ES2204930T3 - Procedimiento de ampliacion que usa una etapa intermedia de renaturalizacion. - Google Patents
Procedimiento de ampliacion que usa una etapa intermedia de renaturalizacion.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN METODO PARA LA AMPLIFICACION Y DETECCION DE UN ACIDO NUCLEICO DE COPIA BAJA QUE INCLUYE LA COAMPLIFICACION DE UN ACIDO NUCLEICO DE COPIA ALTA. DESPUES DE UN NUMERO DE CICLOS DE AMPLIFICACION CONVENCIONALES QUE INCLUYEN UN PASO DE DESNATURALIZACION, SE LLEVAN A CABO VARIOS CICLOS DURANTE LOS CUALES LOS PRODUCTOS DESNATURALIZADOS SON RENATURALIZADOS DURANTE UN BREVE PERIODO DE TIEMPO. ESTE PASO INTERMEDIO EN LOS ULTIMOS CICLOS DEL PROCESO DE AMPLIFICACION REDUCE LA CONCENTRACION EFECTIVA DEL ACIDO NUCLEICO DE COPIA ALTA DISPONIBLE PARA SU AMPLIFICACION EN CICLOS POSTERIORES, MARCANDO DE ESTA FORMA MAS POLIMERASA DE DNA DISPONIBLE PARA LA AMPLIFICACION DEL ACIDO NUCLEICO DE COPIA BAJA.
Description
Procedimiento de ampliación que usa una etapa
intermedia de renaturalización.
Esta invención se refiere a una coamplificación
rápida preferencial de dos o más ácidos nucleicos de dos hebras por
la cual se incluye una etapa de renaturalización entre múltiples
ciclos de amplificación.
La detección de ácidos nucleicos ha crecido en
los últimos años como medio para la detección precoz de
características genómicas, agentes infecciosos y diversos
organismos que se encuentran presentes en muy pequeñas cantidades en
una muestra de prueba humana o animal. Los procedimientos de
detección se fundamentan normalmente en el concepto de
complementariedad por el cual dos hebras de ADN están unidas entre
sí por enlaces de hidrógeno y otras fuerzas entre los nucleótidos
complementarios (que se conocen como pares de nucleótidos).
Una molécula de ADN es normalmente bastante
estable, pero se pueden separar o desnaturalizar las hebras mediante
ciertas condiciones, tales como el calentamiento. Las hebras
desnaturalizadas se volverán a asociar únicamente con otra hebra
que posea una secuencia complementaria de nucleótidos.
Se han llevado a cabo muchas investigaciones para
encontrar formas de detectar únicamente unas pocas moléculas de ADN.
Se conocen diversos procedimientos y éstos se han usado durante casi
una década para amplificar o multiplicar en gran medida el número de
ácidos nucleicos en una muestra para su detección. Tales técnicas de
amplificación incluyen a la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), a la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y otras que están
menos desarrolladas.
La PCR es la que mejor se conoce e implica la
hibridación de cebadores con las hebras de un ácido nucleico diana
en presencia de un agente de polimerización del ADN y de
desoxirribonucleótidos trifosfato en condiciones apropiadas. El
resultado es la formación de productos de elongación de los
cebadores a lo largo de varios ciclos y la multiplicación
exponencial del número de hebras diana originales. Se pueden
encontrar detalles adicionales sobre la PCR consultando los
documentos US-A-4.683.195 (Mullis y
col.), US-A-4.683.202 (Mullis) y
US-A-4.965.188 (Mullis y col.).
Las muestras humanas y animales contienen muchos
ácidos nucleicos distintos, algunos de los cuales son endógenos (o
naturales) para la persona o el animal, y otros que se producen como
consecuencia de algún estado anormal, tal como por la presencia de
un agente infeccioso o en un estado oncogénico. Tales ácidos
nucleicos se encuentran habitualmente presentes en concentraciones
muy bajas en comparación con los ácidos nucleicos endógenos. A veces
se les denomina ácidos nucleicos "de bajo número de copias".
Por comparación, los ácidos nucleicos endógenos se encuentran
habitualmente presentes en altas concentraciones y se les puede
denominar ácidos nucleicos "de alto número de copias". Un
ejemplo así es el ADN de la \beta-globina
humana.
A menudo, al usar la PCR, dos o más ácidos
nucleicos presentes en la muestra se amplifican a la par en el mismo
recipiente de reacción. Esto se identifica en la presente invención
como "coamplificación". Este procedimiento requiere que
cebadores para cada ácido nucleico que se pretende amplificar se
encuentren simultáneamente presentes en el recipiente.
Cuando en tales situaciones se amplifican a la
par ácidos nucleicos diana de bajo y alto número de copias, la
amplificación del ácido nucleico diana de bajo número de copias se
encuentra a menudo inhibida. Esto se debe a la saturación de la
enzima amplificadora (como la ADN polimerasa) por el ácido nucleico
diana de alto número de copias durante los últimos ciclos de
amplificación. Se producirían probablemente resultados de falso
negativo para la presencia del ácido nucleico diana de bajo número
de copias, con consecuencias que pueden ser serias.
Se han propuesto varias soluciones al problema
para la PCR, incluidos el ajuste de las concentraciones de los
cebadores, el uso de juegos de cebadores con temperaturas de fusión
(Tm) específicas, o combinaciones de los mismos. Al ajuste de las
proporciones de cebadores se lo ha denominado en la técnica
"sesgar" el producto de la PCR "por los cebadores", y
requiere una disminución de la concentración de los cebadores para
el ácido nucleico diana de alto número de copias. Sólo se consigue
un control modesto del procedimiento con este enfoque.
Otro enfoque a la coamplificación ha sido ajustar
la temperatura de hibridación en la PCR de tal manera que los
cebadores para el ácido nucleico diana de alto número de copias se
hibridan en menor medida que aquellos para el ácido nucleico diana
de bajo número de copias. Este enfoque también presenta un problema.
La diferencia de T_{m} entre las parejas de cebadores debe ser
relativamente importante antes de que se pueda ejercer una buena
modulación de la PCR sobre las producciones diferenciales de los
ácidos nucleicos de alto y bajo número de copias. No se pueden
calcular T_{m} exactas (aunque se pueden estimar), y por lo tanto,
se deben medir. Esto requiere una gran cantidad de esfuerzo, y es de
considerable pesadez.
\newpage
Cada uno de estos enfoques para modular la
coamplificación requiere que se conozcan las secuencias de los
ácidos nucleicos diana de alto y bajo número de copias.
Si no, aumentar el tiempo para las etapas de
cebado o de elongación en la PCR en los últimos ciclos puede
minimizar la saturación de la ADN polimerasa por el ácido nucleico
diana de alto número de copias y aumentar la eficiencia de la
amplificación. Sin embargo, esta solución tiene una utilidad
limitada en situaciones en las que se están amplificando
simultáneamente muchos ácidos nucleicos que se encuentran presentes
en concentraciones variables.
Sería deseable conseguir una amplificación rápida
y eficiente de uno o más ácidos nucleicos diana de bajo número de
copias cuando se someten a coamplificación en presencia de uno o más
ácidos nucleicos diana de alto número de copias.
Los problemas indicados arriba han sido superados
con un procedimiento para la coamplificación de dos o más ácidos
nucleicos diana, procedimiento que comprende:
I) como mínimo 15 ciclos de amplificación
primarios de aproximadamente 20 a aproximadamente 360 segundos cada
uno, cada ciclo comprendiendo las etapas secuenciales de:
- A)
- calentar una mezcla de reacción de dos o más ácidos nucleicos diana o sus productos de elongación de los cebadores, siendo como mínimo uno de los ácidos nucleicos diana un ácido nucleico diana de bajo número de copias, y siendo como mínimo uno de los otros ácidos nucleicos diana un ácido nucleico diana de alto número de copias del que se sospecha que se encuentra presente en como mínimo aproximadamente 1000 veces la concentración del ácido nucleico de bajo número de copias,
- el calentamiento llevándose a cabo a una primera temperatura, T_{1}, de aproximadamente 85 a aproximadamente 100ºC para las desnaturalización de las hebras de los ácidos nucleicos diana de alto y bajo número de copias o de sus productos de elongación de los cebadores,
- B) cebar las hebras desnaturalizadas con un juego de cebadores específicos para, y que se pueden hibridar con, hebras opuestas de cada ácido nucleico diana que se pretende amplificar, mediante el enfriamiento hasta una segunda temperatura, T_{2}, que se define como:
(T_{mH} – 15)^{o}C
\leq T_{2} \leq (T_{mH} +
5)^{o}C
- en la que T_{mH} es la temperatura de fusión de los cebadores para el ácido nucleico diana de alto número de copias,
- C)
- bien sea como prolongación de la etapa B), o en una etapa distinta, formar productos de elongación de los cebadores en una mezcla de reacción de reactivos de PCR, por incubación a una tercera temperatura, T_{3}, que se define como:
(T_{mH} - 15)^{o}C
\leq T_{3} \leq (T_{mH} +
15)^{o}C
- siempre que, cuando el cebado y la formación de productos de elongación de los cebadores se llevan a cabo en la misma etapa, T_{2} y T_{3} sean idénticas, y
II) como mínimo 5 ciclos de amplificación
secundarios de aproximadamente 20 a aproximadamente 360 segundos
cada uno, cada ciclo comprendiendo la repetición de las etapas A) a
C) identificadas arriba secuencialmente,
- siempre que entre las etapas A) y B) de cada ciclo de amplificación secundario, la mezcla de reacción se enfríe hasta y se mantenga a una cuarta temperatura, T_{4}, que se define como:
(T_{mH} + 5)^{o}C
\leq T_{4} \leq
T_{PH}
- en la que T_{PH} es la temperatura de fusión de la doble hebra del ácido nucleico diana de alto número de copias, durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 120 segundos.
La presente invención proporciona un
procedimiento muy rápido y eficiente para amplificar y detectar
preferencialmente un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
en particular en presencia de ácidos nucleicos diana de alto número
de copias que son capaces de ocultar la señal para el ácido nucleico
diana de bajo número de copias. Por lo tanto, la inhibición de la
amplificación del ácido nucleico diana de bajo número de copias por
el ácido nucleico diana de alto número de copias se encuentra
reducida.
El documento
EP-A-0648845, publicado el 19 de
abril de 1995, describe un procedimiento rápido para la
amplificación diferencial de un ácido nucleico diana de alto número
de copias y de un ácido nucleico diana de bajo número de copias en
el que la temperatura de hibridación, T_{2}, y la temperatura de
elongación, T_{3}, se definen con respecto a T_{mL}, la
temperatura de fusión de los cebadores para el ácido nucleico diana
de bajo número de copias. Sin embargo, el procedimiento descrito en
el documento EP-A-0648845 no incluye
una etapa de renaturalización.
Las ventajas de la presente invención se
consiguen mediante la inclusión de una etapa de renaturalización
dentro de los últimos ciclos del procedimiento de amplificación de
manera que después de un cierto número de ciclos de amplificación
(identificados en la presente invención como ciclos
"primarios"), se vuelven a naturalizar o se hibridan los
productos amplificados durante un breve periodo de tiempo después de
cada etapa de desnaturalización en los ciclos posteriores
(identificados en la presente como ciclos "secundarios"). La
etapa de renaturalización se lleva a cabo a una temperatura a la
cual las hebras complementarias de los productos desnaturalizados
pueden fácilmente volverse a naturalizar o hibridar. Sin embargo, la
temperatura se mantiene por encima de aquella a la que los cebadores
para el ácido nucleico diana de alto número de copias se hibridan
eficazmente con las hebras complementarias del producto amplificado
desnaturalizado. Se deja una cantidad suficiente de tiempo para la
renaturalización, reduciendo así la concentración efectiva de ácido
nucleico diana de alto número de copias disponible para el cebado y
la amplificación posterior. Esto permite una amplificación más
eficiente del ácido nucleico diana de bajo número de copias en los
ciclos posteriores ya que se encuentra más ADN polimerasa
disponible.
Los principios y condiciones generales para la
amplificación y detección de ácidos nucleicos mediante el uso de la
reacción en cadena de la polimerasa son bastante bien conocidos,
cuyos detalles se proporcionan en numerosas referencias que incluyen
los documentos US-A-4.683.195,
US-A-4.683.202 y
US-A-4.965.188 (señaladas arriba).
Por lo tanto, en vista de las enseñanzas en la técnica y las
enseñanzas específicas proporcionadas en la presente invención, un
trabajador con experiencia en la materia no debería experimentar
dificultades para practicar la presente invención al hacer los
ajustes enseñados en la presente invención para efectuar una
coamplificación de dos o más ácidos nucleicos, uno de los cuales es
un ácido nucleico diana de bajo número de copias.
Otros procedimientos de amplificación que se
pueden usar en la práctica de esta invención incluyen a la reacción
en cadena de la ligasa como se describe, por ejemplo, en los
documentos EP-A-0320308 (publicado
en diciembre de 1987) y EP-A-0439182
(publicado en enero de 1990), y cualquier otro procedimiento de
amplificación conocido que incluya una etapa de desnaturalización
del producto. Por lo tanto, las enseñanzas proporcionadas en la
presente invención permitirían a un experto en la materia adaptar la
modificación de renaturalización presentado para la PCR a estos
otros procedimientos de amplificación conocidos. El resto de esta
descripción esta encaminada a la práctica de la invención mediante
el uso de PCR a fines ilustrativos.
La presente invención está encaminada a la
amplificación y detección de una o más secuencias de ácido nucleico
específicas presentes en uno o más ácidos nucleicos diana de bajo
número de copias en una muestra de prueba simultáneamente con la
amplificación de una o más secuencias de ácido nucleico presentes en
uno o más ácidos nucleicos diana de alto número de copias. Por lo
general, un ácido nucleico diana de bajo número de copias se
encuentra presente en una muestra en una cantidad inferior a
aproximadamente 10^{-16} molar, sin embargo, la cantidad puede ser
superior si los ácidos nucleicos de alto número de copias se
encuentran presentes en cantidades mucho mayores, por ejemplo, a una
concentración como mínimo 1000 veces superior. Los ácidos nucleicos
diana de alto número de copias son aquellos que están por lo general
asociados a genes de copia única mientras que los ácidos nucleicos
diana de bajo número de copias son por lo general aquellos que están
asociados con agentes infecciosos, cánceres y otros estados
patológicos en un ser humano o animal.
Además, se puede usar el ácido nucleico diana de
alto número de copias como un "control positivo" en un ensayo.
Mediante la modulación de la eficiencia de la PCR del ácido nucleico
diana de alto número de copias, el control positivo puede ser
detectable únicamente si la PCR se llevó a cabo eficientemente,
reduciendo así la probabilidad de falsos negativos. En tales casos,
el ácido nucleico diana de alto número de copias puede encontrarse
presente a 10 o más veces la concentración del ácido nucleico diana
de bajo número de copias.
Las muestras de prueba pueden incluir material
celular o vírico, cabello, fluidos corporales u otros materiales que
contienen ADN o ARN genético que se pueda detectar. Se pueden
obtener los ácidos nucleicos diana de distintas fuentes que incluyen
los plásmidos, y el ADN o ARN natural de cualquier fuente (tal como
bacterias, levaduras, virus, plantas, animales superiores o seres
humanos). Se puede extraer de distintos tejidos que incluyen la
sangre, las células mononucleares de sangre periféricas (PBMC),
otros materiales de tejidos u otras fuentes conocidas en la técnica
mediante el uso de procedimientos conocidos. La presente invención
es particularmente útil para la coamplificación y detección de
secuencias de ácidos nucleicos que se encuentran en el ADN genómico,
el ADN bacteriano, el ADN fúngico, el ARN vírico, o el ADN o el ARN
que se encuentra en células infectadas por bacterias o virus.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos asociadas con marcadores
de cánceres se pueden amplificar y detectar mediante el uso de la
presente invención.
Las bacterias que se pueden detectar incluyen,
pero no se restringen a, las bacterias que se encuentran en la
sangre humana, las especies de Salmonella, las especies de
Chlamydia, las especies gonocócicas, las especies de
Shigella, y las especies de Mycobacterium. Los virus
que se pueden detectar incluyen, pero no se restringen a, los virus
herpes simplex, el virus de Epstein Barr, el citomegalovirus humano,
el virus del papiloma humano, los virus de la hepatitis y los
retrovirus tales como HTLV-I,
HTLV-II, HIV-I y
HIV-II. También son detectables los parásitos
protozoos, las levaduras y los mohos. Otras especies detectables se
harían inmediatamente manifiestas para aquél experto en la materia.
La invención es particularmente útil para la detección de la
presencia del ADN asociado con un ADN retroviral
(HIV-I o HIV-II) o una especie de
Mycobacterium. Muy preferiblemente, se usa para detectar el ADN
asociado con el HIV-I.
Un "reactivo para PCR" se refiere a
cualquiera de los reactivos que se consideran esenciales para la
PCR, a saber un juego de cebadores para las hebras opuestas de cada
ácido nucleico diana, una ADN polimerasa, un cofactor para la ADN
polimerasa, y dos o más
desoxirribonucleósidos-5'-trifosfato
(dNTP).
El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido, bien natural o producido por síntesis, que es capaz
de hacer las veces de punto de iniciación de la síntesis cuando se
pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto
de elongación del cebador complementario de una hebra de ácido
nucleico (es decir, plantilla). Tales condiciones incluyen la
presencia de otros reactivos para PCR, y una temperatura y un pH
adecuados. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la
síntesis de productos de elongación en presencia de la ADN
polimerasa. El tamaño exacto de cada cebador variará según el uso
que se contempla, la complejidad de la secuencia tomada por diana,
la temperatura de reacción y la fuente del cebador. Por lo general,
los cebadores que se usan en esta invención tendrán de 10 a 60
nucleótidos.
Se pueden obtener cebadores de varias fuentes o
prepararlos mediante el uso de técnicas y equipos conocidos, que
incluyen por ejemplo, un sintetizador de ADN ABI (que se puede
conseguir de Applied Biosystems) o un sintetizador Biosearch de la
serie 8600 o de la serie 8800 (que se puede conseguir de
Milligen-Biosearch, Inc.) y los procedimientos
conocidos para su uso (por ejemplo como se describe en el documento
US-A- 4.965.188, señalado arriba). Los cebadores
naturales aislados de fuentes biológicas son también útiles (tales
como productos de digestión de endonucleasas de restricción). Por lo
general se usa un juego de como mínimo dos cebadores para cada ácido
nucleico diana. Por lo tanto, se puede usar una pluralidad de juegos
de cebadores simultáneamente para amplificar una pluralidad de
ácidos nucleicos diana. Además, un juego de cebadores puede incluir
una mezcla de cebadores para un ácido nucleico diana
determinado.
Las ADN polimerasas son conocidas como enzimas
que esterifican y añaden moléculas de desoxinucleósido monofosfato
al extremo 3'-hidróxi del cebador mediante un enlace
fosfodiéster al cebador, siendo la síntesis dirigida por la
plantilla. Las ADN polimerasas de utilidad incluyen por ejemplo, la
ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa de T4, la
polimerasa de Klenow, la transcriptasa inversa y otras que se
conocen en la técnica.
La ADN polimerasa es preferiblemente
"termoestable", lo cual significa que es por lo general estable
a las altas temperaturas que se usan para la desnaturalización de
hebras de ADN. Más concretamente, las ADN polimerasas termoestables
no se inactivan considerablemente a las altas temperaturas que se
usan en la PCR. Tales temperaturas variarán en función de una serie
de condiciones de reacción, que incluyen el pH, la concentración en
sales, y otras condiciones que se conocen en la técnica.
Se ha informado acerca de varias ADN polimerasas
termoestables en la técnica, incluidas aquellas que se mencionan en
detalle en los documentos
US-A-4.965.188 (señalado arriba) y
US-A-4.889.818 (Gelfand y col.). Son
polimerasas particularmente útiles aquellas que se obtienen de
distintas especies bacterianas de Thermus, tales como
Thermus aquaticus, Thermus filiformis, Thermus
flavus o Thermus thermophilus. Otras polimerasas
termoestables útiles se obtienen de una diversidad de otras fuentes
microbianas que incluyen Thermococcus literalis,
Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. y aquellas que se
describen en el documento
WO-A-89/06691 (publicado el 27 de
julio de 1989). Algunas enzimas de utilidad están disponibles en el
mercado. Se conocen varias técnicas para aislar polimerasas
naturales de organismos. La clonación y otras técnicas de síntesis
para la preparación de polimerasas mediante el uso de técnicas
recombinantes son también conocidas a partir de las técnicas citadas
arriba, incluida la patente de Gelfand y col.
Un cofactor para la ADN polimerasa se refiere a
un compuesto no proteico del que depende la enzima para su
actividad. Se conocen varios materiales semejantes en la técnica,
incluidas sales de manganeso y magnesio. Los cofactores de utilidad
incluyen, pero no se restringen a, los cloruros, sulfatos, acetatos
y sales de ácidos grasos, de manganeso y de magnesio. Se prefieren
los cloruros, sulfatos y acetatos, y se prefieren entre todos a los
cloruros y sulfatos de magnesio.
Para la PCR se necesitan también dos o más
desoxirribonucleósidos-5'-trifosfato,
tales como el dATP, el dCTP, el dGTP, el dTTP y el dUTP. También
son de utilidad análogos tales como el dITP y el
7-deaza-dGTP. Preferiblemente, se
usan los cuatro trifosfatos comunes (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) en la
PCR.
También es útil en la práctica de la presente
invención un anticuerpo específico para la ADN polimerasa,
anticuerpo que inhibe la actividad enzimática de ésta a temperaturas
por debajo de aproximadamente 50ºC, pero anticuerpo que se desactiva
a temperaturas superiores. Se describen anticuerpos monoclonales
representativos que tienen estas propiedades en el documento
EP-A-0592035.
Se pueden usar fragmentos de anticuerpos en lugar
de la molécula completa.
Los reactivos para PCR que se describen en la
presente invención se proporcionan y se usan en la PCR en
concentraciones adecuadas para proporcionar la amplificación del
ácido nucleico diana. La cantidad mínima de ADN polimerasa es por lo
general como mínimo aproximadamente 1 unidad/100 \mul de solución,
prefiriéndose de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 unidades/100
\mul. Una "unidad" se define en la presente invención como la
cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar 10 nmoles
de nucleótidos totales (dNTP) dentro de una cadena de ácido nucleico
en elongación en 30 minutos a 74ºC. La concentración de cada cebador
es de por lo menos aproximadamente 0,075 \mumolar, prefiriéndose
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 \mumolar. Los cebadores
pueden encontrarse presentes en cantidades idénticas o distintas.
Preferiblemente, los cebadores de cada juego de cebadores para cada
ácido nucleico diana se encuentran inicialmente presentes en la
mezcla de reacción en la misma cantidad. El cofactor se encuentra
generalmente presente en una cantidad de aproximadamente 1 a
aproximadamente 15 mmolar, y cada dNTP se encuentra generalmente
presente a desde aproximadamente 0,15 a aproximadamente 3,5 mmolar
en la mezcla de reacción.
Los reactivos para la PCR pueden suministrarse
individualmente, o en una solución amortiguada que tiene un pH en el
intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 mediante el uso
de cualquier tampón adecuado. Por lo tanto, una mezcla de reacción
para PCR puede contener un juego de cebadores para un ácido nucleico
diana de bajo número de copias, un juego de cebadores para un ácido
nucleico diana de alto número de copias, dNTP adecuados, una ADN
polimerasa termoestable, un cofactor para la ADN polimerasa, y
cualquier otro artículo adicional que un experto en la materia
considerase útil en la amplificación o detección final de los ácidos
nucleicos diana.
Se puede obtener un ácido nucleico diana de una
cualquiera de diversas fuentes como se indicó arriba. Por lo
general, hay que extraerlo de alguna manera para volverlo disponible
para el contacto con los cebadores y otros materiales de reacción.
Habitualmente, esto significa eliminar proteínas y elementos
celulares indeseados de la muestra de una manera adecuada. Se
conocen diversos procedimientos en la técnica, incluidos aquellos
descritos por Laure y col. en The Lancet, pp.
538-540 (3 de septiembre de 1988), Maniatis y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp.
280-281 (1982), Gross-Belland y col.
en Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973) y el documento
US-A-4.965.188 (señalado arriba). La
extracción de ADN de sangre completa o de componentes de la misma se
describen, por ejemplo, en el documento
EP-A-0393744 (publicado el 24 de
octubre de 1990), Bell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78(9), pp. 5759-5763 (1981), Saiki y col.,
Bio/Technology, 3, pp. 1008-1012
(1985) y el documento
US-A-5.231.015 (Cummins y col.). El
procedimiento de extracción particular no es esencial para la
práctica de la presente invención.
Puesto que el ácido nucleico diana que hay que
amplificar y detectar se encuentra generalmente en forma de doble
hebra, hay que separar las dos hebras (es decir, desnaturalizarlas)
antes de que pueda tener lugar el cebado. Esto se puede hacer
durante el procedimiento de extracción, pero preferiblemente, se
hace posteriormente en una etapa separada. El calentamiento hasta
una temperatura adecuada (identificada como "primera
temperatura" o T_{1} en la presente invención) es un modo
preferido de desnaturalización. Por lo general, esta primera
temperatura se encuentra en el intervalo de aproximadamente 85 a
aproximadamente 100ºC durante un tiempo adecuado, por ejemplo desde
1 hasta aproximadamente 240 segundos (preferiblemente 1 a
aproximadamente 40 segundos). Esta etapa de desnaturalización
inicial puede incluirse también en el primer ciclo de amplificación.
En tales casos, la desnaturalización puede ser más larga en el
primer ciclo (por ejemplo, hasta 240 segundos) mientras que los
ciclos posteriores pueden tener etapas de desnaturalización mucho
más cortas (por ejemplo, hasta 30 segundos).
A continuación, las hebras desnaturalizadas se
ceban con el juego apropiado de cebadores al enfriar la mezcla de
reacción hasta una segunda temperatura, T_{2}, que se encuentra
generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 55 a
aproximadamente 70ºC. Se desea que el enfriamiento se efectúe tan
rápidamente como sea posible, pero con los equipos que se conocen
actualmente, éste se produce generalmente en un periodo de tiempo de
aproximadamente 5 a aproximadamente 40 segundos, y más
preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 segundos.
Preferiblemente, T_{2} se define como:
(T_{mH} -15)^{o}C
\leq T_{2} \leq (T_{mH}
+5)^{o}C
en la que T_{mH} es la temperatura de fusión de
los cebadores para el ácido nucleico diana de alto número de
copias.
Una vez que las hebras desnaturalizadas se han
enfriado, se incuba la mezcla de reacción que contiene los reactivos
para la PCR a una tercera temperatura, T_{3}, por lo general
durante 1 a aproximadamente 120 segundos, y preferiblemente durante
1 a aproximadamente 80 segundos, para realizar la formación de
productos de elongación de los cebadores. Por lo general, la tercera
temperatura se define como:
(T_{mH} -15)^{o}C
\leq T_{3} \leq (T_{mH}
+15)^{o}C
y se encuentra por lo general en el intervalo de
aproximadamente 55 a aproximadamente 70ºC. Preferiblemente, se
encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 62 a
aproximadamente
68ºC.
\newpage
En una realización muy preferida, la segunda y la
tercera temperatura son idénticas y se encuentran dentro del
intervalo de aproximadamente 62 a aproximadamente 68ºC. Por lo
tanto, el cebado y la elongación de los cebadores se llevan
preferiblemente a cabo en la misma etapa.
Cada cebador para el ácido nucleico diana de alto
número de copias tiene también una temperatura de fusión
identificada en la presente invención como T_{mH}. Habitualmente,
la diferencia entre T_{mL} y T_{mH} es de 0 a aproximadamente
8ºC, y tanto T_{2} como T_{3} son por lo general inferiores a
T_{mL} o T_{mH} o iguales a cualquiera de T_{mL} o
T_{mH}.
Temperatura de fusión se define en la presente
invención como la temperatura a la cual una mitad de un cebador se
encuentra desnaturalizada de una hebra complementaria (tal como la
plantilla). La determinación de las temperaturas de fusión puede
realizarse mediante el uso de varios procedimientos ordinarios,
basados en el hipocromismo en ultravioleta, por ejemplo, mediante el
seguimiento del espectro a 260 nm como se describe en
Biochemistry-The Molecular Basis of Cell
Structure and Function, 2ª edición, Lehninger, Worth Publishers,
Inc., 1970, pp. 876-7. Los diversos procedimientos
de determinación de las temperaturas de fusión pueden producir
valores que difieren ligeramente para la misma molécula de ADN, pero
esos valores no deberían variar de más de aproximadamente 2 o 3ºC.
Además, la diferencia entre T_{mL} y T_{mH} no debería variar
dentro de un procedimiento determinado para la determinación de las
temperaturas de fusión.
Preferiblemente, las temperaturas de fusión se
calculan mediante el uso de la fórmula:
T_{m} (^{o}C) = 67,5 +
0,34(%G + C) -
395/N
en la que "G" y "C" representan el
número de nucleótidos de guanina y de citosina, respectivamente, y
"N" representa el número total de nucleótidos en el
oligonucleótido (es decir, el cebador). Los valores de temperatura
de fusión obtenidos mediante este cálculo están en muy buena
correlación con los valores que se determinan empíricamente a
temperatura ambiente mediante el uso del hipocromismo en UV
convencional y un espectrofotómetro de red de diodos convencional de
Hewlett-Packard (velocidad de exploración de
aproximadamente +1ºC/min) para una solución de cebador en tampón
tris(hidroximetil)aminometano 10 mmolar (pH 8,5) que
tiene una fuerza iónica de como mínimo 20 mmolar aproximadamente
proporcionada por una o más sales orgánicas o inorgánicas, tales
como el cloruro de magnesio, el cloruro sódico y otros
inmediatamente manifiestos para aquél experto en la materia. Las
cantidades de cebador y de su complemento en la solución usada para
determinar la fórmula para la temperatura de fusión señalada fueron
suficientes para proporcionar una densidad óptica de aproximadamente
0,5 a aproximadamente 1,0 unidad de
DO.
Por lo tanto, un ciclo de amplificación
"primario" comprende las etapas de desnaturalización, cebado (o
hibridación) y elongación del cebador descritas arriba. Por lo
general, se llevan a cabo como mínimo 15 de tales ciclos de
amplificación primarios en la práctica de esta invención, siendo el
número máximo de ciclos al gusto del usuario particular. En la
mayoría de los casos, se usan 15 a 35 ciclos de amplificación
primarios en el procedimiento, prefiriéndose 25 ciclos. Cada ciclo
de amplificación primario dura por lo general desde aproximadamente
20 a aproximadamente 360 segundos, prefiriéndose una duración de
ciclo de aproximadamente 30 a aproximadamente 120 segundos y
prefiriéndose aún más una duración de aproximadamente 30 a
aproximadamente 90 segundos. Sin embargo, se pueden usar duraciones
de ciclo más largas o más cortas si se desea.
Al cabo de como mínimo 15 ciclos de amplificación
primarios como se definen arriba, se llevan a cabo ciclos de
amplificación posteriores o "secundarios" que poseen las mismas
etapas, excepto por la inclusión de una etapa de renaturalización
después de cada etapa de desnaturalización y antes de la etapa de
cebado.
La renaturalización se lleva a cabo mediante el
enfriamiento de la mezcla de reacción hasta una cuarta temperatura,
T_{4}, que se define como:
(T_{mH} + 5)^{o}C
\leq T_{4} \leq
T_{PH}
en la que T_{PH} es la temperatura de fusión de
la doble hebra del ácido nucleico diana de alto número de copias que
se está detectando. Por lo general, T_{4} es de aproximadamente 65
a aproximadamente 90ºC. El tiempo necesario para alcanzar T_{4} es
tan corto como sea posible, pero puede ser de hasta aproximadamente
45 segundos, y se puede mantener esta temperatura durante
aproximadamente 15 a aproximadamente 100
segundos.
Se usan por lo menos 5 ciclos de amplificación
secundarios en el procedimiento estableciéndose el límite superior
al gusto del usuario. Preferiblemente, el procedimiento incluye
desde 5 a 20 ciclos secundarios, y se prefiere entre todos 15
ciclos. La duración de cada ciclo secundario es de aproximadamente
20 a aproximadamente 360 segundos. Una duración de ciclo preferida
es de aproximadamente 30 a aproximadamente 120 segundos.
Tal y como se usa en esta solicitud, cuando se
usa con referencia a la duración de una etapa determinada, el
término "aproximadamente" se refiere a \pm10% de este límite
de duración. Cuando se usa con referencia a temperaturas, el término
"aproximadamente" se refiere a \pm5ºC.
La cinética de las reacciones de hibridación de
ácidos nucleicos, tales como la renaturalización de los productos de
amplificación, están relacionados linealmente con la concentración
de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por consiguiente,
si la concentración en productos amplificados aumenta, por ejemplo,
10 veces, la velocidad de hibridación aumenta también 10 veces (y la
t½ para la renaturalización disminuye 10 veces). Si se considera una
constante de velocidad hacia delante para la hibridación de 5 x
10^{6} molar^{-1} s^{-1}, la t_{1/2} sería de
aproximadamente 14 segundos para una concentración de producto de
10^{-8} molar, y de 140 segundos para una concentración en
producto de 10^{-9} molar.
La inclusión de una etapa de renaturalización del
producto en los ciclos posteriores a una temperatura de o por debajo
de la T_{m} efectiva para el producto de alto número de copias
(temperatura de fusión) pero varios grados por encima de la T_{m}
efectiva para los cebadores que se usan en la reacción de
amplificación permite la renaturalización de los productos de
amplificación de una manera que depende de la concentración. La
etapa de renaturalización relativamente corta de los ciclos
secundarios no afecta de forma importante la eficiencia del cebado
del ácido nucleico diana de bajo número de copias, pero disminuirá
el cebado del ácido nucleico diana de alto número de copias.
El procedimiento de amplificación de esta
invención se lleva preferiblemente a cabo de manera continua,
automatizada para que la mezcla de reacción pase por oscilaciones
térmicas de manera controlada por un número de veces deseado. Se han
desarrollado varios instrumentos a este fin, como lo sabrá aquél con
experiencia común en la materia. Preferiblemente, el instrumento
será también programable para la etapa de renaturalización y la
reanudación de los ciclos de amplificación después de ello.
Un instrumento semejante para este propósito se
describe con cierto detalle en los documentos
US-A-4.965.188 y
EP-A-0.236.069. Por lo general, este
instrumento incluye un recipiente conductor de calor para contener
varios tubos de reacción que contienen mezcla de reacción, un medio
para el calentamiento, enfriamiento y mantenimiento de la
temperatura, y un medio informático para generar señales para
controlar la secuencia de amplificación, los cambios de temperatura
y el cronometraje.
El documento
EP-A-0402994 proporciona detalles de
conjuntos de pruebas químicas de utilidad que se pueden procesar
mediante el uso del instrumento descrito en el documento
US-A-5.089.233 (Devaney, Jr. y
col.). También se describe en el mismo un medio para calentar y
enfriar el conjunto de pruebas a intervalos repetidos (es decir, a
través de ciclos) apropiados para el procedimiento de la presente
invención. Se pueden conseguir detalles adicionales con respecto a
equipos de procesamiento de PCR de utilidad a partir de la
considerable bibliografía en el campo, y éstos serán fácilmente
conocidos por aquél experto en la materia.
Aparte de los conjuntos de pruebas químicas
descritos arriba, se puede llevar a cabo el procedimiento en otros
recipientes como aquellos descritos con más detalle en los
documentos US-A-4.902.624 (Columbus
y col.), US-A-5.173.260 (Zander y
col.) y US-A-5.229.297 (Schnipelsky
y col.) y cualquier otro recipiente adecuado que es directamente
evidente para el experto en la materia.
La detección de los productos amplificados se
puede llevar a cabo mediante el uso de cualquier procedimiento
conocido, incluidas las técnicas de hibridación de tipo Southern,
como se describe en el documento
US-A-4.965.188 (señalado arriba), o
mediante el uso de sondas o cebadores marcados, como se sabe en la
técnica.
Como alternativa a las realizaciones descritas
arriba, se pueden detectar los productos amplificados mediante el
uso de un oligonucleótido marcado que sea complementario de uno de
los productos de elongación de los cebadores. Los procedimientos
para unir marcadores a los oligonucleótidos son bien conocidos. Los
marcadores de utilidad incluyen enzimas, la ferritina y otras
partículas magnéticas, los radioisótopos, los reactivos
quimioluminiscentes (por ejemplo, el luminol), la biotina y diversos
fluorógenos y cromógenos. Los marcadores enzimáticos de utilidad
incluyen la glucosa oxidasa, la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
También se conocen substratos y reactivos que proporcionan
coloración para diversos marcadores, tales como las enzimas.
En una realización preferida, se usa un marcador
enzimático (como la peroxidasa) para la detección, y se usa una
composición adecuada para proporcionar una coloración o la emisión
de luz con ese marcador. Por ejemplo, se describen sistemas que
proporcionan coloraciones colorimétricas particularmente útiles en
el documento US-A-5.024.935 (McClune
y col.). A continuación se procede a la detección bien visualmente
sin ayuda alguna, o con espectrofotómetros o luminómetros
adecuados.
También es posible que uno de los cebadores de
cada juego de cebadores que se usan en el procedimiento esté marcado
con un radical de unión específica. Este radical puede ser idéntico
o distinto para diversos cebadores, e incluye cualquier molécula
para la cual existe un receptor de unión específica que reacciona
específicamente con ese radical. Los ejemplos de parejas de unión
especificas (una de las cuales puede ser el marcador) incluyen, pero
no se restringen a, estreptavidina/biotina, azúcar/lectina,
anticuerpo/hapteno, anticuerpo/antígeno y otras que el experto en la
materia advierte de inmediato. La molécula receptora se conjuga a
continuación con un radical marcador detectable adecuado, tal como
una enzima, un radioisótopo u otros descritos arriba para los
oligonucleótidos.
Más preferiblemente, uno o ambos cebadores de
cada juego de cebadores se marcan con la biotina (o un derivado
equivalente de la misma), y se detecta el producto amplificado
mediante el uso de un conjugado de estreptavidina y una enzima, como
la peroxidasa de rábano.
En los sistemas de detección heterogéneos de esta
invención, los productos amplificados se capturan en un sustrato
insoluble en el agua de algún tipo, y los demás materiales en la
mezcla de reacción se eliminan de manera adecuada, tal como la
filtración, la centrifugación, el lavado u otra técnica de
separación.
Se pueden unir sondas de captura a soportes
insolubles en el agua mediante el uso de técnicas de unión conocidas
(incluidas la absorción y reacciones covalentes). Una técnica
semejante se describe en el documento
EP-A-0439222 (publicado el 18 de
septiembre de 1991). Otras técnicas se describen, por ejemplo, en
los documentos US-A-4.713.326
(Dattagupta y col.), US-A-4.914.210
(Levenson y col.) y EP-B-0070687
(publicado el 26 de enero de 1983). Los medios de separación de
utilidad incluyen la filtración a través de membranas tales como las
membranas microporosas de poliamida que se pueden conseguir en el
mercado de Pall Corporation.
Sin embargo, se puede usar cualquier soporte
sólido de utilidad para anclar la sonda de captura y el producto de
hibridación eventual, incluidos placas de microvaloración, tubos de
ensayo, vasos, partículas magnéticas o poliméricas, metales,
cerámicas, y fibra de vidrio, para nombrar algunos. Son materiales
particularmente útiles las partículas magnéticas o poliméricas que
llevan grupos reactivos de utilidad para unir de manera covalente la
sonda de captura. Tales partículas son por lo general de
aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 \mumetros. Se
proporcionan detalles suplementarios acerca de ejemplos de tales
materiales en los documentos
US-A-4.997.772 (Sutton y col.),
US-A-5.147.777 (Sutton y col.),
US-A-5.155.166 (Danielson y col.) y
US-A-4.795.698 (Owen y col.)
La sonda de captura se puede pegar a un soporte
llano, como una película polimérica, membranas, papeles de filtro, o
papel revestido con resina o sin revestir. Las sondas de captura
pegadas a partículas poliméricas pueden también inmovilizarse encima
de soportes llanos semejantes de manera adecuada, por ejemplo, como
depósitos desecados, o adherirse por fusión térmica o con adhesivos.
Se proporcionan otros detalles de tales materiales en los documentos
EP-A-0408738 (publicado el 23 de
enero de 1991), WO 92/16659 (publicado el 1 de octubre de 1992) y
US-A-5.173.260 (Sutton y col.).
Se pueden disponer las sondas de captura en un
soporte adecuado según cualquier configuración, por ejemplo, filas
de depósitos redondos o franjas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar
la práctica de esta invención, y no se pretende que sean
restrictivos de manera alguna. Todos los porcentajes son en peso a
menos que se indique lo contrario.
Los cebadores que se usaron en los ejemplos
tenían las siguientes secuencias. Los dos primeros son
complementarios de la región gag del ADN del
HIV-I, y los dos segundos cebadores son
complementarios del ADN de la \beta-globina.
| SEC ID Nº 1: | 5'-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3' |
| SEC ID Nº 2: | 5'-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3' |
| SEC ID Nº 3: | 5'-X-CAACTTCATC CACGTTCACC-3' |
| SEC ID Nº 4: | 5'-ACACAACTGT GTTCACTAGC-3'. |
En los cebadores, X representa un radical
biotinil (derivado de un reactivo fosforamidita de biotina, DuPont)
atado al oligonucleótido a través de dos grupos espaciadores de
amino-tetraetilenglicol mediante el uso de la
tecnología descrita en el documento
US-A-4.962.029 (Levenson y
col.).
Las sondas de captura que se usaron en los
ejemplos tenían las secuencias siguientes, siendo la primera para el
ADN de HIV-I y la segunda para el de la
\beta-globina:
| SEC ID Nº 5: | 5'-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-Y-3' |
| SEC ID Nº 6: | 5'-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C-Y-3' |
"Y" representa dos espaciadores de
tetraetilenglicol conectados con un único grupo conector aminodiol
mediante el uso de las enseñanzas del documento
US-A-4.914.210 (Levenson y col.)
Los cebadores y las sondas de captura se
prepararon mediante el uso de materiales de partida y procedimientos
conocidos mediante el uso del sintetizador de ADN de tres columnas,
modelo 380B de Applied Biosystems, química clásica de la
fosforamidita y el protocolo de ciclo rápido, a escala 1 \mumolar
de ABI. Se consiguieron las
nucleósido-3'-fosforamiditas y los
soportes de vidrio de poros controlados con nucleósidos
derivatizados de Applied Biosystems. Todas las purificaciones se
llevaron a cabo mediante el uso de una columna de purificación de
ácidos nucleicos, seguida de técnicas de HPLC en fase inversa.
Para producir reactivos de captura, se unieron
las sondas de forma covalente con partículas poliméricas (de 1
\mum de diámetro medio) que se prepararon mediante el uso de
técnicas de polimerización en emulsión convencionales, a partir de
poli(estireno-co-ácido
3-(p-vinilbenciltio)propiónico) (proporción ponderal
95:5, diámetro medio 1 \mum). Se lavó una suspensión de las
partículas en agua con tampón ácido
2-(N-morfolino)etanolsulfónico (0,1 molar, pH
6), y se puso en suspensión hasta aproximadamente 10% en sólidos. Se
mezcló una muestra (3,3 ml) de las partículas lavadas, diluidas
hasta 3,33% en sólidos en el tampón (0,1 molar), con clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(2,1 ml de 84 mg/ml agua) y la sonda (983 \mul de DO 44,44/ml de
agua nanopura). La suspensión que se obtuvo se calentó hasta 50ºC en
un baño de agua durante aproximadamente dos horas con mezcla
intermitente y se centrifugó. A continuación, las partículas se
lavaron tres veces con tampón
tris(hidroximetil)aminometano (0,01 molar, pH 8) que
contenía sal disódica del ácido (etilendinitrilo)tetraacético
(0,0001 molar) y se volvieron a poner en suspensión en el mismo
hasta 4% en sólidos.
Tras diluirlos hasta 0,25% en sólidos con tampón,
se aplicaron los reactivos de captura (1,2 \mul) a, y se secaron
en, regiones definidas de las membranas microporosas (membrana de
poliamida LOPRODYNE™, tamaño de poro medio 5 \mum, de Pall Corp.)
en los pocillos para pruebas de dispositivos de pruebas desechables
SURECELL™ (que se pueden conseguir de Eastman Kodak Company), que se
describen en detalle en el documento
US-A-4.948.561 (Hinckley y
col.).
Se llevó a cabo la PCR mediante el uso de un
procesador de PCR automatizado Kodak que se describe en detalle en
el documento US-A-5.089.233, que se
incorpora en la presente invención por referencia, mediante el uso
del protocolo de calentamiento y enfriamiento que se describe en los
ejemplos abajo.
Se obtuvo la ADN polimerasa recombinante de
Thermus aquaticus mediante el uso de procedimientos
convencionales.
El glicerol, el tampón
tris(hidroximetil)aminometano y los dNTP se
consiguieron de Sigma Chemical.
Se extrajo ADN diana del HIV-I de
bajo número de copias de la línea celular 8E5/LAV mediante el uso de
procedimientos convencionales. Después de la lisis de las células y
la digestión de las proteínas, se purificó el ADN por extracción al
fenol/cloroformo: se añadió fenol saturado con tris (750 \mul) a
la suspensión de células, y las soluciones de fenol/productos de
lisis se mezclaron y se separaron por centrifugación. La fase acuosa
se transfirió a continuación dentro de un nuevo tubo de 2 ml. Este
procedimiento se repitió mediante el uso de cloroformo alcohol
isoamílico. La capa acuosa se llevó hasta 0,3 molar en acetato de
sodio. Se precipitaron los ácidos nucleicos por adición de etanol
helado al 95% y almacenamiento a -70ºC durante 1 hora. A
continuación, se determinó la concentración en ADN del
HIV-I a A_{260} y se hicieron diluciones seriadas
de número de copias variable en tampón TE
[tris(hidroximetil)aminometano (1 mmolar) y ácido
(etilendinitrilo)tetraacético (0,1 mmolar)] para su uso
experimental.
El ADN de la \beta-globina de
alto número de copias se obtuvo del ADN de placenta humano (0,5
mg/ml) del que se supone que posee dos copias del gen de la
\beta-globina por célula.
La dispersión del colorante leuco contenía
agarosa (0,5%), colorante leuco
4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(4-
hidroxi-3-metoxifenil)imidazol (250 \mumolar), ácido dietilentriaminopentaacético (100 \mumolar), 4'-hidroxiacetanilida (5 mmolar), polivinilpirrolidona (112 mmolar) y fosfato sódico, monobásico, 1-hidrato (10 mmolar).
hidroxi-3-metoxifenil)imidazol (250 \mumolar), ácido dietilentriaminopentaacético (100 \mumolar), 4'-hidroxiacetanilida (5 mmolar), polivinilpirrolidona (112 mmolar) y fosfato sódico, monobásico, 1-hidrato (10 mmolar).
La solución de conjugado que se usó en los
ejemplos contenía un conjugado (126 \mul/l) de estreptavidina y
peroxidasa de rábano obtenidos de fuentes comerciales (Zymed
Laboratories, Inc.), caseína (0,5%) y mertiolato (0,5%) en solución
salina con tampón fosfato (fosfato sódico 24 mmolar y cloruro sódico
75 mmolar). La concentración final del conjugado fue de 312
ng/ml.
La solución de lavado que se usó en los ejemplos
contenía cloruro sódico (373 mmolar), sal disódica de ácido
(etilendinitrilo)tetraacético (2,5 mmolar), decilsulfato
sódico (38 mmolar) y ácido etilmercuriotiosalicílico, sal sódica (25
\mumolar) en tampón fosfato sódico, monobásico
1-hidrato (25 mmolar, pH 7,4).
Se usó el anticuerpo monoclonal "TP4" en la
mezcla de reacción. Este anticuerpo es específico para la ADN
polimerasa de Thermus aquaticus y se describe con más detalle
en el documento recientemente concedido U.S.S.N. 07/958.144
(señalado arriba).
La mezcla para la reacción en cadena de la
polimerasa (100 ml) contenía tampón
tris(hidroximetil)aminometano (10 mmolar, pH 8),
cloruro potásico (50 mmolar), cloruro de magnesio (10 mmolar), dATP,
dCTP, dGTP y dTTP (1,5 molar de cada), cebadores (bien 0,4 ó 1
\mumolar de cada), gelatina (0,01%), la ADN polimerasa señalada
(bien 4 ó 16 unidades/100 \mul) y el anticuerpo monoclonal
"TP4" (proporción molar 50:1 con respecto a la ADN
polimerasa).
El resto de los reactivos y materiales se
obtuvieron mediante el uso de fuentes comerciales o se prepararon en
Eastman Kodak Company mediante el uso de procedimientos
convencionales.
\newpage
Ejemplos 1 &
2
Estos ejemplos son una demostración de la
presente invención para la coamplificación y detección de un ácido
nucleico diana de bajo número de copias, el ADN del
HIV-I, en presencia de un ácido nucleico diana de
alto número de copias, el ADN de la
\beta-globina.
La mezcla de reacción para PCR que se describió
arriba contenía o bien 5 o bien 10 copias del ADN del
HIV-I, aproximadamente 1 millón de copias del ADN de
la \beta-globina y diversas cantidades de la ADN
polimerasa y cebadores (0,4 o 1 \mumolar para cada cebador de cada
juego de cebadores).
Un protocolo de PCR de control incluía 40 ciclos
de amplificación, cada ciclo de:
1) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para
la desnaturalización (195 segundos para el primer ciclo únicamente),
y
2) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 30 segundos.
El protocolo de PCR de esta invención
incluía:
I) 25 ciclos de amplificación primarios, cada
ciclo de:
- A) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para la desnaturalización (195 segundos para el primer ciclo únicamente), y
- B, C) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC durante 30 segundos, y
II) 15 ciclos de amplificación secundarios, cada
ciclo de:
- A) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para la desnaturalización,
- A') renaturalización a 75ºC durante 15 segundos (ejemplo 1) o 30 segundos (ejemplo 2), y
- B, C) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC durante 30 segundos.
El primer conjunto de ensayos se llevó a cabo
mediante el uso de 16 unidades de ADN polimerasa/100 \mul y 10
copias del ADN del HIV-I en la mezcla de reacción.
El segundo conjunto de ensayos se llevó a cabo mediante el uso de 4
unidades de ADN polimerasa/100 \mul y 5 copias del ADN del
HIV-I en la mezcla de reacción.
La detección de los productos de amplificación se
llevó a cabo de la manera siguiente: se mezcló una parte (5 \mul)
de la mezcla de reacción de amplificación final con una solución
tampón [tris(hidroximetil)-aminometano (10
mmolar, pH 8), cloruro potásico (50 mmolar), cloruro de magnesio (10
mmolar) y gelatina (0,01%)] y se incubó a 95ºC durante 5 minutos
para desnaturalizar los ácidos nucleicos. La solución obtenida se
transfirió a continuación a dispositivos de pruebas SURECELL™ para
que los ácidos nucleicos diana amplificados pudieran hibridarse con
las sondas de captura a 50ºC.
Los pocillos de prueba de los dispositivos de
pruebas se lavaron a continuación a 55ºC con una solución tampón
[dihidrogenofosfato sódico (10 mmolar), cloruro sódico (150 mmolar),
decilsulfato de sodio (1%) y ácido etilendiamintetraacético (1
mmolar)] (250 \mul, pH 7,4). Se añadió la solución (50 \mul) de
conjugado de estreptavidina-peroxidasa señalada
arriba a cada pocillo de prueba y se dejó fluir a través de la
membrana a temperatura ambiente. Al cabo de dos minutos, los
pocillos de prueba se lavaron una segunda vez.
Se añadió la dispersión de colorante leuco (100
\mul) señalada arriba a cada pocillo de prueba, y se incubaron los
dispositivos a temperatura ambiente durante dos minutos. Se añadió
una solución (100 \mul) de azida de sodio (0,1%) para detener el
desarrollo de la coloración.
Las señales de coloración obtenidas que se
observaron en los ensayos se graduaron visualmente en una escala de
densidades desde 0 a 10 (densidad más elevada). Los resultados de
los ensayos se presentan en las tablas I y II abajo (la tabla I para
el primer conjunto de ensayos (ADN polimerasa elevada, 10 copias del
ADN del HIV-I), y la tabla II para el segundo
conjunto de ensayos (ADN polimerasa más baja, 5 copias del ADN del
HIV-I)).
Como se señaló arriba, el ejemplo 1 incluía una
etapa de renaturalización de 15 segundos, mientras que el ejemplo 2
incluía una etapa de renaturalización de 30 segundos. El ensayo
control no incluía etapa de renaturalización.
Se puede observar a partir de estos resultados
que la inclusión de una etapa de renaturalización de los productos
en los últimos ciclos de la PCR aumenta la señal que se obtiene de
la amplificación del ácido nucleico diana de bajo número de copias.
Esta mejoría se observó para ambos niveles de ADN polimerasa y
cebadores usados en los ensayos.
La invención se ha descrito en detalle con
referencia particular a realizaciones preferidas de la misma, pero
se entenderá que se pueden efectuar variaciones y modificaciones
dentro del alcance de la invención.
(I) INFORMACIONES GENERALES
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: CLINICAL DIAGNOSTIC SYSTEMS, INC.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO DE AMPLIFICACIÓN QUE USA UNA ETAPA INTERMEDIA DE RENATURALIZACIÓN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: MERCER, Christopher Paul
\hskip5cmCARPMAELS & RANSFORD
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\hskip1.4cm
43 BLOOMSBURY SQUARE,
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD:
\hskip1.2cm
LONDRES,
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\hskip1.4cm
-
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS:
\hskip2cm
REINO UNIDO
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: WC1A 2RA.
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: por asignar
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 DE JUNIO DE 1995
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: por asignar
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 08/264 102
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 22 DE JUNIO DE 1995
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: por asignar
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- MERCER, Christopher Paul
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: -
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/RESGUARDO: P14034EP
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA LAS TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 0171-242-8692
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 0171-405-4166
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador para el ADN del HIV-I
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: preparado por síntesis
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA: la misma
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: US-A-5.147.777
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador para el ADN del HIV-I
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: preparado por síntesis
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA: la misma
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: US-A-5.147.777
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador para el ADN de la \beta-globina
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: preparado por síntesis
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA: la misma
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: US-A-5.147.777
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAACTTCATC CACGTTCACC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cebador para el ADN de la \beta-globina
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: preparado por síntesis
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA: la misma
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: US-A-5.147.777
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACACAACTGGT GTTCACTAGC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5
\vskip0.666000\baselineskip
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: sonda para el ADN del HIV-I
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: preparado por síntesis
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA: la misma
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: US-A-5.147.777
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C
\hfill41
\vskip0.666000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: sonda para el ADN de la \beta-globina
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL: preparado por síntesis
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA: la misma
\vskip0.666000\baselineskip
- (x)
- INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN: US-A-5.147.777
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C
\hfill31
Claims (13)
1. Un procedimiento para la coamplificación de
dos o más ácidos nucleicos diana, comprendiendo dicho
procedimiento:
I) como mínimo 15 ciclos de amplificación
primarios de aproximadamente 20 a aproximadamente 360 segundos cada
uno, comprendiendo cada ciclo las etapas secuenciales de:
- A)
- calentar una mezcla de reacción de dos o más ácidos nucleicos diana o sus productos de elongación de los cebadores, siendo como mínimo uno de dichos ácidos nucleicos diana un ácido nucleico diana de bajo número de copias, y siendo como mínimo otro de dichos ácidos nucleicos diana un ácido nucleico diana de alto número de copias del que se sospecha que se encuentra presente en como mínimo aproximadamente 1000 veces la concentración de dicho ácido nucleico de bajo número de copias,
- dicho calentamiento llevándose a cabo a una primera temperatura, T_{1}, de aproximadamente 85 a aproximadamente 100ºC para la desnaturalización de las hebras de dichos ácidos nucleicos diana de alto y bajo número de copias o de sus productos de elongación de los cebadores,
- B) cebar dichas hebras desnaturalizadas con un juego de cebadores específicos para, y que se pueden hibridar con, hebras opuestas de cada ácido nucleico diana que se pretende amplificar, mediante el enfriamiento hasta una segunda temperatura, T_{2}, que se define como:
(T_{mH} - 15)^{o}C
\leq T_{2} \leq (T_{mH} +
5)^{o}C
- en la que T_{mH} es la temperatura de fusión de los cebadores para el ácido nucleico diana de alto número de copias,
- C)
- bien sea como prolongación de la etapa B), o en una etapa distinta, formar productos de elongación de los cebadores en una mezcla de reacción de reactivos para PCR, por incubación a una tercera temperatura, T_{3}, que se define como:
(T_{mH} - 15)^{o}C
\leq T_{3} \leq (T_{mH} +
15)^{o}C,
- siempre que la diferencia entre T_{mH} y la temperatura de fusión de los cebadores para el ácido nucleico diana de bajo número de copias (T_{mL}) es de aproximadamente 0 a aproximadamente 8ºC y que, cuando el cebado y la formación de productos de elongación de los cebadores se llevan a cabo en la misma etapa, T_{2} y T_{3} sean idénticas, y
II) como mínimo 5 ciclos de amplificación
secundarios de aproximadamente 20 a aproximadamente 360 segundos
cada uno, comprendiendo cada ciclo la repetición de las etapas A) a
C) identificadas arriba secuencialmente,
- siempre que entre las etapas A) y B) de cada ciclo de amplificación secundario, la mezcla de reacción se enfríe hasta y se mantenga a una cuarta temperatura, T_{4}, que se define como:
(T_{mH} + 5)^{o}C
\leq T_{4} \leq
T_{PH}
- en la que T_{PH} es la temperatura de fusión de la doble hebra de dicho ácido nucleico diana de alto número de copias, durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 120 segundos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que las etapas B) y C) de los ciclos de amplificación tanto
primarios como secundarios se llevan a cabo en la misma etapa a la
misma temperatura que es de aproximadamente 62 a aproximadamente
68ºC.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2 en el que dicho ácido nucleico diana de bajo número
de copias está asociado con un agente infeccioso, como un agente
infeccioso viral, en particular o bien el HIV-I o el
HIV-II.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que uno de los dos o ambos cebadores
específicos para el ácido nucleico diana de bajo número de copias se
encuentran biotinilados, y la detección de dicho ácido nucleico
diana de bajo número de copias se lleva a cabo por captura de la
hebra biotinilada amplificada obtenida mediante el uso de un
oligonucleótido insolubilizado complementario con respecto a la
misma, y detección de dicha hebra biotinilada con un conjugado de
estreptavidina marcado de forma detectable.
\newpage
5. El procedimiento de la reivindicación 4 en el
que dicho oligonucleótido insolubilizado se encuentra unido de forma
covalente con una partícula magnética o polimérica.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en el que T_{4} se encuentra dentro del
intervalo de aproximadamente 65 a aproximadamente 90ºC.
7. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6 que comprende de 15 a 35 ciclos de
amplificación primarios y de 5 a 15 ciclos de amplificación
secundarios.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en el que cada ciclo de amplificación
primario y secundario se lleva a cabo en como mucho de
aproximadamente 30 a aproximadamente 120 segundos.
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dicha mezcla de reacción comprende
un juego de cebadores para dicho ácido nucleico diana de bajo número
de copias, un juego de cebadores para dicho ácido nucleico diana de
alto número de copias, como mínimo cuatro dNTP distintos, una ADN
polimerasa termoestable, y un cofactor para dicha ADN
polimerasa.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que se amplifican tres o más ácidos
nucleicos mediante el uso de un juego de cebadores para cada ácido
nucleico diana.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 en el que cada temperatura de fusión se
calcula mediante el uso de la fórmula:
T_{m} = 67,5 + 0,34 (%G + C)
-
395/N
en la que G y C representan el número de
nucleótidos de guanina y de citosina, respectivamente, y N
representa el número total de nucleótidos, en el
oligonucleótido.
12. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 en el que la etapa A) se lleva a cabo a
aproximadamente 95ºC, las etapas B) y C) se combinan y llevan a cabo
a una temperatura de aproximadamente 64ºC y T_{4} es
aproximadamente 75ºC.
13. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 en el que la concentración inicial de
cebadores para los ácidos nucleicos diana tanto de alto como de
bajo número de copias en la mezcla de reacción es la misma.
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|---|---|---|---|
| US264102 | 1988-10-28 | ||
| US08/264,102 US5559013A (en) | 1994-06-22 | 1994-06-22 | Method of amplification using intermediate renaturation step |
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