JPH0398586A - プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は予定された核酸の増幅のための方法に関する。

特に、特定のプライマーとポリメラーゼ連鎖反応を使用
する前記のような核酸の増幅および検出方法に向けられ
る。本発明を使用してゲノム、細菌またはウイルスＤＮ
ＡもしくはＲＮＡに関連する核酸を検出することができ
る。

〔従来の技術〕

研究者が試験試料中に非常に少量存在する各種疾患、生
物体または遺伝子の特徴の検出に対するその価値を見い
出すにつれ、核酸ブロープ法は近年急速に進歩した。ブ
ローブの使用は、相補性の概念に基づく。ＤＮＡでは、
２本の鎖が相補的ヌクレオチド間で水素結合によって相
互に結合している（ヌクレオチド対としても知られてい
る）。

このＤＮＡ複合物は通常安定であるが、水素結合を破壊
する条件によってそれらの鎖は分離（変性）することが
できる。解離された一本鎖は相補的配列のヌクレオチド
類を有する他の鎖と再結合しうるだけであろう。このハ
イブリッド形威工程は溶液中または固体支持体上で起こ
りうる。ＲＮＡは一般に一本鎖である。それはまた、相
補的配列のヌクレオチドを有する他の鎖またはその一部
とハイブリッドしうる。

標的生物体または細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの標的核酸
配列は、全体的な鎖がほんの小さな部分である可能性が
あり、殆どの既知標識ＤＮＡブロープを使用してもその
存在を検出することが非常に困難である。ブローブの感
度や核酸合戒の改良を初めとする多くの研究はこの課題
を解決するために行われてきた。

当該技術分野における有意な進展は、米国特許第４，６
８３．１９５号および同４．６８３．２０２号明細書に
記載されている。広範囲にわたり詳細に論ずることなく
、これらの特許はプライマーが重合剤（例えば、ポリメ
ラーゼ）や４種のヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸
の鋳型にハイブリッド形威し、次いでこれらのプライマ
ー類からエクステンション産物が生戒される増幅方法を
記載する。これらの産物は変性され、次いでそれらのそ
の後の検出を容易にするため存在する核酸の数および量
を増幅する周期的な反応の鋳型として使用される。この
増幅方法は、少量の標的核酸配列から多量の検出可能な
物質を生戒するのにかなり長時間かけて周期的に実施す
ることができる。

前述の増幅方法は増幅せしめる標的核酸に対して２つの
プライマーを使用する。ポリメラーゼ連鎖反応に基づく
効率的な診断アッセイのデザインは、プライマー類を標
的核酸にハイブリッド形威させる効率によって大きく左
右される。増幅に対する最通な条件下では、増幅せしめ
られる核酸配列が、少なくともエクステンシゴンが起こ
る標的配列の３′末端近傍においてプライマーに完全に
相補的である。従って、効率的な増幅にとって鎖当たり
ただ１種のプライマーが必要であるにすぎない。標的配
列が少なくとも３′末端において完全には知られていな
い場合、完全に相補的である少なくとも１種のプライマ
ーを有するためにはすペての可能なコドンのバリエーシ
ョンを有するプライマーコレクションが使用されるであ
ろう。

望ましい増幅法を完或するのに役く立っプライマーコレ
クシゴン類が使用されるかも知れないが、それは経費が
かかるため実際的でなくそして多くの例では効率が悪い
かまたは効果がないがも知れない。計画性のないプライ
マーコレクションの調製は経済的でなく、競合的な非エ
クステンションプライマー類の使用をもたらす。さらに
、標的核酸配列の大部分は未定であるので必要なプライ
マーコレクションは非常に拡大される。

ウイルスゲノム類、特にＲＮＡウィルスおよびレトロウ
イルスのゲノム類は頻繁な塩基交換、付加、重複および
欠失を伴う。これらのウィルスの可変性が複製に関与す
るポリメラーゼのブルーフリーディング機能の低い再現
性と欠如のせいだとされてきた（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ
ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１−，
　４０９〜４３３ページ、１９８６、参照）。感染の回
数を重ねることでさらに可変性が増大する。与えられた
ウイルスの感染の来歴におけるこのような変動の影響は
、理解され初めたばかりである。

従って、レトロウイルス由来のへテロＤＮＡの検出では
、標的核酸が非常に可変性であり、完全な同定は必ずし
も知られていない。例えば、ＨＩＶ−Ｉではゲノムの各
種配列が生きたウイルスを産生ずる。塩基の置換はゲノ
ム全体を通じて無秩序にそして短時間頻繁に起こること
が知られている。従って、種々の単離物は相補的である
と思われているプライマー類とごスマッチをもたらしう
る種々の核酸配列を有するウイルスＤＮＡを有するであ
ろう。

このようなミスマッチ、特にプライマーの３′末端また
はその近傍において標的とプライマー間で貴スマッチが
起こる場合には、プライマー類に対する増幅効率が相当
低下するであろう。換言すれば、ブライミングとプライ
マーエクステンションの動力学が変化するのでよスマッ
チは増幅法の減速をもたらす〔例えば、Ｔｉｎｏｃｏ，
　Ｊｒ．．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）．　８５．　６２５２．　１９８８、参照〕。

最悪の場合には、プライマーが標的に結合することに失
敗するか、もし結合したとしても、増幅が起こらずエク
ステンション産物の生或が抑制される（すなわち、プラ
イマーは「不発」）。

〔発明が解決しようとする課題〕

プライマーの３′末端またはその近傍で標的核酸配列と
プライマーとの間にξスマッチが存在する場合でさえも
、核酸を増幅しそして検出するための効率のよい手段を
入手することが望まれるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

プライマーの３′末端で起こるミスマッチに関する前記
課題は、次の工程を含んでなる核酸の増幅方法を用いて
解決される。

Ａ．プライマーの３′末端またはその近傍の単一部分以
外のすべての部分の核酸配列と相補的であるプライマー
から実質的になり、そのプライマーとその核酸配列との
間の単一部分で単一ミスマッチをもたらすものであって
、そしてそのプライマーが前記ミスマッチ部分にチミジ
ン塩基を伴うヌクレオチドを有するプライマー組威物を
、前記核酸を含んでなる被検体と接触させる工程、なら
びに Ｂ．ほぼ同時に、前記核酸が最終的に得られる混合物中
で増幅するような条件下で重合剤を非検体と接触させる
工程。

さらに、次の工程を含んでなる核酸の検出方法によって
解決される。

Ａ、プライマーの３′末端またはその近傍の単一部分以
外のすべての部分の核酸配列と相補的であるプライマー
から実質的になり、そのプライマーとその核酸配列との
間の単一部分で単一ξスマッチをもたらすものであって
、そしてそのプライマーが前記ミスマッチ部分にチミジ
ン塩基を伴うヌクレオチドを有するプライマー組或物を
、前記核酸を含んでなる被検体と接触させて、そのプラ
イマーとその核酸のハイブリッド形成産物を生戒する工
程、 Ｂ、ハイプリッド形成産物でプライマーエクステンショ
ン産物を生成し、プライムし、エクテンドし次いでその
プライマーエクステンション産物を増幅する工程、 Ｃ．得られたプライマーエクステンション産物を分離し
、次いでそれらを検出または捕捉オリゴヌクレオチドプ
ローブと接触させて相補的産物を形成する工程、ならび
に Ｄ．被検体における標的核酸の存在の指標として前記相
補的産物の存在を検出する工程。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明は、試験被検体における予定された（すなわち、
標的）核酸配列１種以上の中の１種以上の特異的核酸配
列の増幅または検出に向けられる。

このような試料としては、細胞質またはウィルス体、毛
髪、体液あるいは検出できる細菌、ウィルスまたはゲノ
ムＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する他の物質を挙げるこ
とができる。事実上、検出の主目的は診断にあるが、本
発明はまた、ＤＮＡもしくはメッセンジャーＲＮＡのク
ローニング効率の改良、あるいは化学合或由来の核酸混
合物から目的配列を多量に得るために使用することもで
きる。

本発明は、使用される反応工程数に対し指数的量で予定
された核酸配列少なくとも１種を生産する連鎖反応と組
み合わせた場合に特に有用である。

産物は、使用された特異的核酸末端に対応する末端を有
する個々の核酸複製物であろう。

精製または未精製のいずれかの核酸起源が提供される出
発原料として利用することができ、それは増幅または検
出を目差す特異的核酸を含むかまたは含むことが予測さ
れる。必要があれば核酸混合物を使用することができる
。複製せしめられる配列はフラグメントまたは核酸全体
であることができる。さらに、増幅せしめる各配列に対
する一連のプライマーを使用することによって１種を越
える核酸配列を同時に増幅することができる。

核酸は、植物、動物またはヒトのいずれかを起源とする
ブラスξドまたは天然に見い出されるＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを初めとする各種起源から得ることができる。それ
は、血液、末梢血単球、組織または当該技術分野で既知
の他の起源を初めとする各種組織から抽出することがで
きる。この発明は、感染個体内およびその間で異質性が
いたるところに存在しているウイルスによって感染され
た流体および細胞から抽出されるウイルスＤＮＡ（例、
ヒト乳頭腫ウイルス）、ＲＮＡウイルスおよびレトロウ
イルス（例、Ｉ｛ＩＶ−１）の増幅および検出にとって
特に有用である。

ＤＮＡは、多くのものは当該技術分野で周知ものであっ
て、その方法がＤＮＡを分解しない限りいずれか適当な
方法を使用して被検体から単離される．例えば、Ｋａｎ
ら、ハム士ｌユ譜吋．釘僅，１０８０　〜１０８４ペー
ジ（１９７７）やＮａｔｕｒｅ．　２５１，　３９２〜
３９３ページ（１９７４）に記載されるように、ＤＮＡ
が分解される傾向を低減した温度およびｐｌ｛で緩衝化
されたプロテアーゼまたはブロティナーゼＫを使用して
細胞からＤＮＡは抽出されうる。他の抽出法は、ヨーロ
ッパ特許公開第１４５３５６号（１９８５年６月１９日
公開）、同２４０１９１号（１９８７年１０月７日公開
）および同２４５９４５号（１９８７年１１月１９日公
開）公報ならびにＮｕｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　（ＵＳＡ）　．７５（１１），
　５５５３　〜５５５６ページ、１９７８およびＳａｉ
ｋｉら、Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　　＋　３＋　１
００８〜１０１２ページ（１９８５）に記載されている
。

抽出されたＤＮＡは、透析、クロマトグラフィー、相補
的核酸を使用する親和性捕捉によるか、または当業者に
自明の他の適当な方法によって精製することができる． 単離されたＤＮＡが得られると、それは関連する工程数
に対し指数的な量の分子を生産する増幅方法にかけられ
る。数種のＤＮＡ分子を目的とする場合には、本発明の
増幅方法を使用してそれらのすべてを複製することがで
きるものと理解しなければならない。最終的結果物は、
その後評価のための類分手段にかけることができる多量
の検出可能な核酸である。

通常使用される増幅方法は、米国特許第４，６８３，１
９５号および同第４，６８３．２０２号（前述）にかな
り詳細に記載されている。

この発明の増幅方法では、１種以上のブライマ一類とし
てそれぞれ特定の核酸に特異的なプライマーを使用する
ことができるが、使用される少なくとも１種のプライマ
ーは本明細書で定義されるような３′末端またはその近
傍で単一逅スマッチであること以外は標的核酸に相補的
である。この重要なプライマーは、前記ミスマッチ部分
にチごン塩基を有する。従って、この発明の利点は、こ
のようなプライマーの使用によって、おそらく標的核酸
配列とプライマーとの間のξスマッチが克服されるであ
ろうし、増幅が効率的に進行する可能性がある点にある
。すなわち、理想的な条件下では予定された核酸にすべ
てのプライマーが完全な相補性を有するが、特にある種
のウイルスＤＮＡではおそらくミスマッチが存在するで
あろうから本発明の必要性は明らかであろう。「プライ
マーの３′末端またはその近傍」の語は、プライマーの
３′末端の４個のヌクレオチド内でミスマッチが起こる
ことを意味する。好ましくは、プライマーは３′末端ま
たはそれから１塩基離れた位置に配置されたチミン塩基
を有する。最も好ましくは、それは３′末端にある。

少なくとも１種のプライマーが前述のようにチミン塩基
を伴うヌクレオチドを有さねばならないが、増幅反応で
使用されるすべてのプライマーがそのように構築されて
いることは必須でない。換言すれば、ＤＮＡ増幅では両
方の鎖がプライマー類および増幅工程によって増幅され
る。ミスマッチはそれらの鎖の単に１本とまたは両方の
鎖と起こりうる。従って、プライマー類は存在する可能
性のあるξスマッチと同数となるように生戒することが
できる。核酸鎖とプライマーとの間にミスマッチが起こ
らない場合には、そのプライマーは、標準的な相補性に
関連する場所でない限り３′末端またはその近傍にチミ
ンを持つ必要はない。

プライマー類は、一般的に一本鎖である。各プライマー
の正確な鎖長は、予期される用途、標的配列の複雑さ、
反応温度およびプライマー源に応じて変動しうるであろ
う。一般的に、この発明で使用されるプライマー類は、
１５〜５０のヌクレオチドで、好ましくはそれらは２０
〜３０のヌクレオチドを有する。

本発明で有用なプライマー類は各種起源から得るか、あ
るいは、例えば、ＡＢＩ　ＤＮＡシンセサイザー（Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅａ＋から入手可能）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ　（
商標’）　８６００シリーズ、８７００シリーズもしく
は８８００シリーズのシンセサイザー（Ｍｉｌｌｉｇｅ
ｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ．　Ｉｎｃ．より入手可能）お
よびそれらの既知の使用方法を初めとする既知の技法お
よび装置を使用して調製することができる。生物学的起
源から単離された天然に見い出されるプライマー類もま
た有用である（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）
。

標的ＤＮＡが抽出され（必要があれば）そして変性され
た時、それらの核酸鎖は、プライマー類と標的ＤＮＡ鎖
のハイブリッド形戒産物の混合物が生成されるような条
件下で本明細書に記載されるプライマー組威物と接触さ
れる。このような条件は、米国特許第４．６８３．２０
２号明細書に記載されるような増幅に通常使用されるも
のである。次に、プライマーエクステンション産物が少
なくとも１種のハイプリッド形成産物と共に生成され、
次いで追加のブライが施され、エクステンシゴン産物が
生成される。変性（すなわち、相補産物の分離）後、標
準的な手法および装置を使用して反応混合物から複製さ
れた標的核酸を単離することができる。好ましくは、複
製された核酸少なくとも１つがビオチン化される。

本発明はまた、２つの相補鎖を有する特異的核酸の検出
にも有用である。通常、目的の核酸配列の殆どはＤＮＡ
で見られるもののように二本鎖である。しかしながら、
ｍ　Ｒ　Ｎ　Ａのような一本鎖核酸配列は、それらを逆
転写酵素を使用して二本鎖配列に転化した後同様に検出
することができる。

予定された核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する
核酸を使用して再生される。核酸が２本の鎖を含む場合
には、別々の工程かまたはプライマーエクステンション
産物の生戒と同時にそれらの鎖を分離することが必要で
ある。変性は、従来技術文献に記載されるようないずれ
かの物理的、化学的または酵素的な手段を使用して行う
ことができる．適当な温度まで加熱することが好ましい
手段である。

分離された核酸鎖が使用可能になりさえすれば、一般に
ｐＨ７〜９の水性緩衝液においてプライマーを使用して
追加の核酸鎖の合戒を行うことができる。好ましくは過
剰モル濃度のプライマー類がその緩衝液に加えられるが
、具体的な量は従来技術文献に教示されている（例えば
、米国特許第４．６８３，２０２号明細書）。この合威
混合液に適当量のデオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴ
Ｐ　．　ｄＣＴＰ　，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰも加えら
れ、次いで得られた溶液が１０分未満、好ましくは１〜
４分９０〜１００゜Ｃに加熱される。この加熱後、溶液
が好ましくは室温まで冷却され、次いでプライマーエク
ステンシゴン産物の生或を誘導するのに適する剤（また
は触媒）が導入される。この誘導剤は、一般に重合剤と
して当該技術分野で知られている。これらの産物を生成
するための反応は、既知の条件下で行われる（一般に、
室温から重合がもはや起らなくなるまでの温度）。

重合剤は、酵素（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウポリメラーゼ、
逆転写酵素および当該技術分野で既知の他の酵素）を初
めとするプライマーエクステンション産物の合威を遂行
するように作用するいずれかの化合物または試薬類の組
み合わせであってよい。他の重合剤は、米国特許第４．
６８３．２０２号明細書に記載されている。

好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアチクス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ　助■１匡吋）から単離されるか、あるい
はヨーロッパ特許公開第２５８０１７号公報に記載され
るようなクローニング法によって合威的に調製されたＤ
ＮＡポリメラーゼである。他の好ましいポリメラーゼは
、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅ
ｒｍｏ　ｈｉｌｕｓから単離される。一般的に、エクス
テンション産物の合戒は各プライマーの３′末端で開始
され、モして合或が停止するまで鋳型に沿って５′から
３′の方向に進行するであろう． 新たに合威された核酸鎖とそれらの個々のプライマー類
を含んでなる新たに’ｔＭされたプライマーエクステン
ション産物は、本発明の方法の次の工程で使用される最
初の標的鎖と二本鎖分子を形成する。次に、これらの核
酸鎖は前述のように変性することによって分離されて一
本鎖分子類を提供し、そして前述のようにその上で新た
な核酸が合威される。この増幅工程の進行を維持するの
に追加の試薬が必要であるかも知れないが、その後の殆
どのエクステンション産物はプライマーと結合した特異
的核酸配列（すなわち、相補産物）からなるであろう。

標準的な分離およびエクステンション産物の合威工程を
必要なだけ繰り返して使用し、例えば検出に必要とする
所定量の特異的核酸を生或することができる。一般に、
一連の工程は少なくとも一度、好ましくは５〜５０度繰
り返すことができる。

最初の核酸またはその混合物から特定の核酸を１種より
多く生或することが望まれる場合には、上述される一般
的な工程で適当な数組のプライマー類を使用する。

通常、ひとたび所定量の目的核酸配列が生じたならば、
プライマーエクステンション産物が最後に分離され、こ
れらのプライマーエクステンション産物（ビオチニル化
されたものを含む）がその産物を捕捉するかまたは検出
するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブと接
触される。

一の態様では、プロープは生或物を捕捉または不溶化す
るように設計される。従って、ブローブはあるタイプの
固相、例えば膜、フィルター、フィルム、スライド、粒
子、マイクロタイタープレートまたは当業者に自明のい
ずれか他の個体材料上に固定化されるか、あるいは固定
可能な状態にある。好ましくは、固相がボリマー粒子（
より詳細には後述する）である．そのオリゴヌクレオチ
ドは、このような付着について当該技術分野で既知の教
示された法を使用して前記固相に共有結合または吸着し
てよい。例えば、共有結合法の一つは、米国特許出願第
１０４．２００号（Ｌｅｖｅｎｓｏｎらにより１９８７
年１０月２日付で出願）に記載される特定の結合部分の
反応を介する。

捕捉用固相として有用なボリマー粒子は、水不溶性でオ
リゴヌクレオチドを直接または間接的に結合するのに必
要な表面反応性基を提供するいずれか適切なボリマー材
料から構戊することができる。従って、これらの表面反
応性基は、例えば、スルフヒドリル、アくノ、活性ハロ
ゲン原子、エポキシ基、イソシアネート、アジリジン、
活性化２一置換エチルスルホニル、ビニルスルホニル、
活性アルデヒド、２一置換エチル力ルボニル、カルボキ
シおよび、それぞれ連結性のスルフヒドリル基、アミノ
基またはヒドロキシ基と反応しうる他の基であることが
できる。

特に有用なボリマー粒子は、活性ハロゲン原子、活性化
２Ｋ換エチルスルホニル、カルボキシまたはビニルスル
ホニル基を少なくとも１個有するエチレン系不飽和重合
性モノマー類から製造されるポリマー類より構成される
。代表的なモノマー類は当該技術分野で既知であり、当
業者にとって自明であろう．特に有用なモノマー頻とし
ては、反応性カルボキシ基を有するもの、例えば、アク
リル酸およびメタクリル酸が挙げられる。

前述の態様では、プライマー類の１つは、その後の検出
のためにアビジンと酵素の結合反応することができるよ
うにビオチニル化されていることが好ましい。すなわち
、プライマーはそれに共有結合したビオチン部分を有す
る。このようなプライマーとビオチンの結合物は、既知
の技法を使用して容易に製造することができる。

プローブとビオチニル化プライマーエクステンション産
物の不溶性ハイブリッド形成産物は、遠心、濾過および
洗浄を初めとするいずれか適当な分離手段を使用して可
溶性物質から分離することができる。好ましくは、微孔
質濾過膜が使用される。特に有用な微孔質濾過膜として
は、ポリアミド膜〔例えば、旧ｔｉｐｏｒｅ　（商標）
　、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ（商標）またはＢｉｏｄｙｎｅ
（商標）〕が挙げられる。

これらの膜は、流体と可溶性物質を集めるのに適する容
器類を伴う分離支持体として使用することができる。し
かしながら、それらは試験装置の一部として固定されて
いることが好ましい。各種の装置が米国特許第３．　８
２５．　４１０号、同３，８８８．６２９号、同３，９
７０．４２９号および同４，４４６．２３２号明細書に
記載されるものを初めとして当該技術分野で既知である
。特に有用な装置は、ヨーロッパ特許公開第３０８２３
１号（１９８９年３月２２日公開）公報で記載されてい
る。

集められた不溶性ハイブリッドは、そのハイブリッドの
ビオチニル化部分と複合体を形戒するベルオキシダーゼ
ーアビジン結合物と接触される。

有用な結合物は数多くの供給元から市販されている。こ
の複合体化が起こりそして未複合体化結合物が流体と共
に膜を通過するには、通常２ないし３分間必要である。

この後、反応産物は使用された酵素標識の存在下で色素
を提供する組成物と接触される。好ましい態様では、ア
ビジンがベルオキシダーゼと結合され、そしてベルオキ
シダーゼと過酸化水素に有用な色素供給組戒物が使用さ
れる。

有用な色素または色素供給試薬は、与えられた酵素につ
いて当該技術分野で既知である。例えば、ペルオキシダ
ーゼについて有用な色素供給試薬としては、テトラメチ
ルベンジジンおよびその誘導体、ならびに米国特許第４
，０８９，７４７号に記載されているトリアリールイ旦
ダゾールロイコ染料のようなロイコ染料が挙げられる。

特に有用な色素供給組戒物としては、例えば、特開平１
　−２０２６６３号（１９８９年８月１５日公開）公報
に記載される特定の安定化剤との組み合わせで使用され
るトリアリールイミダゾールロイコ染料が挙げられる。

不溶性物質中の色素の存在が試験された被検体における
標的ＤＮＡの存在の指標となる。色素は、しばしば機器
を用いることなく肉眼的に観察することができるが、幾
つかの例では、色素濃度が薄くまたは電磁スペクトルの
可視領域外にあるため適正な検出にとって適する検出機
器（すなわち、分光光度計）が必要である。これを行う
ための方法は、当該技術分野で周知である。

他方、ポリマー粒子のような固相が適当な態様（例えば
、着色または放射性粒子）で標識されていてもよく、こ
のときにはビオチニル化プライマ−は不要である。プラ
イマーエクステンション産物の検出は、不溶性複合体化
産物を単離し、次いで肉眼でまたは適当な機器を用いて
標識された固相を検出することによって行われる。

別の態様では、固相に吸着または共有結合されたアビジ
ンを含んでなる固相と複合体を形成しうるビオチニル化
プライマーが使用できる。従って、同位体標識よりむし
ろ捕捉にアビジンービオチン複合体が使用される。特願
平１−２９９８７７号（１９８９年１１月２０日出願）
明細書に記載されるような他の特異的なパインディング
反応を同様に使用できる。

この態様では、標識を提供するのに検出ブローブを使用
して得られる不溶性産物を検出する。プローブはプライ
マーエクステンション産物の一つと相補的であり、そし
て発色源、蛍光威分、化学発光戒分、放射性標識、酵素
、フェリチン、磁性化粒子および当業者に自明の他の標
識を含むいずれか適−当な標識で標識することができる
。標識はプローブに直接結合するかまたは連結基もしく
は特異的なパインディング複合体を介して間接的に結合
することができる。例えば、この態様では捕捉のために
アビジンービオチン反応が使用可能であるが、ブロープ
に標識を結合するのに抗体−ハブテン反応が有用である
かも知れない。他の態様は、この教示によって当業者の
技術水準の範囲内にある。

この発明の方法を使用して感染症、遺伝子疾患またはガ
ンのような細胞性疾患に関連する核酸を増幅または検出
することができる。各種感染症は、細菌、酵母、プロト
ゾアまたはウイルスのような生物体に関する臨床被検体
中の少量ＤＮＡの存在によって診断することができる。

レトロウイルスが本発明で有利に検出され、ＨＩＶ−　
１が特に興味深いレトロウイルスである。

好ましい態様では、２つの相補的鎖を有する予定された
核酸少なくとも１種の検出方法は次の工程を含んでなる
。

Ａ．生物学的被検体中の二本鎖核酸の相補鎖を変性する
工程、 Ｂ．前記被検体をプライマー組成物と接触させる工程（
なお、ここで前記プライマー組戒物は、プライマーの３
′末端またはその近傍の単一部分を除き核酸鎖の１の配
列にすべての部分で相補的であるプライマーから実質的
になり、そしてプライマーと核酸鎖との間の単一部分で
単一のミスマッチをもたらすものであり、そして前記プ
ライマーが前記ごスマッチ部分にチミン塩基を伴うヌク
レオチドを有しており）、 また、他の核酸鎖に実質的に相補的である１以上の追加
のプライマーと前記被検体を接触させて、それらのプラ
イマー類と前記核酸鎖のハイブリッド形戒産物を生戒す
る工程、 Ｃ．熱安定性ポリメラーゼならびにデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸、ｄＡＴＰ　，　ｄＣＴＰ　，　ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰの存在下でハイブリッド形威産物のプ
ライマーエクステンション産物を形成する工程（なお、
このエクステンション産物は、それらの相補体から分離
された場合にはプライマーエクステンション産物の合或
鋳型として役く立ちうる）、Ｄ、プライマーエクステン
ション産物を、それらが合成された鋳型から分離する工
程、Ｅ．前記核酸鎖に相補的な追加のプライマー類を前
記分離されたエクステンション産物と予定された核酸と
接触させ、核酸の増幅をもたらして相補産物を生戒する
工程、 Ｆ．工程Ｅで生成された相補産物からプライマーエクス
テンション産物を分離する工程、Ｇ．工程Ｆで分離され
たプライマーエクステンション少なくとも１種と検出ま
たは捕捉のために標識されかつそれに相補的であるオリ
ゴヌクレオチドプロープと接触させてそのプロープとそ
のプライマーエクステンション産物の相補産物を生或す
る工程、ならびに Ｈ．被検体中の予定された核酸の存在の指標として工程
Ｇで生成された相補産物を検出する工程。

〔実施例〕

以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するが、い
ずれかの態様に限定することを意味しない。

この例は、標的核酸のミスマッチの存在する３′末端に
チミン塩基を伴うヌクレオチドを有するプライマー類が
、３′未満に他の塩基を有するプライマー類と比較した
とき有効な増幅を示すことによって本発明をより具体的
に説明する。

１±エヱニ焼 本明細書のプライマー類、プローブおよび標的核酸のヌ
クレオチド類は、チミンに関してＴ１アデニンに関して
Ａ１グアニンに関してＧおよびシトシンに関してＣの標
準的な略号によって表示されている。３′末端で起こり
うるプライマーと標的との間には１２種の旦スマッチの
可能性が存在する。それらの４種は、対称（すなわち、
Ａ−Ａ　．Ｇ−Ｇ　，Ｃ−ＣおよびＴ−Ｔ）であり、そ
して８種は非対称（Ａ−Ｃ　，　Ｃ−Ａ　．　Ｃ−Ｔ　
，　Ｔ−Ｃ　，Ｇ−Ａ．Ａ−Ｇ　．Ｔ−ＧおよびＧ−Ｔ
）である。

最初の文字はプライマー上のヌクレオチドを表し、そし
て第２番目の文字は標的核酸上のヌクレオチドを表す。

本発明者らは、これらの１２種のξスマッチならびに３
′末端における塩基以外はほぼ同等の２８塩基配列を有
する一連のプライマー類を使用して適正な組み合わせに
ついて研究した。プライマー類は、配列の主或分として
ＨＩＶ−　ＩのＤＮＡ増幅（幻彊領域）に日常的に使用
されているＳＫ−３８プライマーを使用して調製した。

このＳＫ−３８は自動シンセサイザーと既知のホスホラ
ミジト（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使
用して調製した。このプライマーをまず３′末端で変化
させて標的核酸とミスマッチの可能性のある１２種のう
ち３種を生戒した。

次に、それを右方向に１つ位置を移動させ、相違する３
′末端をもたらした後、さらに多くのミスマッチ変種の
３種をその末端で置換することによって調製した。この
手順を２度、すなわち１度は左方向に１つ位置を移動さ
せ、そして１度はそれを左方向に４つの位置を移動させ
ることを繰り返した。得られたプライマー類の配列を次
の表に示す。

すべてのプライマー類は標準的なホスホラミジト化学を
使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈ（商標）　８７００シンセ
サイザーで合威した。これらをポリアクリルアくドゲル
電気泳動で精製しそして脱塩した．塩基組威の解析を用
いてプライマーの純度と組或を評価した．原液は、濃度
を調節するために光学濃度測定値を用いてＴＥ緩衝液（
後述する）で調製した。

杜一葺 使用されるアビジンビーズ試薬は、平均径約２．Ｏｎを
有するポリ〔スチレンー二一ｍ＆ｐ　−（２−クロロエ
チルスルホニルメチル）スチレン〕（９５．５　：　４
．　５、モル比）の粒子を使用してヨーロッパ特許公開
第３０２７１５号（１９８９年２月８日公開）公報に記
載されるように調製し、グリシン緩衝液（０．１モル濃
度、ｐＨ８．５）の懸濁液（０．４５重量％固体）で貯
蔵した。

使用したＤＮＡポリメラーゼは、約４単位／ｔｄの活性
を有するサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｓ＋ｕｓ
　助μ１匡ｕ）から単離した。

ｓｓｐＥ溶液は、Ｔｒｉｔｏｎ　（商標）Ｘ−１００非
イオン界面活性剤（０．２重量％）ならびに塩化ナトリ
ウム（１４９ミリモル濃度）とエチレンジアくン四酢酸
（１ミリモル濃度）含有リン酸緩衝溶液（８．５ミリモ
ル濃度、ｐＨ７）を含めた。

希釈溶液は、塩化ナトリウム３６０ミリモル濃度、リン
酸二水素ナトリウム２０ミリモル濃度（ｐＨ７．４）お
よびエチレンジアミン四酢酸２ミリモル濃度ならびにＴ
ｒｉｔｏｎ　（商標）Ｘ−１００非イオン界面活性剤（
０．２重量％）を含めた。

ＴＥ緩衝液は、トリス（ハイドロキシメチル）アミノメ
タン塩酸塩緩衝液（１０ミリモル濃度）およびエチレン
ジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）を含め、塩酸を使用
してｐＨ８に調節した。

ＰＣＲ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（１０ミリモル濃度、ｐＨ８）、塩化カリウム（５
０ミリモル濃度）および塩化マグネシウム（１０ミリモ
ル濃度）を含めた。

電気泳動に使用した「ランニング緩衝液Ｊ　　（ｐＨ８
）として示す緩衝液は、トリス（ヒドロヰシメチル）ア
稟ノメタン緩衝液（８９ミリモル濃度）、ホウ酸（８９
ミリモル濃度）およびエチレンジアミン四酢酸（２ミリ
モル濃度）から構威した．検出用ロイコ染料Ｍ戒物は、
次のように２−（４−ヒドロキシ−３．５−ジメトキシ
フェニル）４．５−ビス（４−メトキシフェニル）イく
ダゾールから調製した：固体ロイコ染料をリン酸ナトリ
ウム緩衝液（５ミリモル濃度）中ポリ（ビニルビロリド
ン）（２０重景％）溶液に溶解した（０．１重量％溶液
を調製）．次に、この溶液を、リン酸ナトリウム緩衝液
中過酸化水素（１０旦リモル濃度）、４′−ヒドロキシ
アセタニリド（５ξリモル濃度）およびジエチレントリ
ア≧ン五酢酸（１０μモル濃度）に加え、ボリマー１重
量％およびロイコ染料ｏ．ｏｏｓ重量％の最終濃度にし
た。

アッセイで使用した使い捨て試験装置Ｓｕｒｅｃｅｌｌ
（商標）（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．）は、
各試験ウェル中Ｂｉｏｄｙｎｅ（商標）ナイロン微孔質
膜（Ｐａｉｌ　Ｃｏｒｐ）を含めた．この膜は、使用前
にスクシニル化カゼイン（１ｇ／ボ）で処理した。

アッセイで処理したブローブは次の構造式で示される： ０ 上式中、Ｘは西洋ワサビベルオキシダーゼの残基であり
、そしてＹは、次の配列 ５’　　−ＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧ＾八ＧＡＧＧＡＧＧ
ＧＴＧ−３　’を有するオリゴヌクレオチドである。

アッセイで検出される予定のＤＮＡ断片は、Ｍ１３ベク
ター誘導体にクローン化されたＨＩＶ−　１ゲノムのＬ
１領域（コアタンパク質）の１８０ヌクレオチドセグメ
ントであった。

アッセイで使用したビオチニル化プライマーは次の核酸
配列を有する： ５　’　−Ｘ−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧ
ＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’上式中、Ｘは米国特許出願
第１０４．２００号（前述）に記載したように調製し、
結合したビオチンテトラエチレングリコール・スベーサ
ーアームヲ示ス。

アッセイ 増幅は、次の戒分を含有する溶液ｉｏｏＩｌ１を使用す
る微量遠心管でシータス／パーキン・エルマー（Ｃｅｔ
ｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）サーモサイクラーを
用いて実施した：標的フラグメン｝　（１０−”モル濃
度）、プライマー類（各、１マイクロモル濃度）、ポリ
メラーゼ（７．５単位／ＬｏｏＩ１１）　、ｄＮＴＰ（
合計６ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（１０Ｇリモ
ル濃度）およびＰＣＲ緩衝液。

増幅に関する熱プロフィールは、次のように５分間周期
を３０周期繰り返した。

７０゜Ｃから９４〜９５゜Ｃまでの昇温　１分９４〜９
５゜Ｃ　　　　　　　　　　　Ｏ．　５分（変性）９４
〜９５゛Ｃから５５゜Ｃまでの降温　１．２５分５５゜
ｃ　　　　　　　　　　　　Ｏ．５分（ハイプリッド形
成） ５５゜Ｃから７０″Ｃまで　　　　　　０．７５分７０
゜Ｃ　　　　　　　　　　　１分（プライマーの伸長）
。

増幅した標的の検出は、２種の方法で行った。

アガロースゲル電気泳動を使用し、予期された寸法の断
片を合成したもので同定した．配列の情報は、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識オリゴヌクレオチドプローブと
ハイプリッド形成によって確認した。

ゲル電気泳動は次のように実施した：　ＰＣＲ反応混合
物のアリコート（６ｉｌ１）を抜き取り４％アガロース
ゲル〔３％ＮｕＳｉｅｖｅ（商標）および１％Ｓｅａｋ
ｅｍ　（商標）　、ＦＭＣ　ＢｉｏＰｏｏｄｕｃｔｓか
ら入手可能）にかけた。このゲルはエチジウムブロミド
溶液（４ｍ．１０■／ｄ）で予め染色した．「ランニン
グ緩衝液Ｊ　＜６００ｌｌ１）もまたエチジウムプロく
ド（２４ｌ１！）を含めた。このゲルを１時間１６０ポ
ルト／ｃｍで電気泳動し、次いで写真をとりそして得ら
れた吸収帯を可視化した。

プローブとのハイプリッド形成は次のように実施した： ＰＣＲ反応産物（微量遠心管１．　５　ｄ中、希釈１：
１０の希釈液５ｌｌ１）を、５分間９５゜Ｃで溶融し、
この遠心管を手短に回転させ、次いでアビジンビーズ試
薬（２μ）とべルオキシダーゼ標識ブローブ（３ｄの１
ピコモル濃度）を混合し、そして５分間４２゜Ｃでイン
キユベーションした。希釈溶液（５０ｌ１１）を添加、
混合し、次いでこの溶液をＳｕｒｅｃｅｌｌ　（商標）
試薬装置の試験ウェルに加え、そして流体を試験ウエル
中の膜を通して流がした。

これらの試験ウェルを洗液〔予め３０分間５５℃に加温
したリン酸緩衝液（ｐＨ７）による１：１０希釈の希釈
溶液５０μ〕で洗浄した．洗浄を４度繰り返した。

ロイコ染料組戒物（１００ｍ）を添加し、２分後に膜上
の色素をカラーチャート（１〜５の値、５が最高濃度で
ある）を使用して視覚的に評価した。

第１図は、種々のプライマーを使用する各アッセイに対
するゲル電気泳動結果とブローブハイブリッド形戒結果
双方のサマリー・マトリックス（ｓｕｍｍａｒｙ　ｍａ
ｔｒｉｘ）を示す。文字「ＡＪ　１　「ＣＪｌｒＱ，お
よびｒＴ」は、核酸またはプライマー類中のヌクレオチ
ド類を表すのにすべての図で使用されており、これらの
ヌクレオチド類は、それぞれアデニン、シトシン、グア
ニンおよびチミンに対応する塩基を有する。

電気泳動の結果は、正（＋）または負（−）のいずれか
で示されている。前記ブロープの結果は観察された色素
濃度に対応するカラーチャート値として示されている。

結果のすべては、２つの反復試験の平均である。

これらのデータは、プライマーが３′末端にチミン塩基
を伴うヌクレオチドを有する場合、正の電気泳動結果と
一般的により高い色素濃度で明らかなように増幅効率が
高いままである、プライマー類がアデニン、グアニンま
たはシトシン塩基を有するヌクレオチドを末端基とする
場合には、増幅は弱いかまたは存在しない。このことは
、本発明のプライマー類の使用が、他のプライマー類よ
り遥かに容易にプライマーの３′末端もしくはその近傍
におけるミスマッチを克服しうることを示す． 増幅反応で使用される塩化マグネシウム量を１０ミリモ
ル濃度に代えて２．５ミリモル濃度とし、ｄＮＴＰの総
量を６湾リモル濃度に代えて６００マイクロモル濃度に
代えたこと以外は同じ材料を使用して例１の増幅方法を
繰り返した。この低濃度は、．、各種増幅反応方法を識
別するために「低塩」濃度と称されてきた。

第２図は、例１で記載したようにゲル電気泳動と検出可
能なブローブとのハイプリッド形成の結果を示す。これ
らの結果は、塩化マグネシウム濃度の量が結果に影響を
及ぼさなかったことをまた明らかにする以外は、前記に
指摘されるような本発明の利点を再度確認する。この結
果は、塩化マグネシウム濃度がしばしば増幅反応に影響
を及ぼすので、予期できないことであった。

本例は、増幅周期におけるハイブリッド形威温度を５５
゜Ｃに代えて４０“Ｃとしたこと以外は例ｌと全く同様
に実施した。

結果を第３図に示すが、ここではアガロースゲル電気泳
動と検出可能なプローブによるハイプリッド形成が、３
′末端にチミン塩基を伴うヌクレオチドを有するプライ
マー類は他のプライマー類に比べ３′末端にミスマッチ
を有するにもかかわらず効率的な増幅に非常に有用であ
ることを示す。

〔発明の効果〕

本発明は試験被検体に非常に少量存在する核酸類を容易
、かつ正確に増幅または検出するための方法を提供する
。さらにこの方法は、プライマーおよび予定された核酸
の標的配列の３′末端またはその近傍における相補性に
単一のミスマッチが存在する場合に効率的に実施するこ
とができる。

この発明が実施される場合には、そのようなミスマッチ
によって総合的な産物収率がほとんど低下しない。従っ
て、増幅はレトロウイルスのように単離から単離までに
変異する複製配列においても相当よい効率である。

これらの利点は、３′末端またはその近傍のミスマッチ
の位置にチミンを伴うヌクレオチドを有するプライマー
を使用することによって達威される。換言すれば、３′
末端から４個のヌクレオチドまでに標的核酸とプライマ
ー間でくスマッチが起こる場合、プライマーはそのヌク
レオチド位置にチミン塩基を有する．このようなプライ
マーの使用は、かかるミスマッチを最も容易に克服し、
そして標的核酸の効率的なプライミングと増幅を維持す
ることが見い出された。この発明は、感染した個体内お
よび個体間に広範囲にわたる異質性が存在するＨＩＶ−
　Ｉのようなレトロウィルスの検出に特に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、増幅反応で高塩濃度と高ハイプリッド形成温
度が使用された場合の各種３′末端ミスマッチを使用す
る増幅結果のサマリー・マトリックスである。これは、
前記例１による。 第２図は、増幅反応が低塩濃度で実施された場合の前記
例２の結果に関する第１図と同様なマトリックスである
． 第３図は、増幅反応が高塩濃度と低ハイプリッド形成温
度で実施された場合の前記例３の結果に関する第１図と
同様なマトリックスである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、プライマーの３’末端またはその近傍の単一部
   分以外のすべての部分の核酸配列と相補的であるプライ
   マーから実質的になり、そのプライマーとその核酸配列
   との間の単一部分で単一ミスマッチをもたらすものであ
   って、そしてそのプライマーが前記ミスマッチ部分にチ
   ミジン塩基を伴うヌクレオチドを有するプライマー組成
   物を、前記核酸を含んでなる被検体と接触させる工程、
   ならびに Ｂ、ほぼ同時に、前記核酸が最終的に得られる混合物中
   で増幅するような条件下で重合剤を被検体と接触させる
   工程、を含んでなる少なくとも１種の核酸の増幅方法。 ２、Ａ、プライマーの３’末端またはその近傍の単一部
   分以外のすべての部分の核酸配列と相補的であるプライ
   マーから実質的になり、そのプライマーとその核酸配列
   との間の単一部分で単一ミスマッチをもたらすものであ
   って、そしてそのプライマーが前記ミスマッチ部分にチ
   ミジン塩基を伴うヌクレオチドを有するプライマー組成
   物を、前記核酸を含んでなる被検体と接触させて、その
   プライマーとその核酸のハイプリッド形成産物を生成す
   る工程、 Ｂ、ハイプリッド形成産物でプライマーエクステンショ
   ン産物を生成し、プライムし、エクテンドし次いでその
   プライマーエクステンション産物を増幅する工程、 Ｃ、得られたプライマーエクステンション産物を分離し
   、次いでそれらを検出または捕捉オリゴヌクレオチドプ
   ローブと接触させて相補的産物を形成する工程、ならび
   に Ｄ、被検体における標的核酸の存在の指標として前記相
   補的産物の存在を検出する工程、を含んでなる標的核酸
   の検出方法。