JPH03502167A - 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸試験片及び所定の核酸 を検出するためのその使用 関連出願についての言及 本願は、Ｊｏｈｎ　Ｂ、　Ｐｉｎｄｌａｙ等による、１９８９年２月３日出願の 米国特許出願第３０６．９５４号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は診断操作、詳細には、核酸の検出のための診断操作に関する。本発明は またそのような操作に有用な試験片に関する。

発明の背景 核酸のハイブリッド形成は、核酸の同定を研究するための周知操作である。ハイ ブリッド形成は相補的塩基の対合に基づいている。１本領核酸を溶液中でインキ コベートすると相補的塩基配列が対合して２本鎖ハイブリッド分子を形成する。

これらの分子は所望の場合には変性により分離することができる。

疾病の診断、遺伝的欠陥、遺伝子工学もしくは遺伝子の特性決定のために、所定 の（ターゲットとしてもまた知られている）核酸の存在についての被検体のアッ セイに使用することができるか、または汚染物又は他の医学上もしくは研究上の 目的のために、血液、食品又は他の物質を試験するための核酸プローブアッセイ もまた知られている〔例えば、米国特許第４．３５８．５３５号（Ｆａｌｋｏｗ 等に対して１９８２年１１月９日発行）、国際公開第８８１０１３０２号（１９ ８８年２月２５日公告）及びその中に述べられている引例を参照されたい。〕核 酸プローブアッセイの中には、２個のプローブを使用して、３部分ハイブリッド 化生成物の状態で２個のプローブの間に問題の核酸を挾みこむ、当該技術分野に おいて“サンドウィッチ・アッセイ”として知られているものがある。一般に、 一方のプローブは“捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）”プローブであり、これは固体表面 上に、固定化されているか又はそのようになることができるものであり、他方の プローブは検出可能に標識化されるか又はそのようになることができるものであ る。サンドウィッチ・アッセイは、所定の核酸を固体状支持体上に直接固定化す る必要がなく、かつ１つではなく２つのハイブリッド形成反応が検出のために必 要なのでより高い特異性の可能性を提供するという利点を有する。

プローブ・アッセイに用いられる、はとんどの“捕捉”プローブは、一般に、検 出される所定の核酸の少くとも１つの核酸配列と相補的であるオリゴヌクレオチ ドを形成するヌクレオチド配列から構成される。核酸のアフィニティ・クロマト グラフィ分離用及びプローブ・アッセイ用に、オリゴヌクレオチドを固体状支持 体へ結合させるための様々の方法が知られている。かかる方法を述べているかな りの数の文献の中には、国際公開第８８１０１３０２号（上述）、ヨーロッパ特 許第０２３５７２６号（１９８７年９月９日公告）及び米国特許第４．６７３． ６５７号（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎに対して１９８７年６月１６日発行）がある。

当該技術分野における有意な進展は、米国特許第４．６８３．１９５号（Ｍｕｌ ｌｉｓ等に対して１９８７年７月２８日発行）及び米国特許第４、６８３．２０ ２号（Ｍｕｌｌｉｓに対して１９８７年７月２８日発行）明細書に記載されてい る。広範囲にわたり詳細に論することなく、これらの特許は、プライマーが重合 剤（例えば、ポリメラーゼ）と４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在 下で核酸の鋳型にハイブリッド形成し、次いでこれらのブライマー類からエクス テンション産物が生成される増幅方法を記載している。これらの産物は変性され 、次いでそれらのその後の検出を容易にするための、所定の核酸の数および量を 増幅する周期的な反応の鋳型として使用される。この増幅方法は、少量の所定の 核酸から大量の検出可能な物質を生成するために、望ましいだけ多数回、周期的 に実施することができる。

標的配列が検出可能量まで十分に増幅されさえすれば、検出方法は限定的ではな い。放射性−同位体、ビオチンもしくは酵素（ビオチン−アビジン結合を介して プローブに結合された）で標識化したプローブ又はゲル電気泳動の使用を含む、 多くの検出技法が当該技術分野において記載されている。他のプローブは支持体 上に増幅された産物を捕捉するのに使用される。

米国特許第４．７２７．０１９号（Ｖａｌｋｉｒｓ等に対して１９８８年２月２ ３日の）は、゛直接、多孔質基板（例えば、膜）に局所領域中において固定化さ れたプローブを使用して核酸を検出することができる分析方法及び分析装置につ いて記載している。あるいは、プローブを多孔質マトリックス内に埋め込むこと もできる。プローブをかかる支持体に直接結合すること又はそれらをその中に埋 め込むことは、所定の核酸が被検体中に一般に高濃度存在する場合には精確なし かも高感度のアッセイを提供するであろうが、その濃度が非常に低い場合には限 度がある。この技術分野においては研究が進行しているので、より少量（単一分 子であったとしても）を検出する必要性は極めて重要である。従って、多くの従 来の、核酸試験方法及び装置は不十分である。

０２００３８１号（１９８６年１１月５日に公告）に記載されている。更に、複 数個の核酸が同時に検出できるようにいくつかのプローブをマトリックスの区隔 域に埋め込むこともできる。

１種又はそれ以上の核酸を同時に検出するという欲求が当該技術分野においては 残っている。しかしながら、上述したように、ますます低濃度のこれらの核酸を 検出する必要性もまたある。このことはプローブ及び分析操作に関して高感度を 必要とするものである。

発明の要約 上記課題は、少くとも第１対向面及び第２対向面を有し、かつ前記対向面のうち 少くとも１つの対向面の少くとも１つの区隔ゾーン中に水不溶性核酸プローブを 付着せしめている支持体を含んでなる核酸試験片であって、前記プローブは、所 定の核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含んでなり、このオリゴヌクレ オチドは水不溶性粒子に共有結合で結合しており、かつ実質的にいずれの前記プ ローブも前記対向面内に埋め込まれていない、核酸試験片により克服される。

更に、所定の核酸の検出方法は、 Ａ、所定の核酸を含有すると推定される被検体を、上記核酸試験片と接触させて 、 所定の核酸及び前記水不溶性プローブのハイブリッド形成化産物を形成し、 Ｂ、工程Ａに先立って、と同時に又はに続いて、前記被検体を、前記所定の核酸 に対して相補的な、検出可能に標識化されたプローブと接触させて、前記水不溶 性プローブ及び前記標識化プローブの両者とハイブリッド形成した前記所定の核 酸の固定化サンドウィッチ産物を形成し、Ｃ０前記固定化サンドウィッチ産物を 非固定化物質から分離し、そして り、前記固定化サンドウィッチ産物を、被検体中の所定の核酸の量の指標として 検出する、 ことを含んでなる。

更に詳細には、所定の核酸の検出方法は、Ａ、被検体中に見出される所定の核酸 を、相補的プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び重合剤の存在下 で増幅させ、 Ｂ、前記増幅された所定の核酸を、上記核酸試験片と接触させて、 所定の核酸及び前記水不溶性プローブの固定化されたハイブリッド形成化産物を 形成し、 Ｃ１前記固定化産物を非固定化物質から分離し、そしてり、前記固定化産物を、 被検体中の所定の核酸の量の指標として検出する、 ことを含んでなる。

本発明は、被検体、例えば生物学的被検体中の１種又はそれ以上の核酸の迅速か つ精確な検出を達成するための手段を提供する。本発明においては、標的核酸が 極めて低濃度で存在する場合に高感度のアッセイが可能であるということが特に 有利である。更に、本発明の試験片は容易に製造されかつ有意の製造上の有効性 を有する。プローブが水不溶性粒子から構成されているので、それらは後の使用 のために、適切な支持体上に容易に付着されるか又は試験具申に包含される。

従って、プローブ溶液の使用及びそれに伴う不利益が回避される。

この利点は、支持体上の特定位置において支持体に付着している水不溶性プロー ブを使用することにより達成される。

更に、このプローブは当該技術分野において教示されているようには、支持体内 に埋め込まれてはいないので、プローブのより多くの表面積が被検体に露され、 従ってアッセイ感度が高められる。本発明の重要な利点は、個々の位置において 支持体に付着した複数個の水不溶性プローブを使用して、複数個の所定の核酸を 同時に検出できることである。好ましい実施態様においては、本発明の試験片は 、アッセイ用のすべての試薬を含んでもよい、自蔵式試験具内に組み入れられる 。

いくつかの試薬が予め組み入れられていない場合は、この試験具は試薬添加後の アッセイ用の容器になりうる。

図面の簡単な説明 第１図は、支持体の局所区域に水不溶性プローブを固定化せしめた、本発明の試 験片の平面図である。

第２図は、第１図の線■−■に沿った断面図である。

第３図は、支持体に局所的に配置されたプローブを複数個有する、本発明の別の 試験片についての第２図と同様の断面図である。

第４図は、試験ウェルの底部に位置した膜上に、水不溶性プローブを局所的に配 置した、本発明の更に別の実施態様の断面図である。

発明の詳細な記載 核酸の検出において検出されもしくは使用されるプライマー、プローブ又はオリ ゴマーフラグメントに言及する際、本明細書において使用されるものとして、用 語“オリゴヌクレオチド”は２個もしくはそれ以上の好ましくは３個より多゛い デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる分子を指す。その正確 な大きさは限定的ではないが、しかしオリゴヌクレオチドの最終的な用途又は機 能を含む多くの要因に左右される。このオリゴヌクレオチドは合成により又はク ローニングにより誘導されてもよい。

用語“プライマー”は、天然に存在するにせよ合成により製造されるにせよ、核 酸鎖に対して相補的なプライマーのエクステンション産物の合成が誘発される条 件に付された際に、合成に開始点として作用することができるオリゴヌクレオチ ドを指す。このような条件としては、ヌクレオチド（例えば、４本鎖のデオキシ リボヌクレオチド三リン酸）及び重合剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在、 並びに適切な温度及びｐＨが挙げられる。

一実施態様にふいては、このプライマーは１本鎖領域に隣接した、２本鎖の標識 化核酸領域を含む。この１本鎖領域は、核酸配列を含み、この核酸配列はそれと ハイブリッド形成する鋳型鋼に対して十分に相補的である。このプライマーの２ 本鎖領域、又は尾部を、検出可能なシグナルを発生させることができるか又はそ のエクステンション産物を捕捉もしくは固定化するのに有用な検出可能な部分で 標識化することができる。

他のそして好ましい実施態様において、プライマーは全体的に一本鎖である。好 ましくは、プライマーは１本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。それ は、重合剤の存在下でエクステンション産物の合成を始動させるのに十分な長さ でなければならないが、その正確な大きさは、意図する用途、標的配列の複雑さ 、反応温度及びプライマー源次第で変動するであろう。一般に、本発明に用いら れる各プライマーは約１５〜約５０個のヌクレオチドを、好ましくは約２０〜約 ３０個のヌクレオチドを有するであろう。

本発明において用いられるブライマーは、増幅されるべき各特定配列の各種鎮に 対して“実質的に１相補的であるように選択される。このことは、それらが、そ れらの各鎮とハイブリッド形成して所望のハイブリッド形成化産物を形成するの に十分なほど相補的でなければならないということを意味する。非相補性塩基は 、それらがハイブリッド形成及びエクステンション産物の形成を阻害しない限り 、その中に含まれていてもよい。ブライマーは、増幅効率において最良の結果が 得られるように確かな相補性を有することが好ましい。

本明細書において有用なブライマーは、多くの原料から得ることができ、又は、 例えば、ＡＢＩ　［ｌＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能）もしくはＳＡＭ−１合成機（バイ オサーチ・インコーホレイティラド（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、）から入 手可能））をはじめとする公知技法及び装置並びにそれらを使用するための公知 方法を用いて製造することができる。生物学的原料から単離される、天然に存在 するブライマーもまた有用である（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）。

本明細書において用いられるものとして、用語“プローブは天然に存在する又は 合成により製造されるオリゴヌクレオチドを指し、これはブライマーとしては使 用されないが、しかしハイブリッド形成化産物を形成するように核酸の１種又は それ以上の配列に対して実質的に相補的であるように設計されている。更に、プ ローブは一般に得られるハイブリッド形成化産物の１捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）″ または“検出（ｄｅｔｅｃｔ　１ｏｎ）″のいずれかのために設計されている。

捕捉プローブは、例えば、特定の結合リガンド（例えば、アビジン−ビオチン複 合体）を介して吸収又は複合化することにより、ある形で不溶性物質に結合され るか、または分析中のある時点で結合されるようになることができるものである 。検出プローブはその中に検出可能な標識を包含せしめているか、又は検出可能 な部分と、例えば、アビジン−ビオチン複合体を介して反応することができる部 分を有する。捕捉プローブ及び検出プローブの他の具体例は当該技術分野におい て公知である。

本発明は、同一の又は異なる被検体中に存在する１種又はそれ以上の所定の核酸 の検出に向けられている。かかる被検体としては細胞質もしくはウィルス性物質 、毛髪、体液、又は検出可能の遺伝子ウィルスもしくは細菌ＤＮＡもしくはＲＮ Ａを含む他の物質を挙げることができる。かかる検出の主な目的は事実上は、診 断ということであろうが、本発明はまた、組織の分類のための、又は化学的合成 から得られる核酸の混合物から所望の核酸を大量に得るための、ＤＮＡ又はメツ センジャーＲＮＡのクローニングの効率を改良するのにも用いることができるで あろう。

本発明は、適切な方法で１種又はそれ以上の捕捉プローブが付着している支持体 を有する試験片を用いて行うのが有利である。各プローブは、１種又はそれ以上 のオリゴヌクレオチド分子を共有結合でそれに付着せしめている、あるタイプの 水不溶性粒子からなるので、水不溶性である。このオリゴヌクレオチドは、それ らが分析の過程でハイブリッド形成化産物を形成するのに十分な程度まで、問題 の核酸に対して相補的である。

本試験片についてここで更に詳細に検討するが、しかし更なる実施態様は当業者 にとって容易に明らかになるであろうことが理解されるべきである。

試験片の支持体は、プローブを容易に付着させることができかつ所定の核酸を含 む溶液がプローブに容易に接近することが可能であるような、任意の多孔質面又 は非多孔質面であるタイプの結合が存在しなければならない。しかしながら、試 験片の使用の際に望まれる感度にとっては、支持体が多孔質であろうと又は非多 孔質であろうと、プローブが圧倒的に支持体の外側面（又は表面）上に存在する ということが重要である。このことは、プローブがかなりの程度まで支持体中に 埋め込まれていないことを意味する。多孔質支持体を用いる試験片の製造の過程 では、プローブのあるものは支持体内に埋め込まれるかもしくははめ込まれるよ うになるかもしれないことが理解されるが、しかし本発明においては、２０％未 満のプローブがそのような状態に置かれることが予測される。

好ましい実施態様においては、支持体は非多孔質物質であり、かつ１種又はそれ 以上のプローブが１個又はそれ以上の外側面上に完全な形で存在する。

支持体は、少くとも２つの対向外側面を有する形状（下記）を有するものとして 更に明瞭に定義される。かかる表面は一般に平行であるが、しかし完全に平行で ある必要はない（例えば、試験管のカーブした底部の内側面及び外側面）。一般 に、支持体は、プローブを保持するための僅少の厚さ及び外側面を有する平坦な シート、膜又はフィルムである。試験片の一実施態様の詳細な記載は同時係属米 国特許出願第３３９．９２３号（Ｓｃｈｎｉｐｅｌｓｋｙ等により１９８９年４ 月１７日出願）明細書に与えられている。

本明細書中において有用な支持体材料としては、フィルム、膜、箔、紙（例えば 、いかなる方法でも処理、仕上げ、サイジング又は被覆されていない原料素材紙 をはじめとする写真用又は感熱印刷用紙、又は例えばポリマーラテックスで処理 、仕上げ、サイジング又は被覆された紙）、キュベツト、試験管、試験スライド もしくは試験細片をはじめとする、任意の有用な形に形状化されたセルロース性 物質、金属、ポリマー、性フィルム、ポリマー性もしくはセルロース性微孔性膜 、例えば、ボール・コーポレーション（Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ、）製のもの（例え ば、Ｂｉｏｄｙｎｅ（商標）又はＬｏｐｒｏｄｙｎｅ　（商標）膜）、又はポリ マーラテックス−被覆、もしくは非被覆セルロース紙が挙げられる。最も有用な 支持体は、実質的に非多孔質のかつ被覆された紙、例えば、感熱印刷用紙である 。

試験具のいくつかの実施態様が、添付図面に示されている。

第１図及び第２図を見ると、試験具１０は、上部及び下部対向面１４及び１６を 有する、単一片のポリマーフィルム支持体として示されている。水不溶性核酸プ ローブ１８は、支持体１２の対向面１４の中心に付着物として固定される。

試験具の別の実施態様は、第３図の断面図に示されている。

試験具２０は、上部及び下部対向面２４及び２６を有する多孔質支持体２２を含 んでなる。水不溶性プローブ付着物２８．３０及び３２は対向面２４０区隔区隔 域置し、これらは同一の又は異るプローブを含有することができる。

更に別の実施態様は、第４図の断面図に示された使い捨て試験具（下記）の試験 ウェルである。試験ウェル４０は、円錐状の壁４２及びその底部に多孔質膜４６ を有する。膜４６は対向する上部面及び下部面４８及び５０を有し、対向面４８ 上には水不溶性プローブ付着物５２を有する。

プローブは支持体上に任意の適切な技法を用いて付着させることができる。一般 に、プローブを適切な方法で付着させそして乾燥させて、支持体上にプローブの 塗布域を形成し、そして付着は物理的手段による。あるいは、望ましいならば、 支持体及びプローブのいずれかのもしくは両者上の反応性基を用いる化学反応を 介して、又は反応性連結基を介して、付着させることができる。プローブは、支 持体の１個又はそれ以上の区隔域（例えば、点、細片又は他のパターン、各々の 区隔域は一般に約１〜約３０ｍｍ”の表面積を有する）において単に乾燥される だけであるのが好ましい。ある場合には、プローブはアッセイに用いられる液体 と接触した際、再懸濁されてもよい。

プローブそれ自身は、規則的な又は不規則的な形状の水不溶性粒子を用いて製造 される。円形の場合は、それらは一般に約０．１〜約１０１ｍの平均直径を有す る。好ましくは、粒子は円形でありかつ約５ｉｍ未滴の平均直径を有する。粒子 は、ガラス、セラミックス、金属、磁化性材料、ポリマー材料、ゾル、ゲル及び 当業者に容易にわかる他の材料（それらに限定されないが、）をはじめとする、 オリゴヌクレオチドが共有結合で結合することができる適切な材料から製造する ことがる。有用な活性基としては、カルボキシ、アミノ、スルフヒドリル、アル デヒド、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニルスルホニル、活性ハロゲン原 子、ニドロアリール及び当業者に容易にわかる他のものが挙げられる。特に有用 な粒子は、次の反応性基：カルボキシ、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニ ルスルホニル又は活性ハロゲンを１個又はそれ以上有するエチレン性不飽和重合 性モノマーの１種又はそれ以上から誘導されるポリマー性粒子である。有用なモ ノマー、それらの製造方法及びオリゴヌクレオチドの結合をはじめとする、この ような粒子についての更に詳細なことは当該技術分野において知られている（例 えば、１９８９年２月８日公告されたヨーロッパ特許第０３０２７１５号明細書 中に）。

オリゴヌクレオチドの粒子への結合は、標準操作を用いて達成することができる が、粒子のタイプ（すなわち、反応性基）及びオリゴヌクレオチドのどの反応性 基が用いられるか（例えば、ピリミジンもしくはプリン塩基部分上の反応性基。

又は末端ヌクレオチドの部分、５′又は３′）に依存するであろう。種々の操作 が例えば、国際公開第８８１０１３０２号（前述）明細書に記載されている。

オリゴヌクレオチドの粒子上への被覆量はある種のアッセイにおいては感度を改 善するために重要であるかもしれない。

一般には、粒子上にできるだけ多くのオリゴヌクレオチド分子を結合させること が望ましい。粒子は他の支持体と比較して、体積に対する表面積比が高いので、 高密度が有利である。

好ましくは、被覆量は一般１こ粒子１■当り約１００〜約３０００ピロモル（ｐ ｍｏｊりのオリゴヌクレオチドである。

上記したように、水不溶性プローブを、支持体の１個又はそれ以上の表面の区隔 域に付着させる。各区域の大きさ及び形状は同一であっても又は異っていてもよ い。同一の又は異なるプローブを有する複数個の区隔域が存在する、好ましい実 施態様においては、これらの区域は各区域を別々に検出できるように十分に離し て保持される。この実施態様においては、同−又は異なる被検体から種々の所定 の核酸を検出するために、様々のプローブを使用することができるし、又それら は同一の核酸を検出するためにしかし対照として役立てるだけに使用することが できる。

本発明は、また所定の核酸を検出するための、本明細書中に記載された試験片の 使用方法も包含する。前記方法の一般的な記述は上記されている。一実施態様に おいては、この試験片は、得られた３部分ハイブリッドの検出を行うために第２ のプローブを使用するサンドウィッチ・ハイブリッド形成アッセイにおいて使用 される。この第２プローブもまた所定の核酸と相補的であり、かつある方法（上 に検討したように）で検出を可能にする１つの部分を含有する。好ましくは、第 ２プローブはアビジン、ビオチン、抗体、抗原、ハブテン、レクチン、糖（又は 別の特異的結合部分）、又は後述の他の検出可能な部分で標識化される。最も好 ましくは、標識は酵素であり、酵素は適切な基質又は色素形成性試薬と接触する と試験片上に検出可能な色素を生じるであろう。

標識を結合させそしてプローブを製造する操作は、例えば、Ａｇｒａｗａｌ等に よる、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１４巻、６２２７−４５頁（１９ ８６年）に記載されているように、当該技術分野において周知である。有用な標 識としては、放射線同位体、高電子密度試薬、色原体、フルオロゲン（蛍光助剤 ）、燐光性部分、着色粒子、フェリチン並びに他の磁性粒子、化学ルミネッセン ス性部分、及び酵素が挙げられる。有用な酵素としてはグルコースオキシダーゼ 、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファタニゼ及び他の当該技術 分野において公知のものが挙げられる。かかる酵素についての基質及び色素形成 性組成物は周知である。

特に好ましい実施態様においては、標識はペルオキシダーゼであり、分析のある 時点で過酸化水素及び適切な色素形成性組成物を添加して検出可能な色素を生じ させる。例えば、有用な色素−生成試薬としては、テトラメチルベンジジン及び その誘導体、並びにロイコ染料、例えば、トリアリールイミダゾールロイコ染料 （Ｂｒｕｓｃｈｉに対して１９７８年５月１６日に発行された米国特許第４．０ ８９．７４７号明細書に記載されているような）、又は反応してペルオキシダー ゼ及び過酸化水素の存在下で色素を生じる他の化合物が挙げられる。特に有用な 色素−生成組成物は以下の例に記載されている。

得られたハイブリッド形成化産物中にあるプローブの存在の検出は、適切かつ公 知の検出装置及び操作を用いて達成することができる。あるプローブは検出装置 を使用することなく目視で見えるかもしれない。この方法を適切な容器（下記） の中で行うのもまた有用である。

上記のような、所定の核酸のプローブとのハイブリッド形成に先立って、所定の 核酸を増幅して、検出に用いることができる分子数を増加させることが好ましい 。

米国特許第４．６８３．２０２号（前記）明細書に更に詳細に記載されているよ うに、増幅は、含まれる反応の工程の数に対して指数的量の少くとも１種の所定 核酸を生成するための連鎖反応を包含する。この産物は、用いた特定プライマー の末端に対応する末端との別個の核酸重複物であるだろう。精製されていてもい なくても、任意の核酸原料を、もしそれが検出の標的である核酸を含有するか又 は含有すると推定されるならば、出発原料として利用することができる。望まし い場合には、核酸混合物を用いることができる。所定の核酸はフラグメントであ っても又は完全な酸であってよい。更に、増幅されるべき各核酸について特異的 な一組のプライマー及びプローブを用いることにより、１種以上の核酸を同時に 増幅することができる。

本発明は、２本の相補的鋼を有する核酸の検出に有用である。すでに問題となっ ている核酸の大部分は、ＤＮＡにおいて見出されるもののように２本鎖である。

しかしながら、１本鎖核酸、例えば、ｍＲＮＡは、逆転写酵素を用いてそれを２ 本鎮配列に転化した後に、同様に検出することができる。

複製されるべき特定の核酸は鋳型として使用される。もしこの酸が２本鎖を含む ならば、別の工程として又はプライマーのエクステンション産物の形成と同時に 、鎖の分離（変性と呼ぶ）を行う必要がある。変性は、先行技術に記載されてい るような、任意の適切な物理的、化学的又は酵素的手段を用いて達成することが できる。適切な温度まで加熱することが好ましい手段である。

分離された鎖が使用できるようになれば、追加の核酸鎖の合成は、２種又はそれ 以上のプライマー（そのうちの少くとも１種は上記のように標識化されている） を用いて、緩衝水溶液中で約７〜約９のｐＨで行うことができる。好ましくは、 過剰のモル濃度で、２種のプライマーを緩衝溶液に添加するが、具体的な量は先 行技術において教示されている。デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、 　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰもまた、合成混合物に適量添加し、そして 得られた溶液を約９０〜１００℃まで１０分間、好ましくは約１〜約４分間加熱 する。この加熱後、この溶液を好ましくは室温まで冷却し、次いでプライマーエ クステンション産物の形成を誘発するための適切な剤を導入する。この誘発剤は 重合剤として当該技術分野において一般に知られている。これらの産物を形成す る反応は公知の条件（一般に、室温から、重合がもはやおこらない温度まで）下 で行われる。

一実施態様においては、用いるプライマーは標識化されず、かつ増幅産物の検出 は、エクステンション産物を形成するための、１種又はそれ以上の放射線ａ！識 化デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いて達成される。

重合剤は、プライマーエクステンション産物の合成を達成するように機能するで あろう、任意の試薬、又は試薬の組合せであってもよく、酵素（例えば、大腸菌 ＤＮＡポリメラーゼＩ　、　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、フレノウポリメラーゼ 、逆転写酵素及び当該技術分野において公知の他のもの）が挙げられる。

特に有用な酵素は、クローニングされたもの又は天然に存在するもので熱安定性 酵素、例えば、種々のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属の細菌種である。他の重合 剤は米国特許第４．６８３．２０２号（前述）明細書に記載されている。

好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ）から単離された又はそのゲノムから単離されたＤＮＡポリメラー ゼ、例えばヨーロッパ特許公開第０２５８０１７号（１９８８年３月２日公開） 公報に記載されているもている。多くの有用なポリメラーゼが市販されている。

一般に、エクステンション産物の合成は各プライマーの３′末端で開始しそして 合成が終了するまで鋳型に沿って５′から３′方向へ進行する。ある重合剤（例 えば、逆転写酵素）は鋳型に沿って３′から５′方向へ進行するかもしれない。

新規に合成された鎮及びそれらの各々のプライマーを含んでなる新規に形成され たプライマーエクステンション産物は、この方法の次の工程において用いられる 初期標的鋼と２本鎖分子を形成する。これらの鎖は次に変性により分離されて１ 本鎖分子を生成し、上述したように、この１本鎖上に新しい核酸が合成される。

増幅操作の進行を続けるためには更なる試薬を必要とするかもしれず、この後は とんどのエクステンション産物は、２個のプライマー（すなわち、相補的産物と しての）とハイブリッド形成された所定の核酸からなるであろう。

鎖分離及びエクステンション産物合成の工程は必要なだけ繰り返されて、検出に 必要な所望量の所定の核酸を生成する。

一般に、一連の工程は少くとも１回、好ましくは少くとも１０〜３０回繰り返さ れる。

少くとも１個のプライマーエクステンション産物の発生の後の、本発明方法にお ける任意の時点で、エクステンション産物は、本明細書において記載したような 、捕捉プローブ又は検出可能な標識化プローブのいずれかのプローブとハイブリ ッド形成することができる。プローブとエクステンション産物とのこの接触は、 この分析中の他のハイブリッド形成反応と同時に又は引き続いておこなうことが できる。

この増幅方法は適切な容器中で行うことも有用である。最も簡単な容器は試験管 、フラスコ又はビーカーであるが、しかし更に精巧な容器が自動操作を容易にす るために造られてきた。例えば、この方法を実施する際にある温度特性を与える ように構成されたキュベツトが米国特許出願第２７３．７８１号（Ｂｕｒｄｉｃ ｋ等により１９８７年１１月２１日出願）明細書に記載されている。この方法を 遂行するための、そして本発明の試験片を包含する特に有用な容器が米国特許出 願第３３９．９２３号（上記）明細書に記載されている。他の有用な容器は、本 発明方法の自動による使用又は手動による使用のために適宜作成することができ るであろうｔ 検出されるべき相補的産物にとっては、水不溶性産物が反応媒体中で非固定化物 質から分離されることは重要である。

このことは、濾過、洗浄、遠心又は他の適切な分離技法により行うことができる 。

特に有用な分離手段は、微孔質の濾過膜、例えば、Ｐａ１ｌＣａｒｐ、により市 販されているポリアミド膜（例えば、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ”（商標）又はＢｉｏ ｄｙｎｅ”　（商標）膜）である。それらは、界面活性剤もしくは分析操作を容 易にする他の物質で被覆されずに用いられても又は予め被覆されて用いられても よい。一実施態様においては、検出方法が行われるキュベツト中に膜をきり込ん でいる。一般に、かかる膜は実質的にすべてのプローブがその表面上に残留する ような平均孔寸法を有する。好ましくは、この孔寸法は約１〜約１０−である。

膜は、分析の他の工程を実施するための適切な容器を有する別の支持体として使 用することができる。しかしながら、好ましくは、膜は使い捨て試験片の一部と してとり付けられる。様々な試験片が米国特許第３．８２５．４１０　（Ｂａｇ ｓｈａｗｅに対して１９７４年７月２３日発行）、米国特許第３．８８８．６２ ９号（Ｂａｇｓｈａｗｅに対して１９７５年６月１０日発行）、米国特許第３． ９７０．４２９号（Ｕｐｄｉｋｅに対して１９７６年７月２０日発行）及び米国 特許第４、４４６．２３２号（Ｌｉｏｔｔａに対して１９８４年５月１日発行） 明細書に記載されているようなものをはじめとする従来技術に右いて公知である 。特に有用な試験片は米国特許出願第９８．２４８号（Ｈ１ｎｃｋ　ｌｅｙ等に より１９８７年９月１８日出願）及び米国特許出願第３３９．９２３号（上述） −明細書に記載されている。微孔質膜を含む有用な使い捨て試験片はＢａｓｔｍ ａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙにより５ｕｒｅｃｅｌｌ”　（商標）試験片 として市販されている。

本明細書に記載された方法は、感染性疾病、遺伝性障害又は癌のような細胞障害 と関連した、所定の核酸の検出又は特性決定を行うのに使用することができる。

この方法はまた法医学的研究及びＤＮＡ組織の類型化にも使用される。本発明の 目的のためには、遺伝的疾病としては任意の生体由来の染色体ＤＮＡの特異的欠 失又は突然変異、例えば踵状赤血球細胞貧血、嚢胞性線維症、α−サラセミア、 β−サラセミア及び当該技術分野における当業者に容易に明らかである他のもの が挙げられる。様々な感染性疾病は、臨床サンプル中の少量の、生体（それが酵 母、バクテリア又はウィルスのいずれであっても）特有の特異的ＤＮＡ配列の存 在により診断することができる。検出可能なこのようなバクテリアとしては、ス トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　、サルモネラ（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）　、ゴルア（Ｇｏｎｏｒｒｈ ｅａ）　、シゲラ（Ｓｈ　ｉｇｅ　１１ａ）及びリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ）が挙げられるが、しかしこれらに限定されない。検出可能なウィルスとしては ヘルペス、風疹、ヒト乳頭腫ウィルス、サイトメガロウィルス、エプスタインパ ールウィルス、肝炎、）ＩＴＬＶ−１及び旧Ｖ−１のようなレトロウィルスが挙 げられるがこれらに限定されない。踵状赤血球細胞貧血の診断のためのβ−グロ ビンＤＮＡの検出もまた本発明を用いて遂行することもできる。他の検出可能種 は当業者には容易に明らかであろう。本発明は、試験試料中の、レトロウィルス 、例えば、旧Ｖ−ｔの存在の検出に特に有用である。かかるアッセイにおいては 、旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡの核酸配列、例えば、ギャグ（ｇａｇ）域の配列に対して相 補的なオリゴヌクレオチドを有するプローブを使用する。

次の例は本発明の実施を具体的に説明するために提供されるものであり、本発明 を限定するものではない。すべてのパーセントは他に断らない限り重量パーセン トである。

例１及び例２は、フロー、スルー（ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ）操作と云われる ものを用いる、旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡの分析を具体的に説明するものであり、この操 作により水不溶性プローブを使い捨て試験片中のフィルター膜上に固定化するも のである。旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡ標的核酸とのハイブリッド形成がおこって水不溶性 産物を形成し、続いてフィルター膜を介して水溶性物質を洗浄する。

膜上に残留する水不溶性産物をその表面上で検出する。

例３はフロー、パイ（ｆｌｏｗ　ｂｙ）操作と云われるものを用いる旧Ｖ−Ｉ　 ＤＮＡ及びβ−グロビンＤＮＡの分析として具体的に説る。旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡ及 びβ−グロビンＤＮＡ標的核酸とのプローブのハイブリッド形成がおこって水不 溶性産物を形成する。水溶性物質は支持体から洗い流されそして残留する水不溶 性ハイブリッド産物が次に支持体表面上で検出される。

２−　（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４− メトキシフェニル）イミダゾールを含有するロイコ染料溶液を次のように調製し た：固体状ロイコ染料（０，１％溶液を調製するように）を、リン酸す）　１７ ウム緩衝液（５ミリモル濃度）中の２０重量％のポリ　（ビニルピロリドン）溶 液に溶解した。この溶液を次に、リン酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素（１０ ミリモル濃度）、４′−ヒドロキシアセトアニリド電子移動剤（５ミリモル濃度 ）及びジエチレントリアミン五酢酸キレート剤（１０μモル濃度）を含有する溶 液に添加して、１０％のポリ（ビニルピロリドン）及び０．００５％のロイコ染 料の最終濃度と１．た。

カゼインを同重量のコハク酸無水物と４時間２５℃で反応させ、次に透析により 生成物を精製することによりコハク酸エステル化カゼインを製造した。

この例において検出された所定のＤＮＡフラグメントをＭ１３ベクターの誘導体 にクローニングされかつ標準操作を用いて調製された旧Ｖ−Ｉゲノムのｇａｇ域 （コア蛋白）の１８０ヌクレオチドセグメントであった。

所定のＤＮＡの増幅に用いられたプライマーは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ ）、チミン（Ｔ）及びチトシン（Ｃ）という標準的な省略を用いると次のヌクレ オチド配列を有した： ５’−Ｘ−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’ 及び５’　−ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ−３ ’前記式中、Ｘは、引用することにより本明細書中に包含されている、国際公開 第８９１０２９３１号明細書中に記載されている操作により調製されかつ結合さ れたビオチンテトラエチレングリコール分子を表す。。

記載されている操作（１単位は、プライマー・エクステンション産物中に３０分 間３７℃で包含されたｄＮＴＰ　１０ミＩＪモルに相当する）に従って単離した 。

ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体をＺｙｍｅｄ　Ｌａｂ ｓ　（サンフランシスコ）から得、そしてカゼイン（０，５％）、３−（Ｎ−モ ルホリノ）−プロパンスルホン酸緩衝液（１００ミリモル濃度、ｐＨ７，５＞及 び保存剤（０，０１％）を含有するリン酸緩衝溶液で１：８０００に希釈した。

最終の複合体濃度は１５６ｎｇ／ｍｊ！であった。リン酸緩衝溶液はリン酸ナト リウム（２５ミリモル濃度、Ｐ）１７．３）及び塩化ナトリウム（７５ミリモノ 濃度）を含有した。

プローブの調製： 例に使用された水不溶性プローブは次の方法で調製した。

ポリマー粒子（２Ｉ−）は、標準ラテックス重合操作を用いてポリ　（スチレン ーコーアクリル酸）（９７，５：２．５モル濃度比）から構成されており、次に グリシン緩衝液（０，１モル濃度、ｐＨ８，５）中に懸濁物（０，４５％固体） として保存した。

所定の旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡ標的配列に対し相補的なオリゴヌクレオチドを用いてプ ローブを調製した。このプローブは次の配列を有した： ５’　−Ｘ−ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ Ｔ−３’前記式中、Ｘは、引用することにより本明細書中に包含されている、国 際公開第８９１０２９３２号明細書に記載されているような、ポリエチレングリ コールスペーサーを介してプローブに結合したアミノ基を表す。

ポリマー粒子の懸濁物を２回、２−（Ｎ−モルホリン）エタンスルホン酸緩衝液 （０，１モル濃度、ｐＨ６）で洗浄した。

２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（１ｍｌ）中の粒子試料（３ｋ ＞を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ 同一の緩衝液中に１００■／ｒｎ１．０濃度のもの０．１５ｍ１＞及び前記オリ ゴヌクレオチド（５７，３０口／ｒｎｌのナノ純度の水０．０２８８ｒｎｌ、　 １．６５０Ｄ単位）と混合した。得られた混合物を回転しながら２０〜２５℃で １５時間回転し、遠心分離し次いで粒子を３回ナノ純度水で洗浄し次いでその中 に再懸濁（０，４５％固体）した。

得られた水不溶性プローブを、３つの異なる濃度に調製したニ プローブＡ　：　３３４ピコモルのプローブ／■粒子、プローブＢ　：　８３５ ピコモルのプローブ／■粒子、及び プローブＣ：　１６７０ピコモルのプローブ／■粒子。

上記の水不溶性プローブ（０，４５％懸濁物１ｊ）を、５ｕｒｅｃｅｌｌ”（商 標名）使い捨て試験具（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、）の試験ウェル中 に位置するいくつかの多孔質膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ”、商標名、１ｇ　／　ｒｎ″ のコハク酸エステル化カゼインを被覆したナイロン膜）の各々の規定区域（約２ 胴２未満）中に付着させた。このプローブ懸濁物を約３０分室温で乾燥させた。

次に、得られた試験片を以下に述べるアッセイに使用した。

アッセイ操作ニ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（１０ミリモル濃度、ｐ）１８ ）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（１０ミリモル濃度 ）及びゼラチン（ｌｋ）を含有する緩衝溶液に、上記プライマー（各々１００ｐ ｍ１００ｐ　、ｄＮＴＰ（各々１．５　ミＩＪモル濃度）、上記ポリメラーゼ（ ７，５単位）及びヒト胎盤ＤＮＡ　（Ｓ　ｉｇｍａ、Ｉｇ）を添加した。更に、 上記ＤＮＡ標的（１０−”モル濃度）を添加したが、全量は１００１ｔ１であっ た。

標的としてβ−グロビン遺伝子を含むヒト胎盤ＤＮＡ　（ｌｋ　／ｄ）、及び当 該技術分野において公知の、β−グロビン［）ＮＡに対して特異的であり、その １つのプライマーはビオチン化されている適切なプライマーを含有する対照（１ ００〆）を調製した。

上記の各溶液をポリプロピレン製微量遠心分離管中に入れ、プライマーエクステ ンション産物を形成し、ついで増幅を次のように３０連続熱サイクルを用いて促 進した。

７０℃から９５℃まで昇温　　　　　１分９５℃　　　　　　　　　　　　０． ５分（変性）９５℃から５５℃まで降温　　　　１．２５分５５℃　　−０，５ 分（ハイブリッド形成）５５℃から７０℃まで昇温　　　　０．７５分７０℃　 　　　　　　　　　　　　１分（エクステンション）３０熱サイクルによる増幅 の後、各混合物の５μ分別量を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝 液（１０ミリモル濃度、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マ 次に上記した５ｕｒｅｃｅｌｌ”　（商標）試験具の試験ウェルに添加した（各 ウェル中に各溶液を約９５Ｉ）。

テープを各ウェル上にかぶせてそれらを密封し、次いで試験具を４２℃で５分間 インキュベートして、増幅器Ｖ−Ｉ　ＤＮＡフラグメントを試験ウェル中に固定 化された水不溶性プローブにハイブリッド形成された。テープを次に各試験ウェ ルから取りはずし、次にリン酸緩衝剤（ＩＯミＩＪモル濃度、ＰＨ７，４）、塩 化ナトリウム（１５０ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃 度及びデシル硫酸ナトリウム（１％）を含有する緩衝溶液（２５０〆）を用いて ５５℃で洗浄した。

上記ペルオキシダーゼ複合体（５０１Ｉｌ、　７．８　ｎｇ）を各試験つエルに 添加し、次いで試験具を室温で２分間インキュベートした。上記緩衝溶液を用い て第２回目の洗浄（２５０ｍ）を行った。ロイコ染料溶液（１００Ｉ）を各試験 ウェルに添加し、続いて室温で２分間更にインキコベートした。結果としてあこ る色素形成反応をす）　ＩＪウムアジド（０，１％のものを１００Ｉｔ１）を添 加することにより停止し、次いで得られた色素を膜上で観察した。〜 結果を目視により、ゼロは濃度なし及び５は最高濃度であるとした０〜５のスケ ールを用いて等級づけした。次表の結果は、各プローブ濃度について２回別々に 読取ったものの平均である。

対照溶液を添加した試験具ではシグナルは全く観察されなかった。バックグラウ ンド値は水不溶性プローブが存在しない膜上の区域での濃度読取りから得られた 。

表 プローブＡ　　　　　　３．６５　　　　　０．２５プローブ８　　　　　３． ５　　　　　０プローブＣ３，３５０ 例２　：　ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡ　（７）検出本例は、プローブをその上に固定化 した基板として微孔質濾過膜を用いる、旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡ検出を実証するもので ある。

材料及び方法： ポリ［スチレンーコーｍ及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレ ン］　（９５，５：　４．５モル濃度比、２．２ｊ−の平均寸法）を含んでなる ポリマー粒子を、引用することにいる方法により製造した。

カゼインをこれらの粒子に次の方法で結合した：カゼイン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　、０．０５５モル濃のホウ酸塩緩衝液中に２．５７ｍｇ　／ｍ１． のものを４．９４ｍｊ？５ｐＨ８，５）　、メチロサール（０，０１％）及び上 記のポリマー粒子の懸濁物（ホウ酸塩緩衝液中に１７．７−１０．０６３７ｇ　 ／ｍＡ）の溶液を回転させながら１６時間室温で回転させた。この混合物を次に 遠心分離にかけ次いで緩衝溶液を除去した。得られたペレットをグリシン緩衝液 （０，１モル濃度、５０ｍｊ！、　ｐＨ８，５）及びメチロサール（０，０１％ ）中に再懸濁した。この混合物を遠心分離にかけ、次いで得られたペレットを０ ．４５％の固体含有量になるようにグリシン緩衝液（２５０ｒｎＩｌ）中に再懸 濁した。

粒子２．５４ｇを含有する粒子懸濁物＜５０ｍｆ）の試料を３回ホウ酸塩緩衝液 （１０ｍｆ、　０．０５５モル濃、ｐＨ８，５）で洗浄し、ジメチルスルホキシ ドの溶液（１０■／ｄ＞中のコハク酸無水物（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、 　　０．７６２＋ｙ＋１）と混合し次いで４時間室温で反応させた。この混合物 を遠心分離にかけ次いで溶液を除去した。得られたペレットを３回グリシン緩衝 液（５０献、０．０１１モル濃、ｐＨ８，５）で洗浄し、次いでグリシン緩衝液 中で０．４５％の固体含有量になるように再懸濁した。

グリシン緩衝液中の粒子懸濁物（１５ｍｌ、　０．００４５ｇ／ＷＬｌ）を遠心 分離し、次いでこのペレットを２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液 （０，１モル濃度、ｐＨ６）中に再懸濁した。この操作を２回繰り返し次いで得 られたぺ゛レットを、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ ジイミド塩酸塩（同一の緩衝液中に１００■／−の溶液を０．３３８ｄ）及び以 下の配列を有するオリゴヌクレオチド＜５．７３００／−の緩衝溶液０．６５４ 〆）と混合した。この懸濁物を回転させながら１６時間室温で回転させ次いで遠 心分離にかけ、そしてペレットをナノ純度の水（１５１ｒ１１）中に再懸濁した 。この遠心分離操作を３回繰り返し、次いで得られたペレットを水に懸濁させて 水不溶性プローブの０．４５％固体含有の懸濁物を得た。

このオリゴヌクレオチドは次の配列（塩基について標準の省略形を用いて）を有 した： ５’　−ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴ− ３’アッセイ： ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡのアッセイは、例１に記載した操作に従って行った。水不溶 性プローブを微孔質膜の規定区域中に付着させ次いで例１において述べたように 乾燥させた。

アッセイ中に膜上に生成された色素量は目視により０〜５のスケールを用いて等 級づけした（ゼロは濃度なし及び５は最高濃度である）。バックグラウンド値は 水不溶性プローブが存在しない膜域上の濃度読取りから得られた。この分析につ いての色素濃度の読取りは約４．８と測定され、一方バツクグラウンド濃度は約 ０．５であった。

例３　：　ＨＩＶ−１ＤＮＡ及びβ−グロブリンＤＮＡの測定本例は、２つの水 不溶性プローブがその上に固定化されている基材として、実質的に非多孔質の、 非被覆紙を用いる、ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡ及びβ−グロビンＤＮＡについてのアッ セイを実証するものである。

材料： エッペンドルフ（Ｂｐｐｅｎｄｏｒｆ　）管及びヒーターをＢｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。

Ｂｋｔａｍａｔｅ”　（商標）感熱印刷紙（非被覆）をＥａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄ ａｋＣｏｍｐａｎｙから得て、実質的に非多孔質の非被覆紙基板として使用した 。

ＨＩＶ−１プライマーは、上記例１にふいて記載したものと同じであった。

β−グロビンＤＮＡブライマーは次の配列を有した：５’−Ｘ−ＡＣＡＣＡＡＣ ＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３’及び５’　−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧ ＴＴＣＡ［：Ｃ−３’上記式中、Ｘは、旧Ｖ−１ブライマーについて例１におい て述べたようにして製造しかつ結合させたビオチン分子である。

β−グロビンＤＮＡプローブは次の配列を有した：５’　−Ｘ−ＣＴＣＡＡＡＣ ＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ−３’前記式中、Ｘは旧Ｖ− １［）ＮＡプローブについて述べたものと同じである。

プローブ及びブライマーは標準ホスホアミダイト化学を用いて製造し、高圧液体 クロマトグラフィにより精製しそして標準配列操作により特性決定された。

ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡについての水不溶性プローブは上記例１においローブ（０， ４５％の懸濁液２Ｉ！１）をＢｋｔａｍａｔｅ”　（商標）感熱印刷紙（大きさ が約１９Ｘ８ｍｍ）の規定区域（直径２閣の点）上に付着させ、室温で乾燥させ た。β−グロビンプローブＤＮＡを同様に調製しそして同一の紙基材の別の区域 ・（直径２肛）に付着させた。

この紙支持体を次にプラスチック材（ポリエステルとポリエチレン又はポリプロ ピレンのいずれかとの積層物）の一方の面に貼り付けた。プラスチック材の他の 面を第１の面上に熱を用いてシールして囲りをとじたパウチを形成した。このパ ウチは、その中のプローブとのおこり得る接触のために、液体をパウチ内に注入 するための流入ピペット口、及び液体をパウチから流出させる流出手段を含有し た。流体試薬を次にパウチ内に入れてプローブと接触させてその後パウチから流 出させた。

ポリメラーゼ連鎖反応のための反応混合物（全容量１００ｍ　）はニ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（１０ミリモル濃度、ｐＨ８， ３）、 塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、 塩化マグネシウム（１０ミリモル濃度）、ｄＮＴＰｓ　（各々１．５ミリモル濃 度）、プライマー（１μモル濃度）、 ゼラチン（０，０１％）及び サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離し たＤＮＡポリメラーゼ（７，５単位）から構成された。

ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡ標的核酸は、Ｍ１３／ＨＩＶ（Ｍ１３０ＮＡ７７−ジ中にク ローニングにされた旧Ｖ−１の１８０塩基対セグメント）又はＨ［ＩＴ細胞系Ｄ ＮＡ（ＨＩＶ−１ゲノムの単一にまとまったコピーを含む細胞系）であった。β −グロブリン標的核酸は、１細胞当りβ−グロブリン遺伝子の２コピーを含むと 推定されるヒト胎盤ＤＮＡであった。

アッセイ： ＨＩＶ−４及びβ−グロブリン標的の両者の溶液（１０ｉｒｌ、各々約１０−” モル濃度）及びポリメラーゼ連鎖反応混合物（１００ｍ　＞をエッペンドルフ加 熱ユニットのエッベンドルフ管に添加し、次いで次のプロトコールを用いて３０ 〜３３サイクルの、ポリメラーゼ連鎖反応に付した＝９５℃で３０秒間のインキ ュベーション（変性）、５５℃で３０秒間のインキュベーション（ハイブリッド 形成）及び７０℃で１分間のインキュベーション（重合）。

増幅された標的核酸を含む溶液の一部（１０ｍ）を、次にトリス（ヒドロキシメ チル）アミノメタン緩衝剤（１０ミリモル濃度、ｐＨ＆３）、塩化カリウム（５ ０ミＩＪモル濃度）、塩化マグネシウム（１０ミリモル濃度）及びゼラチン（０ ，０１％）を含んでなる緩衝溶液（１３０ｍ　＞で希釈した。得られた溶液を次 にエッペンドルフ管中で９５℃で５分間加熱して２重鎮標的核酸を変性した。こ の加熱溶液をピペットに移し、次いでプローブを固定化せしめている感熱印刷紙 の表面のおおいを確保するような方法で、上記パウチ中へ注入した。このパウチ を次に４２℃で５分間インキュベートして、対応するプローブをそれぞれの１末 鎖旧ｖ−■及びβ−グロビンの核酸標的に結合させた。液体を空気圧で押し出す か又は液体を注射器を用いて吸い出すことによりパウチから液体を除去した。

洗浄溶液をパウチ中へ２回注入した。この溶液は、リン酸二水素ナトリウム（１ ０ミリモル濃度、ｐ）１７．４）、塩化ナトリウム（１５０ミリモル濃度）及び エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）を含んでなる緩衝溶液２５０１ｔ！ 、並びにデシルサルフェート（１％）からなり、５５℃まで予備加熱した。第２ 回目の洗浄後、液体を除去し、次いで例１のストレプトアビジン−西洋ワサビペ ルオキシダーゼ複合体（２００ｍ　）を次にパウチ中に注入し、これを次に室温 で２分間インキュベートした。この液体を次に除去し、次いで上記のロイコ染料 溶液（２００ｉｄ＞をパウチ中に注入し、続いて室温で１〜２分間更にインキュ ベートした。最後にこの液体を除去した。アジ化ナトリウムの溶液（０，１％溶 液２００ｄ　）をパウチ中に注入して反応を停止し次いで感熱印刷紙上にある色 素を目視により、５が最高色素濃度を表す、０〜５までのスケールを用いて等級 づけした。バックグラウンドは、プローブを固定化していない感熱印刷紙の区域 から読取った。旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡ及びβ−グロビンＤＮＡ標的についての色素濃 度はそれぞれ３．８及び４．２であり、一方バツクグラウンドの読取りは０．５ であった。

本発明を、その好ましい実施態様を特に参考にして詳細に述べてきたが、変更及 び修正を本発明の精神及び範囲の中で行うことができることが理解されるであろ う。

宝酪唄審親牛 ｌ１１１７１．−ムエ−＋＋Ｉ＋＝ＰＣ“ｒ／ＵＳ９０／１１１０４岬：；２国 際調査報告 、ＰＣＴ／ＪＳ　９Ｇ１００４５２

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．少くとも第１対向面及び第２対向面を有し、かつ前記対向面のうち少くとも １つの対向面の少くとも１つの個別ゾーン中に水不溶性核酸プローブを付着せし めている支持体を含んでなる核酸試験片であって、 前記プローブは、所定の核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含んでなり 、このオリゴヌクレオチドは水不溶性粒子に共有結合しており、かつ実質的にい ずれの前記プローブも前記対向面内に埋め込まれていない、核酸試験片。
2. ２．前記支持体が、実質的にすべての前記プローブがその表面上に残留するよう な平均孔寸法を有する多孔質膜である請求項１記載の試験片。
3. ３．前記支持体が、実質的に非多孔質の、非被覆紙である請求項１記載の試験片 。
4. ４．前記基板がポリマーフィルムである請求項１記載の試験片。
5. ５．複数の水不溶性プローブを有し、各プローブが前記対向面上の区隔ゾーンに 付着されており、かつ各プローブが別個の所定の核酸に対して相補的なオリゴヌ クレオチドを含んでなる請求項１記載の試験片。
6. ６．自蔵式試験具中に配備された請求項１記載の試験片。
7. ７．前記水不溶性粒子が、約０．１〜約１０ｍμの直径を有するポリマー粒子で ある請求項１記載の試験片。
8. ８．前記固定化プローブが、ＨＩＶ−ＩＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオ チドを含んでなる請求項１記載の試験片。
9. ９．前記の区隔ゾーンの各々が約１〜約３０ｍｍ２の面積を占める請求項１記載 の試験片。
10. １０．膜の一方の面の少くとも１つの区隔ゾーン中に水不溶性核酸プローブを付 着せしめている多孔質膜を含んでなる試験片であって、 前記プローブが、ＨＩＶ−ＩＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含ん でなり、このオリゴヌクレオチドは約０．１〜約１０ｍμの平均直径を有するポ リマー粒子に共有結合しており、実質的にいずれの前記プローブも前記膜表面内 に埋め込まれていない試験片。
11. １１．前記プローブが、前記膜表面に、膜表面の１つ以上の区隔ゾーンにおいて 付着されている請求項１０記載の試験片。
12. １２．前記腹がコハク酸エステル化カゼインで予め被覆されている請求項１０記 載の試験片。
13. １３．前記プローブのオリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ−Ｉゲノムのｇａｇ領域の ヌクレオチド・セグメントに対して相補的である請求項１０記載の試験片。
14. １４．所定核酸の検出方法であって、前記方法が、Ａ．所定の核酸を含有すると 推定される被検体を、少くとも第１対向面及び第２対向面を有し、かつ前記対向 面のうち少くとも１つの対向面の少くとも１つの区隔ゾーン中に水不溶性核酸プ ローブを付着せしめている支持体を含んでなる核酸試験片であって、 前記プローブは、前記の所定の核酸の第１の核酸配列に対して相補的なオリゴヌ クレオチドを含んでなり、このオリゴヌクレオチドは水不溶性粒子に共有結合し ており、かつ実質的にいずれの前記プローブも前記対向面内に埋め込まれていな い、核酸試験片と接触させて、 所定の核酸及び前記水不溶性プローブのハイブリッド形成化産物を形成し、 Ｂ．工程Ａに先立って、と同時に又はに続いて、前記被検体を、前記所定の核酸 に対して相補的な、検出可能に標識化されたプローブと接触させて、前記水不溶 性プローブ及び前記標識化プローブの両者とハイブリッド形成した前記所定の核 酸の固定化サンドウィッチ産物を形成し、Ｃ．前記固定化サンドウィッチ産物を 非固定化物質から分離し、そして Ｄ．前記固定化サンドウィッチ産物を、前記被検体中の所定の核酸の量の指標と して検出する ことを含んでなる検出方法。
15. １５．複数個の所定の核酸の検出方法であって、前記試験片が、複数個の水不溶 性プローブを含んでなり、各プローブが前記対向面上の区隔ゾーン中に付着され ており、かつ各プローブが別個の所定の核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチ ドを含んでなる請求項１４記載の方法。
16. １６．前記水不溶性プローブが、ＨＩＶ−ＩＤＮＡに対して相補的なオリゴヌク レオチドを含んでなるものである請求項１４記載の方法。
17. １７．前記試験片上の前記区隔ゾーンの各々が約１〜約３０ｍｍ２の面積を有す る請求項１４記載の方法。
18. １８．所定の核酸の検出方法であって、前記方法が、Ａ．被検体中に見出される 所定核酸を、相補的プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び重合剤 の存在下で増幅させ、 Ｂ．前記の増幅した所定の核酸を、少くとも第１対向面及び第２対向面を有し、 かつ前記対向面のうち少くとも１つの対向面の少くとも１つの区隔ゾーン中に水 不溶性核酸プローブを付著せしめている支持体を含んでなる核酸試験片であって 、 前記プローブは、前記の所定の核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含ん でなり、このオリゴヌクレオチドは水不溶性粒子に共有結合しており、かつ実質 的にいずれの前記プローブも前記対向面内に埋め込まれていない、試験片と接触 させて、 所定核酸及び前記水不溶性プローブの固定化されたハイブリッド形成化産物を形 成し、 Ｃ．前記固定化産物を非固定化物質から分離し、そしてＤ．前記固定化産物を、 前記被検体中の所定の核酸の量の指標として検出する、 ことを含んでなる方法。
19. １９．工程Ａにおいて使用した前記プライマーの少くとも１つが検出可能に標識 化されている請求項１８記載の方法。
20. ２０．前記固定化産物が、検出可能に標識化されている第２プローブを用いて検 出される請求項１８記載の方法。
21. ２１．自蔵式試験具によって行われる請求項１８記載の方法。
22. ２２．前記支持体が微孔質濾過膜である請求項１８記載の方法。
23. ２３．前記支持体が実質的に非多孔質の、非被覆紙である請求項１８記載の方法 。
24. ２４．前記水不溶性粒子が、約５ｍｍ未満の直径を有するポリマー粒子である請 求項１８記載の方法。
25. ２５．ＨＩＶ−ＩＤＮＡの検出方法であって、前記方法が、Ａ．生物学的被検体 中に見出されるＨＩＶ−ＩＤＮＡを、相補的プライマー、デオキシリボヌクレオ チド三リン酸及びサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕ ｓ）から誘導されたポリメラーゼの存在下で増幅させ、 Ｂ．前記の増幅ＨＩＶ−ＩＤＮＡを、膜の一方の面の少くとも１つの区隔ゾーン に水不溶性核酸プローブを付着せしめた微孔質膜を含んでなり、 前記プローブがＨＩＶ−ＩＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、 このオリゴヌクレオチドは約０．１〜約５μｍの平均直径を有するポリマー粒子 に共有結合しており、実質的にいずれの前記プローブも前記膜表面内に埋め込ま れていない、核酸試験片と接触させて、 ＨＩＶ−ＩＤＮＡ及び前記水不溶性プローブの固定化されたハイブリッド形成化 産物を形成し、 Ｃ．前記固定化産物を非固定化物質から分離し、そしてＤ．前記固定化産物を、 前記被検体中のＨＩＶ−ＩＤＮＡの量の指標として検出する ことを含んでなる方法。
26. ２６．少くとも１つのプライマーがビオチン化され、かつ前記固定化産物の検出 が、それを、アビジン及び酵素の複合体と接触させることにより遂行される請求 項２５記載の方法。
27. ２７．前記複合体がペルオキシダーゼを含んでなり、かつ前記複合体及び前記産 物の接触に続いて、前記産物を過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で色素 を生じるロイコ染料装成物と接触させる請求項２６記載の方法。