JP4130487B2 - 核酸の同時増幅方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、多数の増幅サイクルの中に復元工程を導入した２種以上の二本鎖核酸の迅速な優先同時増幅法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、核酸の検出は、ヒトや動物の被検体中に非常に少量で存在する染色体の特徴、感染性因子及び各種生物を早期に検出するための手段として成長している。検出手順は、通常、（ヌクレオチド対として知られている）相補的ヌクレオチド間の水素結合やその他の力によって２本のＤＮＡ鎖が一緒に結合する相補性の概念に基づくものである。
ＤＮＡ分子は、通常はかなり安定であるが、その鎖は、加熱などの特定の条件によって分離又は変性させることができる。変性された鎖は、相補的配列を有する別のヌクレオチド鎖とのみ再会合する。
【０００３】
分子数の非常に少ないＤＮＡを検出するための方法を見い出すため、多大な研究が行われてきた。検出のために被検体中の核酸数を増幅する又は大幅に増やす各種の手法が知られており、ほぼ１０年間にわたり用いられている。このような増幅技法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、その他開発の遅れている方法が含まれる。
ＰＣＲ法が最もよく知られている方法であって、ＤＮＡ重合剤とデオキシリボヌクレオシド三リン酸を存在させた適当な条件下で標的核酸の鎖にプライマーをハイブリダイズさせる工程を含む。複数回のサイクルを通してプライマー伸長生成物が形成され、最初の標的鎖の数が指数的に増加することになる。ＰＣＲに関する詳細は、米国特許出願第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されている。
【０００４】
ヒトや動物の被検体は、多種多様な核酸を含有し、ヒトや動物に内因する（又は天然の）ものもあれば、感染性因子や発ガン性条件といった異常な条件が原因となって発生するものもある。通常、こうした核酸は、内因性の核酸よりも非常に低濃度で存在する。これらを「コピー数の少ない」核酸と呼ぶことがある。対照的に、内因性の核酸は高濃度で存在することが普通であり、これらを「コピー数の多い」核酸と称する場合がある。このような核酸の一例として、ヒトβ−グロブリンＤＮＡが挙げられる。
【０００５】
ＰＣＲ法を実施すると、被検体中に存在する２種以上の核酸が同じ反応容器内で同時に増幅されることがよくある。このことを本明細書では「同時増幅」と称することとする。この方法では、増幅すべき核酸の各々に対するプライマーを容器内に同時に存在させなければならない。
このような状況下でコピー数の少ない標的核酸とコピー数の多い標的核酸を共に増幅させると、往々にしてコピー数の少ない標的核酸の増幅が阻害される。この原因は、増幅サイクルの後の方でコピー数の多い標的核酸によって増幅酵素（例、ＤＮＡポリメラーゼ）が飽和するためである。コピー数の少ない標的核酸の存在については偽陰性という結論になりやすく、重大な結果をもたらす恐れがある。
【０００６】
こうしたＰＣＲにまつわる問題に対しては、プライマー濃度を調節する方法、特殊な融解温度（Ｔ_m ）を示すプライマー組を使用する方法、或いはこれらを組み合わせた方法をはじめとする様々な解決策が提案されている。プライマー比率を調節する方法を当該技術分野ではＰＣＲ収率を「プライマーバイアスする」と呼び、コピー数の多い標的核酸に対するプライマー濃度を低下させる必要がある。この方法では、プロセスを適当にしか制御することができない。
【０００７】
別の同時増幅方法は、コピー数の多い標的核酸に対するプライマーがコピー数の少ない標的核酸に対するプライマーよりもアニールの程度が低くなるように、ＰＣＲにおけるアニーリング温度を調節する方法である。この方法にも問題がある。プライマー対の間のＴ_m 差が比較的大きくなければ、コピー数の多い標的核酸とコピー数の少ない標的核酸との収率の差に基づいてＰＣＲを良好に変調することはできない。正確なＴ_m を（概算は可能であるが）計算することはできないため、これを測定する必要がある。これは多大な労力を要し、大変である。
【０００８】
これらの同時増幅を変調するための方法は、いずれもコピー数の多い標的核酸とコピー数の少ない標的核酸の配列が知られていることが必要である。
別法として、ＰＣＲの後の方のサイクルにおけるプライミング工程又は伸長工程の時間を延長することによって、コピー数の多い標的核酸によるＤＮＡポリメラーゼの飽和を最小限に抑え、増幅効率を向上させることができる。しかしながら、この解決策は、様々な濃度で存在する多種多様な核酸が同時に増幅される状況でしか有用ではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
１種以上のコピー数の多い標的核酸の存在下で同時増幅させた場合に１種以上のコピー数の少ない標的核酸を迅速且つ効率的に増幅できる方法が望まれる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記の問題は、２種以上の標的核酸を同時増幅する方法において、
（１）毎回約２０〜約３６０秒間を要する少なくとも１５回の一次増幅サイクルであって、各サイクルが下記工程Ａ〜Ｃ：
Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生成物の反応混合物であって、前記標的核酸の少なくとも１種がコピー数の少ない標的核酸であり且つ前記標的核酸の他の少なくとも１種が前記コピー数の少ない標的核酸の約１０００倍以上の濃度で存在するものと予想されるコピー数の多い標的核酸である反応混合物を加熱する際に、前記コピー数の多い標的核酸及びコピー数の少ない標的核酸又はそれらのプライマー伸長生成物の鎖を変性するために約８５〜約１００℃の第一温度Ｔ₁ に加熱する工程、
Ｂ）（Ｔ_mH−１５）℃≦Ｔ₂ ≦（Ｔ_mH＋５）℃
〔式中、Ｔ_mHはコピー数の多い標的核酸に対するプライマーの融解温度である〕で規定される第二温度Ｔ₂ まで冷却することによって、増幅すべき各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズすることができる一組のプライマーで前記変性された鎖をプライミングする工程、及び
Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
（Ｔ_mH−１５）℃≦Ｔ₃ ≦（Ｔ_mH＋１５）℃
で規定される第三温度Ｔ₃ でのインキュベーションによって、ＰＣＲ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成する工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸長生成物形成工程とを同一工程において実施する場合にはＴ₂ とＴ₃ は同じとする〕、
を逐次工程として含む一次増幅サイクル、並びに
（２）毎回約２０〜約３６０秒間を要する少なくとも５回の二次増幅サイクルであって、前記工程Ａ〜Ｃを逐次反復する各二次増幅サイクルにおける工程Ａと工程Ｂとの間に、反応混合物を、
（Ｔ_mH＋５）℃≦Ｔ₄ ≦Ｔ_PH
〔式中、Ｔ_PHは前記コピー数の多い標的核酸の二本鎖の融解温度である〕で規定される第四温度Ｔ₄ まで冷却して該温度で約１５〜約１２０秒間維持する二次増幅サイクル
を含む核酸の同時増幅方法によって解決された。
【００１１】
本発明は、特にコピー数の少ない標的核酸のシグナルを不鮮明にしかねないコピー数の多い標的核酸が存在する場合に、コピー数の少ない標的核酸を優先的に増幅し且つ検出するための非常に迅速で効率のよい方法を提供するものである。このように、コピー数の少ない標的核酸の増幅がコピー数の多い標的核酸によって阻害されることが低減される。
【００１２】
これらの利点は、特定の回数の増幅サイクル（本明細書では「一次サイクル」と称する）の後、続くサイクル（本明細書では「二次サイクル」と称する）における各変性工程の後に短時間で増幅生成物が復元又はハイブリダイズするように、増幅プロセスの後のサイクルに復元工程を含めることによって達成される。この復元工程は、変性生成物の相補鎖が容易に復元又はハイブリダイズできる温度において行われる。しかしながら、その温度は、コピー数の多い標的核酸のプライマーが変性された増幅生成物の相補鎖に効率的にアニールする温度よりも高い温度に維持される。復元工程には十分な時間が当てられ、プライミングや続く増幅に有効なコピー数の多い標的核酸の濃度を低下させる。このため、より多くのＤＮＡポリメラーゼが利用できるので、後のサイクルにおいてコピー数の少ない標的核酸をより効率的に増幅させることができる。
【００１３】
ポリメラーゼ連鎖反応を利用して核酸を増幅及び検出するための一般原理及び条件についてはよく知られている。その詳細については、米国特許出願第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，１８８号明細書（上記）をはじめとする多くの文献に記載されており、本明細書ではそのすべてを参照することにより取り入れることとする。当該技術分野における教示と本明細書に記載した特別な教示とを鑑みれば、当業者であれば本明細書に記載に従い本発明を実施して、一方がコピー数の少ない標的核酸である２種以上の核酸を同時増幅することは容易である。
【００１４】
本発明の実施に採用することができる他の増幅方法として、例えば欧州特許出願公開第０ ３２０ ３０８号公報（１９８７年１２月公開）及び同第０ ４３９ １８２号公報（１９９０年１月公開）に記載のリガーゼ連鎖反応、及び生成物の変性工程を含む他のすべての周知の増幅方法が挙げられる。こうして、本明細書に記載の教示によれば、当業者であれば、ＰＣＲについて示した復元修正を上記の他の既知の増幅方法へ適合させることは可能である。本明細書の残部は、例示を目的として、ＰＣＲによる本発明の実施について説明するものである。
【００１５】
本発明は、被検体中の１種以上のコピー数の少ない標的核酸中に存在する１種以上の特異的核酸配列を、１種以上のコピー数の多い標的核酸中に存在する１種以上の核酸配列を同時に増幅させながら、増幅し検出することに関する。一般に、被検体中に存在するコピー数の少ない標的核酸の量は約１０^-16 モル未満であるが、しかしながら、その量は、コピー数の多い標的核酸がはるかに多量に、例えば１０００倍以上の濃度で、存在する場合には、さらに多くなることがある。一般に、コピー数の多い標的核酸は単コピー遺伝子に関連したものであるが、コピー数の少ない標的核酸はヒトや動物における感染性因子、ガン、その他病理状態に関連したものである。
【００１６】
さらに、アッセイではコピー数の多い標的核酸を「陽性対照」として使用することができる。コピー数の多い標的核酸のＰＣＲ効率を変調することにより、ＰＣＲが効率的に行われた場合にのみ陽性対照は検出可能となるので、偽陰性の可能性が低下する。このような場合、コピー数の多い標的核酸は、コピー数の少ない標的核酸の１０倍以上の濃度で存在することができる。
【００１７】
被検体は、細胞、ウイルス、毛髪、体液又は検出可能な遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する他の材料であることができる。標的核酸は、プラスミドや、（細菌、酵母、ウイルス、植物、高等動物又はヒトなどの）何らかのソースから得られる天然ＤＮＡ又はＲＮＡをはじめとする様々なソースから得ることができる。それは、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、他の組織材料又は当該技術分野で知られている他のソースをはじめとする様々な組織から周知の方法で抽出されることができる。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌若しくはウイルスに感染された細胞中のＤＮＡ若しくはＲＮＡに存在する核酸配列の同時増幅及び検出に特に有用である。さらに、本発明を利用して、癌マーカーに係わる核酸配列を増幅し検出することも可能である。
【００１８】
検出可能な細菌には、ヒトの血液中にある細菌、サルモネラ種、クラミジア種、淋菌種、シゲラ種及びマイコバクテリウム種が含まれるが、これらに限定はされない。検出可能なウイルスには、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス並びにＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−ＩＩのようなレトロウイルスが含まれるが、これらに限定はされない。原生動物の寄生虫、酵母及びカビもまた検出可能である。当業者であればその他の検出可能な種は明らかである。本発明は、レトロウイルス（ＨＩＶ−ＩやＨＩＶ−ＩＩ）又はマイコバクテリウム種に関連したＤＮＡの存在を検出するのに特に有用である。本発明を、ＨＩＶ−Ｉに関連したＤＮＡの検出に使用することが最も好ましい。
【００１９】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必要と考えられるすべての試薬、すなわち、各標的核酸の対向鎖に対する一組のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡポリメラーゼコファクターと、２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸（ＮＴＰ）とを意味する。
「プライマー」とは、核酸鎖（すなわち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合にその合成開始点として作用しうる天然の又は合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件には、他のＰＣＲ試薬の存在並びに好適な温度及びｐＨが含まれる。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成を引き起こすに十分な長さを有する必要がある。各プライマーの正確なサイズは、使用法、標的配列の複雑さ、反応温度及びプライマーの出所によって変わる。一般に、本発明で用いられるプライマーは、ヌクレオチドを１０〜６０個有するものである。
【００２０】
プライマーは、多数の出所から入手すること、或いは、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍより入手可能）又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ ８６００シリーズ若しくは８８００シリーズの合成機（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社より入手可能）をはじめとする周知の技法及び装置並びにそれらの使用方法（例えば、上記の米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記載されている）を利用して合成することができる。また、生物学的ソースから単離された天然のプライマー（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）も有用である。一般には、各標的核酸に対し、少なくとも２種のプライマーからなる一組が用いられる。こうして、複数組のプライマーを同時に使用し、複数種の標的核酸を増幅することができる。さらに、一組のプライマーが、ある特定の標的核酸に対するプライマー混合物を含むこともできる。
【００２１】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーに対してホスホジエステル結合することにより、デオキシヌクレオシド一リン酸分子をエステル化しこれをプライマーの３’−ヒドロキシ末端に付加する酵素としてよく知られいる。この合成は鋳型依存性である。有用なＤＮＡポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、逆転写酵素、その他当該技術分野で知られているものが含まれる。
【００２２】
ＤＮＡポリメラーゼは、「耐熱性」であることが好ましい。耐熱性とは、ＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温において一般に安定であることを意味する。より詳細には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いられる高温において実質的には不活性化されない。このような温度は、ｐＨ、塩濃度、その他当該技術分野で知られている条件をはじめとする幾つかの反応条件によって変わる。
【００２３】
当該技術分野では幾つかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが報告されており、米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書（上記）及び同第４，８８９，８１８号明細書（Ｇｅｌｆａｎｄら）に詳細に記載されているものが含まれるが、本明細書ではこれらを参照することにより取り入れることとする。特に有用なポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ細菌種から得られるものであって、例えばＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ又はＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られるＤＮＡポリメラーゼである。他の有用な耐熱性ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ．及び国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−８９／０６６９１号公報（１９８９年７月２７日公開）に記載されているものをはじめとする他の様々な微生物源から得られる。有用な酵素の中には市販されているものもある。生物から天然のポリメラーゼを単離するための技法がいくつか知られている。また組換え技術によるポリメラーゼを調製するためのクローニング法やその他の合成法も、Ｇｅｌｆａｎｄらの特許をはじめとする先に引用した技術文献から知られている。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼコファクターとは、酵素活性に影響を与える非タンパク質化合物をさす。当該技術分野では、マンガン塩やマグネシウム塩をはじめとするこのような物質がいくつか知られている。有用なコファクターとして、マンガン及びマグネシウムの塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩が含まれるが、これらに限定はされない。塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。最も好ましい塩は塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウムである。
【００２５】
ＰＣＲにはまた、２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰのうちの２種以上が必要である。ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰのようなアナログも有用である。ＰＣＲでは、通常の４種類の三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を使用することが好ましい。
【００２６】
本発明の実施には、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体であって、約５０℃未満の温度では該酵素活性を阻害するがより高温では自身が不活性化される抗体も有用である。このような特性を有する代表的なモノクローナル抗体が、最近特許された米国特許出願第０７／９５８，１４４号明細書（Ｓｃａｌｉｃｅら、１９９２年１０月７日出願）に記載されており、本明細書ではこれを参照することにより取り入れることとする。分子全体の代わりに抗体フラグメントを使用してもよい。
【００２７】
本明細書に記載したＰＣＲ試薬は、ＰＣＲにおいて標的核酸を増幅するのに適した濃度で提供され且つ用いられる。ＤＮＡポリメラーゼの最少量は、溶液１００μｌ当たり、一般に約１単位以上、好ましくは約４〜約２５単位である。ここで「単位」とは、７４℃において伸長している核酸中へ３０分間で１０ナノモルの全ヌクレオシド（ｄＮＴＰ）を取り込ませるに必要な酵素活性量として定義される。各プライマーの濃度は約０．０７５μモル以上であり、中でも約０．１〜約２μモルが好ましい。複数種のプライマーが、同じ量で存在しても異なる量で存在してもよい。各標的核酸に対する各プライマー組のプライマーは、反応混合物中に最初は同じ量で存在することが好ましい。反応混合物中、ＤＮＡポリメラーゼコファクターは一般に約１〜約１５ミリモルの量で存在し、また各ｄＮＴＰは一般に約０．１５〜約３．５ミリモルの量で存在する。
【００２８】
ＰＣＲ試薬は、個別に供給しても、また適当な何らかの緩衝液を用いてｐＨを約７〜約９にした緩衝化溶液として供給してもよい。こうして、ＰＣＲの反応混合物は、コピー数の少ない標的核酸に対する一組のプライマーと、コピー数の多い標的核酸に対する一組のプライマーと、適当なｄＮＴＰと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、該ＤＮＡポリメラーゼのためのコファクターと、そして標的核酸の増幅やその後の検出に有用であると考えられる他の何らかの添加物とを含む。
【００２９】
上記のように、標的核酸は様々な出所源から得られる。一般に、標的核酸は、プライマー、その他の反応物質との接触に利用できるように何らかの方法で抽出されなければならない。このことは、通常、望ましくないタンパク質や細胞物質を被検体から適当な方法で除去することを意味する。当該技術分野では、ＬａｕｒｅらのＴｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，ｐｐ．５３８−５４０（１９８８年９月３日）、ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）、Ｇｒｏｓｓ−ＢｅｌｌａｎｄらのＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６，３２（１９７３）及び米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書（上記）に記載されているものをはじめとする様々な方法が知られている。全血又はその成分からＤＮＡを抽出する方法については、例えば、欧州特許出願公開第０ ３９３ ７４４号公報（１９９０年１０月２４日公開）、ＢｅｌｌらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８（９），ｐｐ．５７５９−５７６３（１９８１）、ＳａｉｋｉらのＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，ｐｐ．１００８−１０１２（１９８５）及び米国特許出願第５，２３１，０１５号明細書（Ｃｕｍｍｉｎｓら）に記載されている。本発明の実施では、特定の抽出法が重要となることはない。
【００３０】
通常、増幅や検出されるべき標的核酸は二本鎖形にあるため、この二本鎖が分離（すなわち、変性）されなければプライミングは起こらない。プライミングは、抽出工程中に行うことができるが、好ましくはその後の別工程で行う。好ましい変性手段は、好適な温度（本明細書では「第一温度」又はＴ₁ と称する）に加熱することである。一般に、この第一温度は、適当な時間、例えば１〜約２４０秒間（好ましくは１〜約４０秒間）、約８５℃〜約１００℃の範囲とする。この初期変性工程を最初の増幅サイクルに含めてもよい。このような場合には、最初のサイクルにおける変性をより長時間（例えば、最長で２４０秒間）とし、その後のサイクルでは変性を短時間（例えば、最長で３０秒間）としてもよい。
【００３１】
次いで、変性された鎖を、適当な組合せのプライマーを用いて、その反応混合物を一般に約５５〜約７０℃の範囲にある第二温度Ｔ₂ へ冷却することによりプライムする。冷却はできるだけ迅速に行うことが望まれるが、現存の装置では、一般には約５〜約４０秒間で、より好ましくは約５〜約２０秒間で行われる。好ましくは、Ｔ₂ は以下の式で規定される。
（Ｔ_mH−１５）℃≦Ｔ₂ ≦（Ｔ_mH＋５）℃
式中、Ｔ_mHはコピー数の多い標的核酸に対するプライマーの融解温度である。
【００３２】
変性された鎖を冷却したら、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を第三温度Ｔ₃ において、一般には１〜約１２０秒間、好ましくは１〜約８０秒間インキュベートし、プライマー伸長生成物を形成させる。一般に、第三温度は以下の式：
（Ｔ_mH−１５）℃≦Ｔ₃ ≦（Ｔ_mH＋１５）℃
で規定されるが、一般には約５５〜約７０℃、好ましくは約６２〜約６８℃の範囲にある。
【００３３】
最も好ましい実施態様では、第二温度と第三温度を同じにし、そして約６２〜約６８℃の範囲とする。こうして、プライミングとプライマー伸長を、同じ工程で行うことが好ましい。
【００３４】
コピー数の多い標的核酸に対する各プライマーは、本明細書でＴ_mHと表示した融解温度を有する。通常、Ｔ_mLとＴ_mHの差は０〜約８℃であり、そしてＴ₂ とＴ₃ はどちらもＴ_mL若しくはＴ_mHよりも低いか又はＴ_mL若しくはＴ_mHのいずれかに等しいことが普通である。
【００３５】
本明細書で規定する融解温度は、プライマーの半分が（鋳型のような）相補鎖から変性される温度である。この融解温度の測定は、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第２版、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９７０，ｐｐ．８７６−７）に記載されているように２６０ｎｍにおけるスペクトルをモニターすることによって、紫外線淡色効果に基づくいくつかの標準方法で実施することができる。融解温度の測定方法が異なると、同じＤＮＡ分子でもその値に若干の差が生じることはあるが、これらの値が約２〜３℃よりも大きく変動することはまずない。その上、融解温度を測定するための方法が一定であれば、Ｔ_mLとＴ_mHの差が変動することはない。
【００３６】
融解温度は以下の式を用いて計算されることが好ましい。
Ｔ_m （℃）＝６７．５＋０．３４（％Ｇ＋Ｃ）−３９５／Ｎ
上式中、ＧとＣは、オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー）における、それぞれグアニンとシトシンのヌクレオチド数を表し、Ｎは全ヌクレオチド数を表す。この計算式で得られる融解温度の値は、常用のＵＶ淡色効果と常用のＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ製ダイオードアレイ分光光度計（走査速度約＋１℃／分）を用いて、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及びその他当業者であれば容易に想到するもののような無機塩や有機塩をイオン強度約２０ミリモル以上で有する１０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．５）にプライマーを含む溶液について室温で実験的に求めた値とよく相関する。上記融解温度式を決めるために用いられた溶液中でのプライマーとその相補体の量は、約０．５〜約１．０のＯＤ単位の光学濃度を与えるに十分な量とした。
【００３７】
こうして、「一次」増幅サイクルは、変性工程、プライミング（又はアニーリング）工程及びプライマー伸長工程を含む。一般に、本発明の実施では、このような一次増幅サイクルを１５回以上行うが、そのサイクルの最大回数についてはユーザーの裁量に任される。たいていは、１５〜３５回の一次増幅サイクルが行われ、２５回のサイクルが好適である。一次増幅サイクルの各サイクルは、一般に約２０〜約３６０秒、好ましくは約３０〜約１２０秒、より好ましくは約３０〜約９０秒のサイクル時間で行われる。しかしながら、所望により、さらに長時間又は短時間のサイクル時間を採用してもよい。
【００３８】
上記の少なくとも１５回の一次増幅サイクルの後に、同じ工程を有するが、但し各変性工程後に復元工程を導入してからプライミング工程を行う、次の又は「二次」増幅サイクルを実施する。
【００３９】
復元工程は、反応混合物を以下に規定される第四温度Ｔ₄ に冷却することによって行われる。
（Ｔ_mH＋５）℃≦Ｔ₄ ≦Ｔ_PH
式中、Ｔ_PHは、検出されるコピー数の多い標的核酸の二本鎖の融解温度である。一般に、Ｔ₄ は約６５〜約９０℃である。Ｔ₄ に到達させるのに要する時間はできるかぎり短くするが、最長で約４５秒間かけてもよい。また、上記温度は約１５〜約１００秒間維持することができる。
【００４０】
この方法では少なくとも５回の二次増幅サイクルを採用するが、その上限回数はユーザーの裁量に任される。この二次増幅サイクルは５〜２０回が好ましく、また１５回のサイクルが最も好ましい。二次増幅サイクルの各サイクルに要する時間は約２０〜約３６０秒である。好ましいサイクル時間は約３０〜約１２０秒である。
【００４１】
本出願明細書において、ある特定の工程に対する時間に用語「約」を付した場合は、その限界値について±１０％の幅があることを意味する。温度に用語「約」を付した場合には、±５℃の幅があることを意味する。
【００４２】
増幅生成物の復元のような核酸のハイブリダイゼーション反応の速度論は、ハイブリダイズされる核酸の濃度に比例する。それゆえ、増幅生成物の濃度が、例えば１０倍に増加すると、ハイブリダイゼーションの速度も１０倍に増加する（すなわち、復元に対するｔ_1/2 が１０分の１に短縮される）。ハイブリダイゼーションの前進速度定数を５×１０⁶ モル^-1秒^-1と仮定すると、生成物濃度１０^-8モルにおけるｔ_1/2 は約１４秒、また生成物濃度１０^-9モルにおけるｔ_1/2 は約１４０秒となる。
【００４３】
後のサイクルにおいて、コピー数の多い生成物の有効Ｔ_m （融解温度）以下の温度ではあるが、増幅反応に用いられているプライマーの有効Ｔ_m よりも数度高い温度での生成物復元工程を導入することによって、濃度に依存した様式において増幅生成物の復元が可能となる。二次増幅サイクルの比較的短時間の復元工程は、コピー数の少ない標的核酸のプライミング効率には実質的な影響を及ぼすことはないが、コピー数の多い標的核酸のプライミングを低下させる。
【００４４】
本発明の増幅法は、所望の回数について制御された様式で反応混合物の温度を周期変動させるように自動化された連続様式で実施することが好ましい。このために開発された装置がいくつかあり、当業者であれば周知である。また、復元工程やその後増幅サイクルの再開についてプログラム可能な装置を使用することも好ましい。
【００４５】
この目的のための装置の一つが、米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書及び欧州特許出願公開第０ ２３６ ０６９号公報にかなり詳しく記載されている。一般に、この装置は、反応混合物を含有する複数の反応管を保持するための熱伝導性容器と、加熱手段と、冷却手段と、温度維持手段と、増幅配列、温度及びタイミングの変化を制御するための信号を発生する計算手段とを含む。
【００４６】
欧州特許出願公開第０ ４０２ ９９４号公報は、米国特許出願第５，０８９，２３３号明細書（Ｄｅｖａｎｅｙら）に記載された装置を用いて処理することができる有用な化学試験パックについて詳細に記載しており、本明細書ではこれを参照することにより取り入れることとする。その中には、本発明の方法に適した反復インターバルで（すなわち、サイクルにより）その試験パックを加熱／冷却するための手段についても記載されている。有用なＰＣＲ処理装置に関するさらなる詳細は、当該技術分野の重要な文献から入手することができ、当業者であれば容易に確認することができる。
【００４７】
上記の化学試験パックの他、本発明の方法は、米国特許出願第４，９０２，６２４号明細書（Ｃｏｌｕｍｂｕｓら）、同第５，１７３，２６０号明細書（Ｚａｎｄｅｒら）、同第５，２２９，２９７号明細書（Ｓｃｈｎｉｐｅｌｓｋｙら）に詳細に記載されているような他の容器、及び当業者であれば明白なその他の適当な容器においても実施することができる。本明細書ではこれらを参照することにより取り入れることとする。
【００４８】
増幅生成物の検出は、当該技術分野で周知のように、米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書（上記）に記載されているサザンブロッティング法や、標識されたプローブ又はプライマーを利用して行うことができる。
【００４９】
上記実施態様の別法として、増幅生成物を、そのプライマー伸長生成物の一方に対して相補的である標識されたオリゴヌクレオチドを用いて検出することもできる。オリゴヌクレオチドに標識を付与する方法については周知である。有用な標識には、酵素、フェリチン、その他磁性粒子、放射性同位元素、化学発光試薬（例、ルミノール）、ビオチン並びに各種蛍光助剤及び発色助剤が含まれる。有用な酵素標識には、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼが含まれる。各種標識用の基質や色素提供試薬、例えば酵素、についても周知である。
【００５０】
好ましい実施態様では、検出用に酵素標識（例、ペルオキシダーゼ）を使用し、そしてその標識により色素又は発光を提供する適当な組成物を使用する。例えば、特に有用な比色定量用色素提供システムが米国特許出願第５，０２４，９３５号明細書（ＭｃＣｌｕｎｅら）に記載されている。その後、裸眼又は適当な分光光度計若しくはルミノメーターによって検出する。
【００５１】
また、この方法に用いられる各プライマー組のプライマーの一方を、特異的結合性部分で標識することも可能である。この部分は、各種プライマーについて同じであっても異なってもよく、またその部分と特異的に反応する特異的結合性レセプターが存在するためのいずれの分子を含むこともできる。特異的結合性対（その一方が標識となりうる）の例として、ストレプトアビジン／ビオチン、糖類／レクチン、抗体／ハプテン、抗体／抗原、その他当業者であれば自明のもの、が挙げられる。その後、酵素、放射性同位元素又はその他上記のもののようなオリゴヌクレオチドを検出できる適当な標識部分とレセプター分子とを複合化させる。
【００５２】
各プライマー組の一方又は両方のプライマーをビオチン（又はその等価な誘導体）で標識し、そして増幅生成物を、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素とストレプトアビジンとの複合体を用いて検出する方法がより好ましい。
【００５３】
本発明の不均質検出系では、増幅生成物を何らかの水不溶性支持体表面に捕捉し、そして反応混合物中の他の物質を適当な方法、例えば、濾過、遠心分離、洗浄、その他の分離方法、によって除去する。
【００５４】
捕捉プローブは、周知の結合技法（吸収反応や共有反応を含む）によって、水不溶性の支持体に結合させることができる。このような技法の一つが、欧州特許出願公開第０ ４３９ ２２２号公報（１９９１年９月１８日発行）に記載されている。その他の方法が、例えば、米国特許出願第４，７１３，３２６号（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら）、同第４，９１４，２１０号（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら）及び欧州特許第０ ０７０ ６８７号（１９８３年１月２６日発行）に記載されている。有用な分離手段には、Ｐａｌｌ社より市販されているポリアミド微多孔質膜のような膜による濾過が含まれる。
【００５５】
しかしながら、捕捉プローブ及び最終的なハイブリダイゼーション生成物を係留するためには、マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、磁性又は高分子粒子、金属、セラミックス、ガラスウール、等をはじめとする有用ないずれの固体支持体でも使用することができる。特に有用な材料は、捕捉プローブを共有結合させるのに有用な反応性基を有する磁性粒子又は高分子粒子である。このような粒子の大きさは一般に約０．００１〜約１０μｍである。このような材料の例については、米国特許出願第４，９９７，７７２号（Ｓｕｔｔｏｎら）、同第５，１４７，７７７号（Ｓｕｔｔｏｎら）、同第５，１５５，１６６号（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら）及び同第４，７９５，６９８号（Ｏｗｅｎら）の明細書に詳細に記載されており、本明細書ではこれらを参照することにより取り入れることとする。
【００５６】
捕捉プローブは、高分子フィルム、膜、濾紙又は樹脂被覆紙若しくは未被覆紙のような平坦な支持体に結合させてもよい。高分子粒子に結合された捕捉プローブを、このような平坦な支持体の表面に、乾燥付着、加熱融合、接着剤、等の適当な方法で固定化することもできる。このような材料のその他の詳細については、欧州特許出願公開第０ ４０８ ７３８号（１９９１年１月２３日発行）、国際特許出願公開第ＷＯ９２／１６６５９号（１９９２年１０月１日発行）及び米国特許出願第５，１７３，２６０号（Ｓｕｔｔｏｎら）の明細書に記載されている。
【００５７】
捕捉プローブは、適当な支持体表面に、例えば、列状の丸い付着物や縞状など、いずれの形状で配置されていてもよい。
【００５８】
以下の実施例は、本発明の実施を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。特に断らない限り、パーセントはすべて重量基準とした。
【００５９】
【実施例】
実施例についての材料および方法
実施例で用いたプライマーは、以下の配列を有するものとした。最初の２種はＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのｇａｇ領域に相補的であり、次の２種はβ−グロブリン ＤＮＡに相補的である。
配列番号：１： ５′-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-３′
配列番号：２： ５′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-３′
配列番号：３： ５′-X-CAACTTCATC CACGTTCACC- ３′
配列番号：４： ５′-ACACAACTGT GTTCACTAGC- ３′
【００６０】
前記プライマー中、Ｘは、米国特許第 4,962,029号明細書（Levensonら）に記載された技法を用いて、２つのアミノテトラエチレングリコール・スペーサー基を介してオリゴヌクレオチドに付加された（ＤｕＰｏｎｔ社製のビオチンホスホラミダイト由来の）ビオチニル部分を表す。
実施例で用いた捕捉プローブは、以下の配列を有するものとした。第一はＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ用であり、第二はβ−グロブリン ＤＮＡ用である。

【００６１】
「Ｙ」は、米国特許出願第４，９１４，２１０号明細書（Levensonら）の教示に従い単一のアミンジオール結合基に結合された２個のテトラエチレングリコールスペーサーを表す。
【００６２】
プライマー及び捕捉プローブは、既知の出発物質と手順を採用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ、３本カラム式ＤＮＡ合成機、標準ホスホラミダイト化学法及びＡＢＩ１μモルスケールの高速サイクルプロトコールによって調製した。ヌクレオシド−３’−ホスホラミダイト及びヌクレオシド誘導化制御細孔ガラス支持体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。すべての精製は、核酸用精製カラムと続いて逆相ＨＰＬＣ技法によって行った。
【００６３】
捕捉プローブを形成するため、これらのプローブを、従来の乳化重合法を用いてポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比95:5、平均直径１μｍ）から調製したポリマー粒子（平均直径１μｍ）に共有結合させた。粒子を水に懸濁させた懸濁液を、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ 0.1モル，pH６）で洗浄し、そして固形分が約10％となるように懸濁させた。洗浄した粒子の試料（ 3.3mL）を希釈して、緩衝液中固形分が3.33％（ 0.1モル）となるようにし、それを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（2.1mL, 84mg/mL, 水で調製）およびプローブ（ 983μＬ， 44.44OD/mL,ナノ純水で調製）と混合させた。得られた懸濁液を水浴中50℃で約２時間断続的に混合しながら加熱し、そして遠心分離した。次いで、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.0001モル）を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（0.01モル，pH８）で粒子を３回洗浄し、そしてそれに再懸濁して固形分４％となるようにした。
【００６４】
米国特許出願第４，９４８，５６１号明細書（Ｈｉｎｃｋｌｅｙら）に詳細に記載されているように、緩衝液を用いて固形分０．２５％にまで希釈した捕捉試薬（１．２μｌ）を、ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）ディスポーザブル試験素子（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ社製）のテストウェルにおいて微多孔質膜（ＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（商品名）ポリアミド膜、平均孔径５μｍ、Ｐａｌｌ社製）の画定された領域に適用して乾燥させた。
【００６５】
ＰＣＲは、米国特許第５，０８９，２３３号明細書（本明細書ではこれを参照することにより取り入れることとする）に詳細に記載されている自動化されたＫｏｄａｋ ＰＣＲ処理装置を用い、以下の実施例に記載した加熱及び冷却プロトコールに従い実施した。
【００６６】
サーマス・アクアティクス（ Thermus aquaticus ）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼは、従来の方法を用いて入手した。
グリセロール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及びｄＮＴＰは、Sigma Chemicalより入手した。
【００６７】
常用の方法により８Ｅ５／ＬＡＶ細胞系統からコピー数の少ない標的ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡを抽出した。細胞を溶解しタンパク質を消化した後、そのＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法で精製した。すなわち、細胞懸濁液にトリス飽和フェノール（７５０μｌ）を加え、そしてフェノール／溶解物液を混合して遠心分離法で分離した。次いで、その水相を新しい２ｍｌのチューブに移した。この手順をクロロホルムイソアミルアルコールを用いて繰り返した。その水層を０．３モル酢酸ナトリウムにした。９５％のコールドエタノールを加えて−７０℃で１時間保存することにより核酸を析出させた。次いで、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡの濃度をＡ₂₆₀ において測定し、そして実験用として、ＴＥ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１ミリモル）及び（エチレンジニトリロ）四酢酸（０．１ミリモル）〕においてコピー数の異なる一連の希釈液を調製した。
【００６８】
コピー数の多いβ−グロブリン ＤＮＡは、１細胞当たり２コピーのβ−グロブリン遺伝子を有すると考えられるヒト胎盤ＤＮＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）において得られた。
【００６９】
ロイコ色素分散体は、アガロース（ 0.5％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール・ロイコ色素（ 250マイクロモル）、ジエチレントリアミン五酢酸（ 100マイクロモル）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）、ポリビニルピロリドン（ 112ミリモル）およびリン酸ナトリウム，一塩基性，一水和物（10ミリモル）を含むものとした。
【００７０】
実施例で用いたコンジュゲート溶液は、市販のストレプトアビジンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート（Zymed Laboratories社）（ 126μL/L ）、カゼイン（ 0.5％）およびメルチオレート（ 0.5％）をリン酸緩衝塩化ナトリウム水溶液（リン酸ナトリウム２４ミリモル及び塩化ナトリウム７５ミリモル）に含むものとした。コンジュゲートの最終濃度は３１２ｎｇ／ｍｌであった。
【００７１】
実施例で用いた洗浄溶液は、塩化ナトリウム（ 373ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（ 2.5ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（38ミリモル）及びエチル水銀チオサリチル酸，ナトリウム塩（25マイクロモル）を、リン酸ナトリウム，一塩基性，一水和物緩衝液（25ミリモル，pH7.4 ）に含むものとした。
【００７２】
反応混合物には「ＴＰ４」モノクローナル抗体を使用した。この抗体は、サーマス・アクアティクス（ Thermus aquaticus ）由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的なものであって、最近特許された米国特許出願第０７／９５８，１４４号明細書（上記）に詳細に記載されている。
【００７３】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物（１００ｍｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各１．５モル）、プライマー（各々０．４又は１μモル）、ゼラチン（０．０１％）、上記ＤＮＡポリメラーゼ（１００μｌ当たり４又は１６単位）並びに「ＴＰ４」モノクローナル抗体（ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比５０：１）を含むものとした。
【００７４】
残りの試薬および材料は、市販のものを使用したか、または従来の方法を用いてEastman Kodak 社で調製した。
実施例１及び２：増幅したＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡの検出
これらの実施例は、コピー数の多い標的核酸のβ−グロブリン ＤＮＡの存在下でコピー数の少ない標的核酸のＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡを同時増幅して検出する本発明を例示するものである。
【００７５】
上記のＰＣＲ反応混合物は、コピー数５又は１０のＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡと、コピー数約１００万のβ−グロブリン ＤＮＡと、各種量のＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー（各プライマー組の各プライマーにつき０．４又は１マイクロモル）とを含むものとした。
【００７６】
対照用のＰＣＲプロトコールは４０回の増幅サイクルを含み、各サイクルは以下の通りとした。
１）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒間）加熱して変性させる。
２）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）及び伸長させる。
【００７７】
本発明のＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。
１）２５回の一次増幅サイクル。各サイクルは以下の通り。
Ａ）９５℃で１５秒間（最初のサイクルのみ１９５秒間）加熱して変性させる。
Ｂ，Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）及び伸長させる。
２）１５回の二次増幅サイクル。各サイクルは以下の通り。
Ａ）９５℃で１５秒間加熱して変性させる。
Ａ’）７５℃で１５秒間（実施例１）又は３０秒間（実施例２）加熱する。
Ｂ，Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）及び伸長させる。
【００７８】
第一組のアッセイを、反応混合物中に１００μｌ当たり１６単位のＤＮＡポリメラーゼとコピー数１０のＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡを用いて実施した。第二組のアッセイを、反応混合物中に１００μｌ当たり４単位のＤＮＡポリメラーゼとコピー数５のＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡを用いて実施した。
【００７９】
増幅生成物の検出は、以下の方法で行った。最終増幅反応混合物の一部（５μｌ）を、緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１％）〕（９５μｌ）と混合し、９５℃で５分間インキュベートし、核酸を変性させた。次いで、得られた溶液をＳＵＲＥＣＥＬＬ（商品名）試験素子に移し、増幅された標的核酸を捕捉プローブに５０℃でハイブリダイズできるようにした。
【００８０】
次いで、試験素子のテストウェルを、緩衝液〔リン酸二水素ナトリウム（１０ミリモル）、塩化ナトリウム（１５０ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（１％）及びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル）〕（２５０μｌ、ｐＨ７．４）を用いて５５℃で洗浄した。室温で、上記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート液（５０μｌ）を各テストウェルに加えてその膜を透過させた。２分後、テストウェルを２回洗浄した。
【００８１】
上記のロイコ色素分散液（１００μｌ）を各テストウェルに加え、そしてその素子を室温で２分間インキュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の溶液（１００μｌ）を加えて発色を停止させた。
【００８２】
アッセイで得られた色素シグナルを、濃度スケール０〜１０（最高濃度）上で可視的に等級化した。アッセイの結果を以下の表１と表２に示す。表１は第一組のアッセイ（ＤＮＡポリメラーゼ高濃度、ＨＩＶ−１ ＤＮＡコピー数１０）の結果であり、また表２は第二組のアッセイ（ＤＮＡポリメラーゼ低濃度、ＨＩＶ−１ ＤＮＡコピー数５）の結果である。
【００８３】
上記したように、実施例１は１５秒間の復元工程を含み、また実施例２は３０秒間の復元工程を含んだ。対照用のアッセイには復元工程は含まれない。
【００８４】

【００８５】

【００８６】
これらの結果から、ＰＣＲの後のサイクルに生成物復元工程を導入すると、コピー数の少ない標的核酸の増幅から得られるシグナルが増大することがわかる。この改善は、アッセイにおけるＤＮＡポリメラーゼ濃度及びプライマー濃度の両方の濃度について認められた。
【００８７】
本発明をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載してきたが、変更および修正が本発明の精神および範囲内で可能であることは理解されるであろう。
【００８８】
【配列表】

【００８９】

【００９０】

【００９１】

【００９２】

【００９３】

Claims (15)

1. ２種以上の標的核酸を同時増幅する方法において、
   （１）毎回約２０〜約３６０秒間を要する少なくとも１５回の一次増幅サイクルであって、各サイクルが下記工程Ａ〜Ｃ：
   Ａ）２種以上の標的核酸又はそれらのプライマー伸長生成物の反応混合物であって、前記標的核酸の少なくとも１種がコピー数の少ない標的核酸であり且つ前記標的核酸の他の少なくとも１種が前記コピー数の少ない標的核酸の１０００倍以上の濃度で存在するものと予想されるコピー数の多い標的核酸である反応混合物を加熱する際に、前記コピー数の多い標的核酸及びコピー数の少ない標的核酸又はそれらのプライマー伸長生成物の鎖を変性するために約８５〜約１００℃の第一温度Ｔ₁ に加熱する工程、
   Ｂ）（Ｔ_mH−１５）℃≦Ｔ₂ ≦（Ｔ_mH＋５）℃
   〔式中、Ｔ_mHはコピー数の多い標的核酸に対するプライマーの融解温度である〕で規定される第二温度Ｔ₂ まで冷却することによって、増幅すべき各標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズすることができる一組のプライマーで前記変性された鎖をプライミングする工程、及び
   Ｃ）前記工程Ｂの延長としてか又は別の工程において、
   （Ｔ_mH−１５）℃≦Ｔ₃ ≦（Ｔ_mH＋１５）℃
   で規定される第三温度Ｔ₃ でのインキュベーションによって、ＰＣＲ試薬の反応混合物中でプライマー伸長生成物を形成する工程〔但し、前記プライミング工程とプライマー伸長生成物形成工程とを同一工程において実施する場合にはＴ₂ とＴ₃ を同じとする〕、
   を逐次工程として含む一次増幅サイクル、並びに
   （２）毎回約２０〜約３６０秒間を要する少なくとも５回の二次増幅サイクルであって、前記工程Ａ〜Ｃを逐次反復する各二次増幅サイクルにおける工程Ａと工程Ｂとの間に、反応混合物を、
   （Ｔ_mH＋５）℃≦Ｔ₄ ≦Ｔ_PH
   〔式中、Ｔ_PHは前記コピー数の多い標的核酸の二本鎖の融解温度である〕で規定される第四温度Ｔ₄ まで冷却して該温度で約１５〜約１２０秒間維持する二次増幅サイクル
   を含む核酸の同時増幅方法。
2. 一次増幅サイクル及び二次増幅サイクル共に、その工程Ｂと工程Ｃとを同一工程として約６２〜約６８℃の同じ温度で実施する、請求項１記載の方法。
3. 前記コピー数の少ない標的核酸が感染性因子と関連している、請求項１記載の方法。
4. 前記コピー数の少ない標的核酸がウイルス性感染性因子と関連している、請求項３記載の方法。
5. 前記コピー数の少ない標的核酸がＨＩＶ−Ｉ又はＨＩＶ−ＩＩのいずれかと関連しているＤＮＡである、請求項４記載の方法。
6. 前記コピー数の少ない標的核酸に対して特異的なプライマーの一方又は両方がビオチン化されており、そして前記コピー数の少ない標的核酸の検出が、増幅後に得られたビオチン化された鎖をこれに相補的な不溶化オリゴヌクレオチドを用いて捕捉し、次いで検出可能に標識されたストレプトアビジンコンジュゲートにより前記ビオチン化された鎖を検出することによって行われる、請求項１記載の方法。
7. 前記不溶化オリゴヌクレオチドが磁性粒子又は高分子粒子に共有結合されている、請求項６記載の方法。
8. Ｔ₄ が約６５〜約９０℃の範囲にある、請求項１記載の方法。
9. １５〜３５回の一次増幅サイクルと５〜１５回の二次増幅サイクルとを含む、請求項１記載の方法。
10. 一次増幅サイクルと二次増幅サイクルの各サイクルが約３０〜約１２０秒間行われる、請求項１記載の方法。
11. 前記反応混合物が、前記コピー数の少ない標的核酸に対する一組のプライマーと、前記コピー数の多い標的核酸に対する一組のプライマーと、少なくとも４種類のｄＮＴＰと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、前記ＤＮＡポリメラーゼのためのコファクターとを含む、請求項１記載の方法。
12. ３種以上の標的核酸を、それぞれの標的核酸に対して一組のプライマーを使用することによって増幅する、請求項１記載の方法。
13. 各々の融解温度を、以下の式：
    Ｔ_m ＝６７．５＋０．３４（％Ｇ＋Ｃ）−３９５／Ｎ
    〔上式中、ＧとＣは、オリゴヌクレオチドにおける、それぞれグアニンとシトシンのヌクレオチド数を表し、Ｎは全ヌクレオチド数を表す〕
    を用いて計算する、請求項１記載の方法。
14. 工程Ａを約９５℃で行い、工程Ｂと工程Ｃを一緒にして約６４℃で行い、そしてＴ₄ を約７５℃とする、請求項１記載の方法。
15. 反応混合物におけるコピー数の少ない標的核酸に対するプライマーの初期濃度とコピー数の多い標的核酸に対するプライマーの初期濃度とが同じである、請求項１記載の方法。