ−3−メトキンフェニル)−4
・5−ビス(4−メトキシフェニル)イミダゾールロイ
コ染料(0,008重量%)、4′−ヒドロキシアセト
アニリド(5ミリモル濃度)、 ポリ (ビニルピロリドン)(1重量%)、ジエチレン
トリアミン五酢酸(10マイクロモル濃度)、 過酸化水素(10ミリモル濃度)および第一リン酸ナト
リウム(10ミリモル濃度)。
を有していた: 2− <4−ヒドロキシ−3−メトキンフェニル)−4
・5−ビス(4−メトキシフェニル)イミダゾールロイ
コ染料(0,008重量%)、4′−ヒドロキシアセト
アニリド(5ミリモル濃度)、 ポリ (ビニルピロリドン)(1重量%)、ジエチレン
トリアミン五酢酸(10マイクロモル濃度)、 過酸化水素(10ミリモル濃度)および第一リン酸ナト
リウム(10ミリモル濃度)。
例1 旧11に由来するDNAの検出
この例は、HIv−ID間八に特有な特定の核酸配列の
試料中での存在の検出について本発明の実施を具体的に
示す。
試料中での存在の検出について本発明の実施を具体的に
示す。
下記反応混合物(Look)を調製したニブライマー(
+および−)(1マイクロモル濃度)、HIV−I D
NA(M13 りD−ン)由来の標的核酸配列(10−
”モル濃度〉、 塩化カリウム(0,05モル濃度)、 トリス (ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸緩衝剤
(pH8= 0.0fモル濃度)、デオキシヌクレオシ
ド三リン酸類(clNTP、各1.5ミ!1モル濃度、
合計6ミリモル濃度)、市販のサーマス・アクアティカ
ス(Thermusaquaticus)から単離した
DNAポリメラーゼ(2,5単位、1単位は74℃30
分間でプライマー・エクステンション生成物中へのdN
TP 10ナノモルの取り込みに相当する)、 塩化マグネシウム(10ミリモル濃度)、〈45) ゼラチン(100μg/−)、 ポリ〔スチレン−ml−m、p−(2−10ロエチルス
ルホニルメチル)スチレン:] (90:10、モル
モノマー比)ビーズ(平均粒子径2.61Rn)に共有
結合したアビジン(固形分0.12%または0.24%
)。
+および−)(1マイクロモル濃度)、HIV−I D
NA(M13 りD−ン)由来の標的核酸配列(10−
”モル濃度〉、 塩化カリウム(0,05モル濃度)、 トリス (ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸緩衝剤
(pH8= 0.0fモル濃度)、デオキシヌクレオシ
ド三リン酸類(clNTP、各1.5ミ!1モル濃度、
合計6ミリモル濃度)、市販のサーマス・アクアティカ
ス(Thermusaquaticus)から単離した
DNAポリメラーゼ(2,5単位、1単位は74℃30
分間でプライマー・エクステンション生成物中へのdN
TP 10ナノモルの取り込みに相当する)、 塩化マグネシウム(10ミリモル濃度)、〈45) ゼラチン(100μg/−)、 ポリ〔スチレン−ml−m、p−(2−10ロエチルス
ルホニルメチル)スチレン:] (90:10、モル
モノマー比)ビーズ(平均粒子径2.61Rn)に共有
結合したアビジン(固形分0.12%または0.24%
)。
2種の対照混合物もまた、調製した:対照Aは、前記ア
ビジ・ン・ビーズ試薬を除く外は前記と同じ試薬を有し
ており、対照Bは、前記DNAポリメラーゼを除く外は
前記と同じ試薬を有する。
ビジ・ン・ビーズ試薬を除く外は前記と同じ試薬を有し
ており、対照Bは、前記DNAポリメラーゼを除く外は
前記と同じ試薬を有する。
各混合物をポリプロピレン製微量遠沈管に入れ、プライ
マー・エクステンション生成物を調製し、次いで下記に
従い30回連続的な熱サイクルを使用して増幅を促進し
たニ ア0℃から94℃まで昇温 1分 94℃ 0.5分(変性)94℃から
50℃まで降温 1.25分50℃
0.5分(ハイブリッド化)50℃から70℃まで昇温
0.75分70℃ 1分(エクステ
ンション)30回の熱ザイクルを経て増幅した後、各遠
沈管から各混合物のアリコート5111を採取し、加熱
変性(95℃で5分)し、次いでワサビペルオキシダー
ゼ(1ピコモル)に接合したオリゴヌクレオチドプロー
ブ(前述)の存在下でハイブリッド化条件(42℃30
分)にさらした。
マー・エクステンション生成物を調製し、次いで下記に
従い30回連続的な熱サイクルを使用して増幅を促進し
たニ ア0℃から94℃まで昇温 1分 94℃ 0.5分(変性)94℃から
50℃まで降温 1.25分50℃
0.5分(ハイブリッド化)50℃から70℃まで昇温
0.75分70℃ 1分(エクステ
ンション)30回の熱ザイクルを経て増幅した後、各遠
沈管から各混合物のアリコート5111を採取し、加熱
変性(95℃で5分)し、次いでワサビペルオキシダー
ゼ(1ピコモル)に接合したオリゴヌクレオチドプロー
ブ(前述)の存在下でハイブリッド化条件(42℃30
分)にさらした。
米国特許出願第98.248号(前述)に記載されるよ
うな使い捨て試験装置中に設置した微孔質膜を、デンハ
ート(Denhardt)液〔水100艷中、シグマ・
ケミカル社(Sigma Chemical Co、)
由来のフィコール1g1ポリ (ビニルピロリドン)1
gおよびウシ血清アルブミンIg)ならびに5SPB液
(水11中、塩化ナトリウム43.5 g 、 リン
酸ナトリウム6.9gおよびエチレンジアミン四酢酸1
.85 g・pH7,4に調節)と室温で10分間イン
キニベーションし次いで乾燥して前処理した。デンハー
ト液と5SPB液とも従来技術文献(Maniatis
、 Fr1tschおよびSambrook、 Mo
1ecular Cloning、 A Labor
atoryManual、 Co1d Harbor
Spring Laboratory、 1982)で
既知である。
うな使い捨て試験装置中に設置した微孔質膜を、デンハ
ート(Denhardt)液〔水100艷中、シグマ・
ケミカル社(Sigma Chemical Co、)
由来のフィコール1g1ポリ (ビニルピロリドン)1
gおよびウシ血清アルブミンIg)ならびに5SPB液
(水11中、塩化ナトリウム43.5 g 、 リン
酸ナトリウム6.9gおよびエチレンジアミン四酢酸1
.85 g・pH7,4に調節)と室温で10分間イン
キニベーションし次いで乾燥して前処理した。デンハー
ト液と5SPB液とも従来技術文献(Maniatis
、 Fr1tschおよびSambrook、 Mo
1ecular Cloning、 A Labor
atoryManual、 Co1d Harbor
Spring Laboratory、 1982)で
既知である。
前記各試験試料と対照混合物をこの使い捨て装置に加え
、次いで55℃に加熱した5SPB液(水1β中、塩化
ナトリウム1.75 g 、 リン酸ナトリウム0、
276 gおよびエチレントリアミン五酢酸0.074
g=pH7,4に調節)50μZとTriton(商品
名)X−100非イオン界面活性剤0.02(重量)%
からなる洗液で5度洗浄した。
、次いで55℃に加熱した5SPB液(水1β中、塩化
ナトリウム1.75 g 、 リン酸ナトリウム0、
276 gおよびエチレントリアミン五酢酸0.074
g=pH7,4に調節)50μZとTriton(商品
名)X−100非イオン界面活性剤0.02(重量)%
からなる洗液で5度洗浄した。
前記ロイコ染料組成物(100μりを添加し、各膜上の
色を5分間かけて発色させ、次いで視覚的に読み取って
O〜+5に段階づけした(Oは無着色を表しており、+
5は高濃度着色を表す)。
色を5分間かけて発色させ、次いで視覚的に読み取って
O〜+5に段階づけした(Oは無着色を表しており、+
5は高濃度着色を表す)。
結果を下記の表に示すが、この結果は、本発明の方法が
目的の旧V−I DNA核酸配列を検出する上で有用で
あったことを例証する。すべての結果は、対照から検出
される着色と対比した。結果は、分光光度計から読み取
った濃度で置き換えた。
目的の旧V−I DNA核酸配列を検出する上で有用で
あったことを例証する。すべての結果は、対照から検出
される着色と対比した。結果は、分光光度計から読み取
った濃度で置き換えた。
試薬混合物 着色の読み対照AO
対照B O本発明(
0,12%ビーズ−アビジン) +1.5本発明(
0,24%ビーズ−アビジン) +2さ+3これらの例
では、増幅サイクルを実施した後に不溶化を生じさせた
外は例1の方法に従った。例2では、例1と同様にポリ
マー粒子にアビジンを付着するように供給し、例3では
使い捨て試験装置中のナイロン微孔質膜にアビジンを付
着するように供給した。対照混合物は、例1と同様に調
製して試験した。
0,12%ビーズ−アビジン) +1.5本発明(
0,24%ビーズ−アビジン) +2さ+3これらの例
では、増幅サイクルを実施した後に不溶化を生じさせた
外は例1の方法に従った。例2では、例1と同様にポリ
マー粒子にアビジンを付着するように供給し、例3では
使い捨て試験装置中のナイロン微孔質膜にアビジンを付
着するように供給した。対照混合物は、例1と同様に調
製して試験した。
対照は、バックグランドと全く相違しない可視性の着色
を提供したが、この発明の方法は、例2に関して+4お
よび例3に関して+5の着色の読みを提供した。
を提供したが、この発明の方法は、例2に関して+4お
よび例3に関して+5の着色の読みを提供した。
例4 HLA DNA核酸配列の検出この例は、ヒト
白血球抗原(HLA) DNAに特有な特定の核酸配列
の試料中での存在の検出に対する本発明の実施を示す。
白血球抗原(HLA) DNAに特有な特定の核酸配列
の試料中での存在の検出に対する本発明の実施を示す。
下記反応混合物(100μI)を調製したニブライマー
(十および−)(0,2マイクロモル濃度)、 全血由来の標的核酸配列(抽出物20μm/反応混合物
100#Z)、 塩化カリウム(0,05モル濃度)、 トリス(ヒドロキシメチル)アミツメクン塩酸緩衝剤(
pH8,0,01モル濃度)、デオキシヌクレオンド三
リン酸(dNTP、各0.175ミリモル濃度、合計0
.7 ミIJモル濃度)、サーマス・アクアティカスか
ら単離したDNAポリメラーゼ(2,0単位、1単位は
74℃30分でプライマー・エクステンション生成物に
取り込まれるdNTP 10ナノモルに相当する)、塩
化マグネシウム(2,5ミリモル濃度)、ゼラチン(1
00パ/ml)、 ポリ 〔スチレン−−]−m−p−(2−クロロエチル
スルホニルメチル)スチレン] (95,5: 4.
5、モルモノマー比)ビーズ(平均粒子径2.6 Ml
)に共有結合したアビジン(固形分0,24%)。
(十および−)(0,2マイクロモル濃度)、 全血由来の標的核酸配列(抽出物20μm/反応混合物
100#Z)、 塩化カリウム(0,05モル濃度)、 トリス(ヒドロキシメチル)アミツメクン塩酸緩衝剤(
pH8,0,01モル濃度)、デオキシヌクレオンド三
リン酸(dNTP、各0.175ミリモル濃度、合計0
.7 ミIJモル濃度)、サーマス・アクアティカスか
ら単離したDNAポリメラーゼ(2,0単位、1単位は
74℃30分でプライマー・エクステンション生成物に
取り込まれるdNTP 10ナノモルに相当する)、塩
化マグネシウム(2,5ミリモル濃度)、ゼラチン(1
00パ/ml)、 ポリ 〔スチレン−−]−m−p−(2−クロロエチル
スルホニルメチル)スチレン] (95,5: 4.
5、モルモノマー比)ビーズ(平均粒子径2.6 Ml
)に共有結合したアビジン(固形分0,24%)。
2種の対照混合物もまた調製した:
対照Aはアビジン・ビーズ試薬を除く外は前記と同じ試
薬を有しており、対照Bは標的核酸配列を除く外は前記
と同じ試薬を有する。
薬を有しており、対照Bは標的核酸配列を除く外は前記
と同じ試薬を有する。
各混合物を、ポリプロピレン製微量遠沈管に入れ、プラ
イマー・エクステンション生成物を形成し、次いで下記
のような連続的熱サイクルを30回使用して増幅を促進
したニ ア0℃から95℃への昇温 95℃ 0.5分(変性)95℃から
55℃への降温 55℃ 0.5分(ハイブリッド化)
55℃から70℃への昇温 70℃ 1分(エクステント)30回
の熱サイクルを通して増幅した後、遠沈管から各混合物
のアリコー)5mを採取し、加熱度性(95℃5分)シ
、次いでワサビペルオキシダーゼ(1ピコモル)に接合
したオリゴヌクレオチドプローブ(前述)の存在下ハイ
ブリッド化条件(42℃5分)にさらした。
イマー・エクステンション生成物を形成し、次いで下記
のような連続的熱サイクルを30回使用して増幅を促進
したニ ア0℃から95℃への昇温 95℃ 0.5分(変性)95℃から
55℃への降温 55℃ 0.5分(ハイブリッド化)
55℃から70℃への昇温 70℃ 1分(エクステント)30回
の熱サイクルを通して増幅した後、遠沈管から各混合物
のアリコー)5mを採取し、加熱度性(95℃5分)シ
、次いでワサビペルオキシダーゼ(1ピコモル)に接合
したオリゴヌクレオチドプローブ(前述)の存在下ハイ
ブリッド化条件(42℃5分)にさらした。
使い捨て試験装置中に設置した前記微孔質膜に各試験試
料と対照混合物を添加し、次いで55℃に加熱した5S
PE液(1j2水中塩化ナトリウム8.7g、リン酸ナ
トリウム1.4g、エチレンジアミン四酢酸0.37g
、pH7,4に調節)50μlとドデシル硫酸ナトリ
ウム0.5(重量)%からなる洗液で5度洗浄した。前
記ロイコ染料組成物(100μl)を添加し、各膜上の
色を2分間発色させ、次いで視覚的に読み取ってO〜+
5に段階づけした(Oは無着色を表しており、+5は高
濃度着色を表す)。
料と対照混合物を添加し、次いで55℃に加熱した5S
PE液(1j2水中塩化ナトリウム8.7g、リン酸ナ
トリウム1.4g、エチレンジアミン四酢酸0.37g
、pH7,4に調節)50μlとドデシル硫酸ナトリ
ウム0.5(重量)%からなる洗液で5度洗浄した。前
記ロイコ染料組成物(100μl)を添加し、各膜上の
色を2分間発色させ、次いで視覚的に読み取ってO〜+
5に段階づけした(Oは無着色を表しており、+5は高
濃度着色を表す)。
結果を下記表に示すが、この結果は、本発明の方法が目
的のIILA DNA核酸配列を検出する上で有用であ
ったことを例証する。すべての結果は、対照から検出さ
れる着色と対比した。
的のIILA DNA核酸配列を検出する上で有用であ
ったことを例証する。すべての結果は、対照から検出さ
れる着色と対比した。
試薬混合物 着色の読み対照A
O対照BO 本発明(0,24%ビーズ−アビジン”) +15
例5 増幅後に供給される不溶性試薬による1比八DN
Aの検出 この例は、増幅サイクルを実施した後であって、使い捨
て試験装置にプライマー・エクステンションを添加する
前に不溶化を起こさせる外は、例4の方法に従った。例
4と同様にポリマー粒子に付着されるようにアビジンを
供給した。対照混合物は例4と同様に調製して試験した
。
O対照BO 本発明(0,24%ビーズ−アビジン”) +15
例5 増幅後に供給される不溶性試薬による1比八DN
Aの検出 この例は、増幅サイクルを実施した後であって、使い捨
て試験装置にプライマー・エクステンションを添加する
前に不溶化を起こさせる外は、例4の方法に従った。例
4と同様にポリマー粒子に付着されるようにアビジンを
供給した。対照混合物は例4と同様に調製して試験した
。
対照はバックグランドと全く相違しない可視性の着色を
提供したが、この発明の方法は+25の着色の読みを提
供した。
提供したが、この発明の方法は+25の着色の読みを提
供した。
例6 ヒトβ−グロビンDNA核酸配列の検出この例は
、ヒトβ−グロビンDNAに特有な特定の核酸配列の試
料中での存在の検出に対する本発明の実施を示す。
、ヒトβ−グロビンDNAに特有な特定の核酸配列の試
料中での存在の検出に対する本発明の実施を示す。
下記反応混合物(100i)を調製した;プライマー(
+および−)(0,2マイクロモル濃度)、 全血由来の標的核酸配列(抽出物20pl/反応混合物
100.Z)、 塩化カリウム(0,05モル濃度)、 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸緩衝剤(
pi(8,0,旧モル濃度)、デオキシヌクレオンド三
リン酸(dNTP、各0.175ミリモル濃度、合計0
.7ミ!Jモル濃度)、サーマス・アクアティカスから
単離したDNAポリメラーゼ(2,0単位、1単位は7
4℃30分でプライマー・エクステンション生成物に取
り込まれるdNTP 10ナノモルに相当する)、塩化
マグネシウム(2,5ミ’Jモル濃度)、ゼラチン(1
00■/ml)、 ポリ〔スチレンー−1−m、p−(2−り四ロエチルス
ルホニルメチル)スチレン:] (95,5: 4.
5、モルモノマー比)ビーズ(平均粒子径2.6Nl)
に共有結合したアビジン(固形分0.24%)。
+および−)(0,2マイクロモル濃度)、 全血由来の標的核酸配列(抽出物20pl/反応混合物
100.Z)、 塩化カリウム(0,05モル濃度)、 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸緩衝剤(
pi(8,0,旧モル濃度)、デオキシヌクレオンド三
リン酸(dNTP、各0.175ミリモル濃度、合計0
.7ミ!Jモル濃度)、サーマス・アクアティカスから
単離したDNAポリメラーゼ(2,0単位、1単位は7
4℃30分でプライマー・エクステンション生成物に取
り込まれるdNTP 10ナノモルに相当する)、塩化
マグネシウム(2,5ミ’Jモル濃度)、ゼラチン(1
00■/ml)、 ポリ〔スチレンー−1−m、p−(2−り四ロエチルス
ルホニルメチル)スチレン:] (95,5: 4.
5、モルモノマー比)ビーズ(平均粒子径2.6Nl)
に共有結合したアビジン(固形分0.24%)。
2種の対照混合物もまた調製した:
対照Δはアビジン・ビーズ試薬を除く外は前記と同じ試
薬を有しており、対照Bは標的核酸配列を除く外は前記
と同じ試薬を有する。
薬を有しており、対照Bは標的核酸配列を除く外は前記
と同じ試薬を有する。
各混合物を、ポリプロピレン製微量遠沈管に入れ、プラ
イマー・エクステンション生成物を形成し、次いで下記
のような連続的熱サイクルを30回使用して増幅を促進
した。
イマー・エクステンション生成物を形成し、次いで下記
のような連続的熱サイクルを30回使用して増幅を促進
した。
70℃から95℃への昇温
95℃ 0.5分(変性)95℃から
55℃への降温 55℃ 0.5分(ハイブリッド化)
55℃から70℃への昇温 70℃ 1分(エクステント)30回
の熱サイクルを通して増幅した後、遠沈管から各混合物
のアリコート5μlを採取し、加熱変性(95℃5分)
し、次いでワサビペルオキシダーゼ(1ピコモル)に接
合したオリゴヌクレオチドプローブ(前述)の存在下ハ
イブリッド化条件(42℃5分)にさらした。
55℃への降温 55℃ 0.5分(ハイブリッド化)
55℃から70℃への昇温 70℃ 1分(エクステント)30回
の熱サイクルを通して増幅した後、遠沈管から各混合物
のアリコート5μlを採取し、加熱変性(95℃5分)
し、次いでワサビペルオキシダーゼ(1ピコモル)に接
合したオリゴヌクレオチドプローブ(前述)の存在下ハ
イブリッド化条件(42℃5分)にさらした。
使い捨て試験装置中に設置した前記微孔質膜に各試験試
料と対照混合物を添加し、次いで室温下5SPE液(1
β水中塩化す) IJウム8.7g、!lン酸ナナトリ
ウム138 g、エチレントリアミン五酢酸0.37g
、pH7,4に調節>50p1とドデシル硫酸ナトリ
ウム0.5(重量)%からなる洗液で5度洗浄した。前
記ロイコ染料組成物(100u)を添加し、各膜上の色
を2分間発色させ、次いで視覚的に読み取ってO〜+5
に段階づけした(0は無着色を表しており、+5は高濃
度着色を表す)。
料と対照混合物を添加し、次いで室温下5SPE液(1
β水中塩化す) IJウム8.7g、!lン酸ナナトリ
ウム138 g、エチレントリアミン五酢酸0.37g
、pH7,4に調節>50p1とドデシル硫酸ナトリ
ウム0.5(重量)%からなる洗液で5度洗浄した。前
記ロイコ染料組成物(100u)を添加し、各膜上の色
を2分間発色させ、次いで視覚的に読み取ってO〜+5
に段階づけした(0は無着色を表しており、+5は高濃
度着色を表す)。
結果を下記表に示すが、この結果は、本発明の方法が目
的のヒトβ−グロビンDNA核酸配列を検出する上で有
用であったことを例証する。すべての結果は、対照から
検出される着色と対比した。
的のヒトβ−グロビンDNA核酸配列を検出する上で有
用であったことを例証する。すべての結果は、対照から
検出される着色と対比した。
溝
試薬混合物 着色の読み対照AO
対照B +0.5本発
明(0,24%ビーズ−アビジン)+2.5to+3例
7 増幅後に供給される不溶性試薬によるヒトこの例は
、増幅サイクルを実施した後であって、使い捨て試験装
置にプライマー・エクステンションを添加する前に不溶
化を起こさせる外は、例6の方法に従った。例6と同様
にポリマー粒子に付着されるようにアビジンを供給した
。対照混合物は例6と同様に調製して試験した。
明(0,24%ビーズ−アビジン)+2.5to+3例
7 増幅後に供給される不溶性試薬によるヒトこの例は
、増幅サイクルを実施した後であって、使い捨て試験装
置にプライマー・エクステンションを添加する前に不溶
化を起こさせる外は、例6の方法に従った。例6と同様
にポリマー粒子に付着されるようにアビジンを供給した
。対照混合物は例6と同様に調製して試験した。
対照はバックグランドと全く相違しない可視性の着色を
示したが、この発明の方法は、+3.5〜+4の着色の
読みを示した。
示したが、この発明の方法は、+3.5〜+4の着色の
読みを示した。
本発明は、一般に非常に少量で細胞または生物体に存在
する遺伝物質を迅速に検出するための手段を提供する。
する遺伝物質を迅速に検出するための手段を提供する。
さらに、本発明の方法は市販の自動化検出方法に適用可
能である。
能である。
これらの利点は、「捕捉」または固定化の目的で標識し
たオリゴヌクレオチドプライマー類を使用することによ
って達成される。プライマー類の1種上の標識は、ある
種の固体支持体に結合されるその受容体と特異的に複合
体を形成する特異的バインディングリガンドである。次
に、検出は、本発明の方法で形成されるプライマー・エ
クステンション生成物に相補的な検出可能に標識したプ
ローブを使用して行われる。本明細書で開示される捕捉
手段は、すべての他の物質から検出のための増幅したエ
クステンション生成物を分離するのに有効かつ効率のよ
い手段を提供するであろう。
たオリゴヌクレオチドプライマー類を使用することによ
って達成される。プライマー類の1種上の標識は、ある
種の固体支持体に結合されるその受容体と特異的に複合
体を形成する特異的バインディングリガンドである。次
に、検出は、本発明の方法で形成されるプライマー・エ
クステンション生成物に相補的な検出可能に標識したプ
ローブを使用して行われる。本明細書で開示される捕捉
手段は、すべての他の物質から検出のための増幅したエ
クステンション生成物を分離するのに有効かつ効率のよ
い手段を提供するであろう。
1種以上の特定の核酸配列も、より詳細は下記のごとく
本発明を使用して検出可能である。
本発明を使用して検出可能である。
−の態様としては、特異的バインディングリガンドと受
容体の複合体化が行われた後にプライマー・エクステン
ション生成物が形成される。この態様では、適当なオリ
ゴヌクレオチドプライマーが結合されたポリマー粒子の
水性懸濁物を利用する。このプライマーは、特異的バイ
ンディングリガンドとその受容体の特異的バインディン
グ複合体を介して粒子に結合される。
容体の複合体化が行われた後にプライマー・エクステン
ション生成物が形成される。この態様では、適当なオリ
ゴヌクレオチドプライマーが結合されたポリマー粒子の
水性懸濁物を利用する。このプライマーは、特異的バイ
ンディングリガンドとその受容体の特異的バインディン
グ複合体を介して粒子に結合される。
もう一つの態様では、前記エクステンション生酸物が形
成されそして増幅が実施された後に捕捉が行われる。
成されそして増幅が実施された後に捕捉が行われる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、A、予め方向づけされた核酸を含むことが予測され
る被験体を、特定の核酸配列鎖に相補的な第一および第
二オリゴヌクレオチドプライマーであって少なくともそ
の第一プライマーを特異的バインディングリガンドで標
識しているプライマー類と接触させ、その第一および第
二プライマーとその相補的な核酸鎖のハイブリッド化生
成物の混合物を形成する工程、 B、前記ハイブリッド化生成物における第一および第二
プライマー・エクステンション生成物であって、それら
の相補体(complement)から分離した場合に
前記プライマー・エクステンション生成物類の合成用鋳
型として役立てることができる前記エクステンション生
成物類を形成する工程、C、プライマー・エクステンシ
ョン生成物類が合成された鋳型からそれらを分離する工
程、D、前記分離したプライマー・エクステンション生
成物類および被験体を追加の第一および第二プライマー
と接触させ、相補的な生成物を形成するために特定の核
酸配列の増幅をもたらす工程、E、工程Dで形成した相
補的な生成物からプライマー・エクステンション生成物
類を分離する工程、 F、工程Eで分離した第一プライマー・エクステンショ
ン生成物を、それに相補的である検出可能に標識したオ
リゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識したプ
ローブと第一プライマー・エクステンション生成物との
生成物を形成する工程、ならびに G、被験体中に予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして工程Fで形成した相補的な生成物の検出工程、
を含んでなり、さらに、検出工程G前に、第一プライマ
ーの特異的バインディングリガンドが固体支持体材料に
結合した受容体と複合体を形成する工程を提供すること
を特徴とする予め方向づけされた核酸の2つの相補的な
鎖を有する特定の核酸配列の検出方法。 2、A、予め方向づけされた核酸を含むことが予測され
る被験体を、 (1)前記特定の核酸配列鎖に相補的な第一および第二
オリゴヌクレオチドプライマーであって、少なくともそ
の第一プライマーは特異的バインディングリガンドで標
識しているプライマー類、ならびに (2)その特異的バインディングリガンドを結合するた
めに受容体を有する固体支持体材料と接触させ、 少なくとも第一プライマーが前記特異的リガントと受容
体の複合体を介して前記支持体材料に結合される第一お
よび第二プライマーとその相補的な鎖とのハイブリッド
化生成物の混合物を形成する工程、 B、前記ハイブリッド化生成物における第一および第二
プライマー・エクステンション生成物であって、それら
の相補体から分離した場合に前記プライマー・エクステ
ンション生成物類の合成用鋳型として役立てうる前記エ
クステンション生成物類を形成する工程、 C、第一プライマー・エクステンション生成物を不溶性
とし前記プライマー・エクステンション生成物類を合成
した鋳型からそれらを分離する工程、 D、この分離したプライマー・エクステンション生成物
類および被験体を追加の第一および第二プライマーと接
触させ、相補的な生成物を形成するために被験体核酸配
列の増幅をもたらす工程、E、工程Dで形成した相補的
な生成物からプライマー・エクステンション生成物類を
分離する工程、 F、工程Eで分離した不溶性第一プライマー・エクステ
ンション生成物を、それに相補的である検出可能に標識
したオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、その標識
したプローブと不溶性第一プライマー・エクステンショ
ン生成物との生成物を形成する工程、ならびに G、被験体中の予め方向づけされた核酸の存在を示すも
のとして工程Fで形成した不溶性の相補的な生成物を検
出する工程、を含んでなる予め方向づけされた核酸の2
つの相補的な鎖を有する特定の核酸配列の検出方法。 3、オリゴヌクレオチドプライマーを結合したポリマー
粒子の水性懸濁物であって、特異的バインディングリガ
ンドとその受容体との特異的バインディング複合体を介
してその粒子に前記プライマーが結合されている懸濁物
。 4、(a)予め方向づけされた核酸配列の個々の鎖に相
補的な第一および第二オリゴヌクレオチドプライマーで
あって、そのプライマー類の少なくとも1つは特異的バ
インディングリガンドによって標識されている前記プラ
イマー類、 (b)固体支持体材料に結合し、そしてキット中で独立
した包装としてかまたは前記プライマー類の一つの特異
的バインディングリガンドと複合化するように供給され
た特異的バインディングリガンドに対する受容体、 (c)プライマー・エクステンションのための重合試薬
、ならびに (d)デオキシリボヌクレオシド三リン酸 dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、を含ん
でなる診断試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27377988A | 1988-11-21 | 1988-11-21 | |
US273779 | 1988-11-21 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02299600A true JPH02299600A (ja) | 1990-12-11 |
Family
ID=23045356
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1299877A Pending JPH02299600A (ja) | 1988-11-21 | 1989-11-20 | 固相捕捉手段を使用する核酸の検出方法および診断キット |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0370694A3 (ja) |
JP (1) | JPH02299600A (ja) |
KR (1) | KR900008278A (ja) |
CA (1) | CA2002076A1 (ja) |
DK (1) | DK582189A (ja) |
FI (1) | FI895539A0 (ja) |
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