ES2219655T3 - Coamplificacion de acidos nucleicos diana usando un agente de exclusion de volumen en una composicion de reaccion, kit de pruebas y dispositivos de pruebas de utilidad para ello. - Google Patents
Coamplificacion de acidos nucleicos diana usando un agente de exclusion de volumen en una composicion de reaccion, kit de pruebas y dispositivos de pruebas de utilidad para ello.Info
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Abstract
SE AMPLIFICAN MULTIPLES ACIDOS NUCLEICOS DE OBJETIVO QUE USAN REACCION EN CADENA DE POLIMERASA EN PRESENCIA DE UN AGENTE DE EXCLUSION DE VOLUMEN POLIMERICO. LA EFICIENCIA DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS DE BAJO OBJETIVO DE COPIA SE INCREMENTA EN PRESENCIA DEL AGENTE DE EXCLUSION DE VOLUMEN INCLUSO AUNQUE SE USEN NIVELES DE CEBO REDUCIDO. DE ESTA MANERA, LA EFICIENCIA DE AMPLIFICACION DE UN ACIDO NUCLEICO DE OBJETIVO DADO PUEDE SER MANIPULADO MAS FACILMENTE.
Description
Coamplificación de ácidos nucleicos diana usando
un agente de exclusión de volumen en una composición de reacción,
kit de pruebas y dispositivo de pruebas de utilidad para ello.
Esta invención se refiere a un procedimiento
rápido de coamplificación de dos o más ácidos nucleicos de dos
hebras usando un agente de exclusión de volumen en la mezcla de
reacción, y en el que por lo menos un ácido nucleico diana es un
ácido nucleico diana de bajo número de copias, y por lo menos un
ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de alto número de
copias. También se refiere a una composición de reacción, un kit de
pruebas y un dispositivo de pruebas que son útiles para llevar a
cabo el procedimiento de la invención.
La detección de ácidos nucleicos ha aumentado en
los últimos años como medio para la detección precoz de
características genómicas, agentes infecciosos y diversos organismos
que se encuentran presentes en muy pequeñas cantidades en una
muestra de prueba humana o animal. Los procedimientos de detección
se fundamentan normalmente en el concepto de complementariedad por
el cual dos hebras de ADN están unidas entre sí por enlaces de
hidrógeno y otras fuerzas entre los nucleótidos complementarios (que
se conocen como pares de nucleótidos).
Una molécula de ADN es normalmente bastante
estable, pero se pueden separar o desnaturalizar las hebras mediante
ciertas condiciones, tales como el calentamiento. Las hebras
desnaturalizadas se volverán a asociar únicamente con otra hebra que
posea una secuencia complementaria de nucleótidos.
Se han llevado a cabo muchas investigaciones para
encontrar formas de detectar únicamente unas pocas moléculas de ADN.
Se conocen diversos procedimientos y éstos se han usado durante casi
una década para amplificar o multiplicar en gran medida el número de
ácidos nucleicos en una muestra para su detección. Tales técnicas de
amplificación incluyen a la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), a la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y otras que están
menos desarrolladas.
La PCR es la que mejor se conoce e implica la
hibridación de cebadores con las hebras de un ácido nucleico diana
en presencia de un agente de polimerización del ADN y de
desoxirribonucleótidos trifosfato en condiciones apropiadas. El
resultado es la formación de productos de elongación de los
cebadores a lo largo de varios ciclos y la multiplicación
exponencial del número de hebras diana originales. Se pueden
encontrar detalles adicionales sobre la PCR consultando los
documentos US-A-4.683.195 (Mullis y
col.), US-A-4.683.202 (Mullis) y
US-A-4.965.188 (Mullis y col.).
Las muestras humanas y animales contienen muchos
ácidos nucleicos distintos, algunos de los cuales son endógenos (o
naturales) para la persona o el animal, y otros que se producen como
consecuencia de algún estado anormal, tal como por la presencia de
un agente infeccioso o en un estado oncogénico. Tales ácidos
nucleicos se encuentran habitualmente presentes en concentraciones
muy bajas en comparación con los ácidos nucleicos endógenos. A veces
se les denomina ácidos nucleicos "de bajo número de copias". A
modo de comparación, los ácidos nucleicos endógenos se encuentran
habitualmente presentes en altas concentraciones y se les puede
denominar ácidos nucleicos "de alto número de copias". Un
ejemplo así es el ADN de la \beta-globina
humana.
A menudo, al usar la PCR, dos o más ácidos
nucleicos presentes en la muestra se amplifican a la par en el mismo
recipiente de reacción. Esto se identifica en la presente invención
como "coamplificación". Este procedimiento requiere que
cebadores para cada ácido nucleico que se pretende amplificar se
encuentren simultáneamente presentes en el recipiente.
Cuando en tales situaciones se amplifican a la
par ácidos nucleicos diana de bajo y alto número de copias, la
amplificación del ácido nucleico diana de bajo número de copias se
encuentra a menudo impedida. Esto se debe a la saturación de la
enzima amplificadora (como la ADN polimerasa) por el ácido nucleico
diana de alto número de copias durante los últimos ciclos de
amplificación. Se producirían probablemente resultados de falso
negativo en cuanto a la presencia del ácido nucleico diana de bajo
número de copias, con consecuencias que pueden ser serias.
Se han propuesto varias soluciones al problema
para la PCR, incluidos el ajuste de las concentraciones de los
cebadores, el uso de juegos de cebadores con temperaturas de fusión
(Tm) específicas, o combinaciones de los mismos. Al ajuste de las
proporciones de cebadores se lo ha denominado en la técnica
"sesgar" el producto de la PCR "por los cebadores", y éste
requiere una disminución de la concentración de los cebadores para
el ácido nucleico diana de alto número de copias. Sólo se consigue
un control modesto del procedimiento con esta aproximación.
Otra aproximación a la coamplificación ha sido la
de ajustar la temperatura de hibridación en la PCR de tal manera que
los cebadores para el ácido nucleico diana de alto número de copias
se hibridan en menor medida que aquellos para el ácido nucleico
diana de bajo número de copias. Esta aproximación también presenta
un problema. La diferencia de T_{m} entre las parejas de
cebadores debe ser relativamente importante antes de que se pueda
ejercer una buena modulación de la PCR sobre las producciones
diferenciales de los ácidos nucleicos de alto y bajo número de
copias. No se pueden calcular T_{m} exactas (aunque se pueden
estimar), y por lo tanto, hay que medirlas. Esto requiere una gran
cantidad de esfuerzo, y es de considerable pesadez.
Cada una de estas aproximaciones para modular la
coamplificación requiere que se conozcan las secuencias de los
ácidos nucleicos diana de alto y bajo número de copias.
Alternativamente, aumentar el tiempo para las
etapas de cebado o de elongación en la PCR en los últimos ciclos
puede minimizar la saturación de la ADN polimerasa por el ácido
nucleico diana de alto número de copias y aumentar la eficiencia de
la amplificación. Sin embargo, esta solución tiene una utilidad
limitada en situaciones en las que se están amplificando
simultáneamente muchos ácidos nucleicos que se encuentran presentes
en concentraciones variables.
Se sabe que la velocidad de hibridación de los
ácidos nucleicos aumenta considerablemente en presencia de agentes
de exclusión de volumen tales como el sulfato de dextrano o el
polietilenglicol debido a la exclusión de los ácidos nucleicos del
volumen de solución ocupado por los agentes [Sambrook y col.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, página 9.50, 1989, y
el documento US-A-5.106.730 (Van
Ness y col.)]. Este efecto de exclusión aumenta la concentración
real de los ácidos nucleicos en la solución, y aumenta de ese modo
la velocidad de hibridación. Por eso, se añaden tales materiales de
manera habitual a las mezclas de reacción para "empujar" las
reacciones desfavorables hacia delante. Por ejemplo, se añaden a las
mezclas de reacción para "empujar" las reacciones de la ligasa,
documentos US-A-5.185.243 (Ullman y
col.) y US-A-5.194.370 (Berninger y
col.).
Sin embargo, aunque las velocidades de
hibridación aumentan con agentes de exclusión de volumen, Sambrook y
col. no recomiendan su uso a menos que la velocidad de hibridación
sea normalmente lenta, o que el ácido nucleico sea un factor
limitante de velocidad en la reacción. Aparte de esto, se sabe que
los agentes llevan a veces a señales de fondo elevadas y las
soluciones resultantes son más difíciles de manipular debido a su
viscosidad más elevada. Así, la técnica sugeriría que se
restringieran los agentes de exclusión de volumen a ciertas
condiciones de hibridación, y como lo muestran las patentes
mencionadas anteriormente, en la práctica solo se usan en aquellas
circunstancias en las que hay que empujar reacciones desfavorecidas
hacia delante porque de lo contrario no se producirían a velocidades
razonables. Sugimoto y col., Analytical Biochemistry, vol. 211,
1993, 170-172, presentan un procedimiento para la
coamplificación de dos ácidos nucleicos diana en el que uno de éstos
se encuentra presente en la muestra en diversas proporciones
(incluido "a bajo número de copias") con respecto al otro.
Sería deseable conseguir una amplificación rápida
y eficiente de uno o más ácidos nucleicos diana cuando se someten a
coamplificación en presencia de uno o más otros ácidos nucleicos
diana de una manera que supere los problemas indicados
anteriormente.
Los problemas indicados arriba se superan con un
procedimiento para la coamplificación de dos o más ácidos nucleicos
diana, procedimiento que comprende como mínimo 15 ciclos de
amplificación primarios, cada ciclo de amplificación primario
constando de las etapas secuenciales de:
A) calentar una mezcla de reacción de dos o más
ácidos nucleicos diana, o sus productos de elongación de los
cebadores, a una primera temperatura, T_{1}, para las
desnaturalización de las hebras de los ácidos nucleicos diana o de
sus productos de elongación de los cebadores,
B) cebar las hebras desnaturalizadas con un juego
de cebadores específicos para, y que se pueden hibridar con, hebras
opuestas de cada ácido nucleico diana que se pretende amplificar,
mediante el enfriamiento hasta una segunda temperatura, T_{2},
y
C) bien sea como prolongación de la etapa B), o
en una etapa distinta, formar productos de elongación de los
cebadores en una mezcla de reacción de reactivos de PCR, por
incubación a una tercera temperatura, T_{3}, siempre que, cuando
el cebado y la formación de productos de elongación de los cebadores
se llevan a cabo en la misma etapa, T_{2} y T_{3} sean
idénticas,
en el que la mezcla de reacción en por lo menos
uno de los ciclos de amplificación primarios comprende por lo menos
4% en peso aproximadamente de un agente de exclusión de volumen
polimérico, no iónico, y en el que por lo menos un ácido nucleico
diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias, y por lo
menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de alto
número de copias.
Esta invención proporciona también un
procedimiento para la coamplificación de dos o más ácidos nucleicos
diana y la detección de uno o más de los ácidos nucleicos diana,
procedimiento que comprende como mínimo 15 ciclos de amplificación
primarios, cada ciclo de amplificación primario constando de las
etapas secuenciales de:
A) calentar una mezcla de reacción de dos o más
ácidos nucleicos diana, o sus productos de elongación de los
cebadores, a una primera temperatura, T_{1}, para las
desnaturalización de las hebras de los ácidos nucleicos diana o de
sus productos de elongación de los cebadores,
B) cebar las hebras desnaturalizadas con un juego
de cebadores específicos para, y que se pueden hibridar con, hebras
opuestas de cada ácido nucleico diana que se pretende amplificar,
mediante el enfriamiento hasta una segunda temperatura, T_{2},
C) bien sea como prolongación de la etapa B), o
en una etapa distinta, formar productos de elongación de los
cebadores en una mezcla de reacción de reactivos de PCR, por
incubación a una tercera temperatura, T_{3}, siempre que, cuando
el cebado y la formación de productos de elongación de los cebadores
se llevan a cabo en la misma etapa, T_{2} y T_{3} sean
idénticas,
en el que la mezcla de reacción en por lo menos
uno de los ciclos de amplificación primarios comprende por lo menos
4% en peso aproximadamente de un agente de exclusión de volumen
polimérico, no iónico, y en el que por lo menos un ácido nucleico
diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias, y por lo
menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de alto
número de copias, y
D) después del último ciclo de amplificación
primario, detectar uno o más de los productos de extensión de los
cebadores como indicación de uno o más de los ácidos nucleicos
diana.
Además, un procedimiento para la coamplificación
de dos o más ácidos nucleicos diana, en el que por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
y por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de
alto número de copias, y en el que el procedimiento usa una
composición de reacción de amplificación que se encuentra
amortiguada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9, que
comprende:
uno o más conjuntos de cebadores,
una ADN polimerasa termoestable,
una pluralidad de dNTP, y
por lo menos aproximadamente 4% en peso de un
agente de exclusión de volumen polimérico, no iónico.
Un procedimiento para la coamplificación de dos o
más ácidos nucleicos diana, en el que por lo menos un ácido nucleico
diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias, y por lo
menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de alto
número de copias, y en el que el procedimiento usa un kit de pruebas
que comprende, envasados por separado:
a) una composición de reacción de amplificación
amortiguada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 y que
comprende:
uno o más conjuntos de cebadores,
una ADN polimerasa termoestable,
una pluralidad de dNTP, y
por lo menos aproximadamente 4% en peso de un
agente de exclusión de volumen polimérico, no iónico, y
b) un reactivo de captura que consta de un
oligonucleótido inmovilizado sobre un sustrato insoluble en el
agua.
Además, un procedimiento para la coamplificación
de dos o más ácidos nucleicos diana, en el que por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
y por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de
alto número de copias, y en el que el procedimiento usa un
dispositivo para pruebas independiente que comprende, en
compartimientos distintos:
a) una composición de reacción de amplificación
amortiguada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 y que
comprende:
uno o más conjuntos de cebadores,
una ADN polimerasa termoestable,
una pluralidad de dNTP, y
por lo menos aproximadamente 4% en peso de un
agente de exclusión de volumen polimérico, no iónico, y
b) un reactivo de captura que consta de un
oligonucleótido inmovilizado sobre un sustrato insoluble en el agua,
los compartimientos encontrándose conectados en el dispositivo para
pruebas de modo que se puede llevar la composición de reacción de
amplificación en contacto con el reactivo de captura después de la
amplificacion sin abrir el dispositivo para pruebas.
La presente invención proporciona un
procedimiento muy rápido y eficaz para amplificar con mayor
preferencia un ácido nucleico en una mezcla de uno o más otros
ácidos nucleicos que se están amplificando conjuntamente. La
invención se usa para amplificar y detectar con mayor preferencia un
ácido nucleico diana de bajo número de copias con respecto a ácidos
nucleicos diana de alto número de copias amplificados. En tales
casos, la inhibición de la amplificación de los ácidos nucleicos
diana de bajo número de copias por los ácidos nucleicos diana de
alto número de copias, se encuentra reducida. En otros casos, se
puede usar la invención para manipular la amplificación de un ácido
nucleico diana con respecto a los demás por diversos motivos.
Las ventajas de esta invención se consiguen
mediante la inclusión de un agente de exclusión de volumen
polimérico, no iónico, hinchable en el agua o hidrosoluble dentro de
la mezcla de reacción de amplificación en por lo menos un ciclo de
amplificación. La presencia de este agente permite eficazmente al
usuario reducir la cantidad de cebador necesario para la
amplificación eficaz de los ácidos nucleicos, reducción que permite
entonces la manipulación del procedimiento para que un ácido
nucleico se amplifique con mayor preferencia. De este modo, se puede
usar el cebador como un reactivo limitante de la velocidad.
Además, el agente de exclusión de volumen aumenta
también la velocidad de renaturalización de los productos de la
reacción de amplificación, lo cual reduce aún más la eficiencia de
amplificación para los ácidos nucleicos diana de alto número de
copias con respecto a los ácidos nucleicos diana de bajo número de
copias.
En formas de realización preferidas, la
concentración de cada cebador que se usa en la amplificación es
bastante baja con respecto a las concentraciones convencionales.
Esta baja concentración es posible gracias a la presencia del agente
de exclusión de volumen y permite de manipular aún más la
coamplificación de múltiples ácidos nucleicos diana.
Considerando las enseñanzas de la técnica, en
particular, Sambrook y col., no se usarían los agentes de exclusión
de volumen en los procedimientos de amplificación ya que las
velocidades de hibridación son relativamente altas en estos
procedimientos y que los ácidos nucleicos diana no se encuentran
presentes en cantidades que limiten la velocidad. Además, se
esperaría que los agentes "empujaran" a todas las reacciones
desfavorables y crearan producto no deseado en cantidad
considerable. No parece que esto sea el caso con la presente
invención. Por lo tanto, las ventajas proporcionadas por la presente
invención no se esperaban.
Los procedimientos de amplificación de esta
invención se llevan a cabo en condiciones que se conocen como
condiciones "muy rigurosas", lo cual significa que los
cebadores hibridan específicamente con las hebras de los ácidos
nucleicos diana de interés en condiciones de pH, temperatura y otras
condiciones de reacción rigurosas de manera relativamente
rápida.
Los principios y condiciones generales para la
amplificación y detección de ácidos nucleicos mediante el uso de la
reacción en cadena de la polimerasa son bastante bien conocidos, y
sus detalles se proporcionan en numerosas referencias que incluyen
los documentos US-A-4.683.195,
US-A-4.683.202 y
US-A-4.965.188 (señalados arriba).
Por lo tanto, considerando las enseñanzas en la técnica y las
enseñanzas específicas proporcionadas en la presente invención, un
trabajador con experiencia en la materia no debería experimentar
dificultades para practicar la presente invención al hacer los
ajustes enseñados en la presente invención para efectuar una
coamplificación de dos o más ácidos nucleicos, uno de los cuales es
preferentemente un ácido nucleico diana de bajo número de
copias.
La presente invención está encaminada a la
amplificación y detección de una o más secuencias de ácido nucleico
específicas presentes en uno o más ácidos nucleicos diana de bajo
número de copias en una muestra de prueba simultáneamente con la
amplificación de una o más secuencias de ácido nucleico presentes en
uno o más ácidos nucleicos diana de alto número de copias. Por lo
general, un ácido nucleico diana de bajo número de copias se
encuentra presente en una muestra en una cantidad inferior a
aproximadamente 10^{-16} molar, sin embargo, la cantidad puede ser
superior si los ácidos nucleicos de alto número de copias se
encuentran presentes en cantidades mucho mayores, por ejemplo, a una
concentración como mínimo 1000 veces superior. Los ácidos nucleicos
diana de alto número de copias son aquellos que están por lo general
asociados a genes de copia única mientras que los ácidos nucleicos
diana de bajo número de copias son por lo general aquellos que están
asociados con agentes infecciosos, cánceres y otros estados
patológicos en un ser humano o animal.
Además, se puede usar el ácido nucleico diana de
alto número de copias como un "control positivo" en un ensayo.
Mediante la modulación de la eficiencia de la PCR del ácido nucleico
diana de alto número de copias, el control positivo puede ser
detectable únicamente si la PCR se llevó a cabo eficientemente,
reduciendo así la probabilidad de falsos negativos. En tales casos,
el ácido nucleico diana de alto número de copias puede encontrarse
presente a 10 o más veces la concentración del ácido nucleico diana
de bajo número de copias.
Las muestras de prueba pueden incluir material
celular o vírico, cabello, fluidos corporales u otros materiales que
contienen ADN o ARN genético que se pueda detectar. Se pueden
obtener los ácidos nucleicos diana de distintas fuentes que incluyen
los plásmidos, y el ADN o ARN natural de cualquier fuente (tal como
bacterias, levaduras, virus, plantas, animales superiores o seres
humanos). Se puede extraer de distintos tejidos que incluyen la
sangre, las células mononucleares de sangre periféricas (PBMC),
otros materiales tisulares u otras fuentes conocidas en la técnica
mediante el uso de procedimientos conocidos. La presente invención
es particularmente útil para la coamplificación y detección de
secuencias de ácidos nucleicos que se encuentran en el ADN genómico,
el ADN bacteriano, el ADN provírico, el ADN fúngico, el ARN vírico,
o el ADN o el ARN que se encuentra en células infectadas por
bacterias o virus. Además, las secuencias de ácidos nucleicos
asociadas con marcadores de cánceres se pueden amplificar y detectar
mediante el uso de la presente invención.
Las bacterias que se pueden detectar incluyen,
pero no se restringen a, las bacterias que se encuentran en la
sangre humana, las especies de Salmonella, las especies de
Chlamydia, las especies de Neisseria, las especies de
Shigella, y las especies de Mycobacterium. Los virus
que se pueden detectar incluyen, pero no se restringen a, los virus
herpes simplex, el virus de Epstein-Barr, el
citomegalovirus humano, el virus del papiloma humano, los virus de
la hepatitis y los retrovirus tales como HTLV-I,
HTLV-II, HIV1 y HIV2. También son detectables los
parásitos protozoos, las levaduras y los mohos. Otras especies
detectables se harían inmediatamente manifiestas para aquél experto
en la materia. La invención es particularmente útil para la
detección de la presencia del ADN asociado con un ADN retroviral
(HIV1 o HIV2) o una especie de Mycobacterium. Muy
preferentemente, se usa para detectar el ADN asociado con el HIV1,
el HIV1 provírico, el HIV2 o el HIV2 provírico.
Un "reactivo para PCR" se refiere a
cualquiera de los reactivos que se usan en general en una PCR, a
saber un juego de cebadores para las hebras opuestas de cada ácido
nucleico diana, una ADN polimerasa, un cofactor para la ADN
polimerasa, y dos o más
desoxirribonucleósidos-5'-trifosfato
(dNTP).
El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido, bien sea natural o producido por síntesis, que es
capaz de hacer las veces de punto de iniciación de la síntesis
cuando se pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un
producto de elongación del cebador complementario de una hebra de
ácido nucleico (es decir, plantilla). Tales condiciones incluyen la
presencia de los demás reactivos para PCR, y una temperatura y un pH
adecuados. Normalmente, tales condiciones son las que se conocen en
la técnica como condiciones "muy rigurosas" a fin de que la
amplificación no especifica se encuentre reducida. El cebador debe
ser suficientemente largo para iniciar la síntesis de productos de
elongación en presencia de la ADN polimerasa. El tamaño exacto de
cada cebador variará según el uso que se contempla, la complejidad
de la secuencia tomada por diana, la temperatura de reacción y la
fuente del cebador. Por lo general, los cebadores que se usan en
esta invención tendrán de 10 a 60 nucleótidos.
Se pueden obtener cebadores de varias fuentes o
prepararlos mediante el uso de técnicas y equipos conocidos, que
incluyen por ejemplo, un sintetizador de ADN ABI (que se puede
conseguir de Applied Biosystems) o un sintetizador Biosearch de la
serie 8600 o de la serie 8800 (que se puede conseguir de
Milligen-Biosearch, Inc.) y los procedimientos
conocidos para su uso (por ejemplo como se describe en el documento
US-A-4.965.188, señalado arriba).
Los cebadores naturales aislados de fuentes biológicas son también
útiles (tales como productos de digestión de endonucleasas de
restricción). Por lo general se usa un juego de como mínimo dos
cebadores para cada ácido nucleico diana. Por lo tanto, se puede
usar una pluralidad de juegos de cebadores simultáneamente para
amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana. Además, un
juego de cebadores puede incluir una mezcla de cebadores para un
ácido nucleico diana determinado.
Las ADN polimerasas son bien conocidas como
enzimas que esterifican y añaden moléculas de desoxinucleósido
monofosfato al extremo 3'-hidroxílico del cebador
mediante un enlace fosfodiéster al cebador, siendo la síntesis
dirigida por la plantilla. Las ADN polimerasas de utilidad incluyen
por ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN
polimerasa de T4, la polimerasa de Klenow, la transcriptasa inversa
y otras que se conocen en la técnica.
La ADN polimerasa es preferentemente
"termoestable", lo cual significa que es por lo general estable
a las altas temperaturas que se usan para la desnaturalización de
hebras de ADN. Más concretamente, las ADN polimerasas termoestables
no se inactivan considerablemente a las altas temperaturas que se
usan en la PCR. Tales temperaturas variarán en función de una serie
de condiciones de reacción, que incluyen el pH, la concentración en
sales, y otras condiciones que se conocen en la técnica.
Se ha informado acerca de varias ADN polimerasas
termoestables en la técnica, incluidas aquellas que se mencionan en
detalle en los documentos
US-A-4.965.188 (señalado arriba) y
US-A-4.889.818 (Gelfand y col.), que
se incorporan a la presente memoria descriptiva a modo de
referencia. Son polimerasas particularmente útiles aquellas que se
obtienen de distintas especies bacterianas de Thermus, tales
como Thermus aquaticus, Thermus
filiformis, Thermus flavus o Thermus
thermophilus. Otras polimerasas termoestables útiles se
obtienen de una diversidad de otras fuentes microbianas que incluyen
Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, la
especie de Thermotoga y aquellas que se describen en el
documento WO-A-89/06691 (publicado
el 27 de julio de 1989). Algunas enzimas útiles se encuentran
disponibles en el mercado. Se conocen varias técnicas para aislar
polimerasas naturales de organismos. La clonación y otras técnicas
de síntesis para la preparación de polimerasas mediante el uso de
técnicas recombinantes son también conocidas a partir de las
técnicas citadas arriba, incluida la patente de Gelfand y col.
Un cofactor para la ADN polimerasa se refiere a
un compuesto no proteico del que depende la enzima para su
actividad. Se conocen varios materiales semejantes en la técnica,
incluidas sales de manganeso y magnesio. Los cofactores de utilidad
incluyen, pero no se restringen a, los cloruros, sulfatos, acetatos
y sales de ácidos grasos, de manganeso y de magnesio. Se prefieren
los cloruros, sulfatos y acetatos, y se prefieren particularmente
los cloruros y sulfatos de magnesio.
Para la PCR se necesitan también dos o más
desoxirribonucleósidos-5'-trifosfato,
tales como el dATP, el dCTP, el dGTP, el dTTP y el dUTP. También son
de utilidad análogos tales como el dITP y el
7-deaza-dGTP. Con preferencia, se
usan los cuatro trifosfatos comunes (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) en la
PCR.
También es útil en la práctica de la invención un
anticuerpo específico para la ADN polimerasa, anticuerpo que inhibe
la actividad enzimática de ésta a temperaturas por debajo de
aproximadamente 50ºC, pero anticuerpo que se desactiva a
temperaturas superiores. Se describen anticuerpos monoclonales
representativos que poseen estas propiedades en el documento
US-A-5.338.671 (por Scalice y col.),
que se incorpora a la presente invención a modo de referencia. Se
pueden usar fragmentos de anticuerpos en lugar de la molécula
completa. si poseen propiedades equivalentes.
Una composición para reacción de PCR típica
contiene como mínimo uno o más conjuntos de cebadores para los
ácidos nucleicos diana, una ADN polimerasa termoestable (tal como se
definió arriba), una pluralidad de dNTP (tales como los cuatro dNTP
convencionales) y uno o más agentes de exclusión de volumen
poliméricos, no iónicos, hinchables en el agua o hidrosolubles.
Además, son no iónicos, y de ese modo se excluye
del alcance de esta invención los materiales catiónicos, aniónicos o
anfóteros que pueden perjudicar la PCR.
Los agentes de exclusión de volumen son
poliméricos, lo cual significa que comprenden típicamente una
pluralidad de unidades que se repiten, y por lo general poseen un
peso molecular medio de aproximadamente 1000 a aproximadamente
20.000 Dalton, prefiriéndose un peso molecular en el intervalo de
aproximadamente 3000 a aproximadamente 12.000 Dalton.
Las clases de materiales útiles que se pueden
usar como agentes de exclusión de volumen en la práctica de esta
invención incluyen, pero no se restringen a, los poliéteres, los
productos de reacción de un azúcar sencillo (tal como la dextrosa o
la glucosa) con la epiclorohidrina, los polisacáridos, los
poliacrilatos y materiales similares inmediatamente obvios para
aquél experto la materia.
Se prefieren los poliéteres. Se pueden
representar de manera general por la fórmula:
H-(-O-R-)_{n}-H
en la que R es alquileno de 1 a 6
átomos de carbono y n es un número entero de 15 a 1000 (basado en el
peso medio). Por ejemplo, R puede ser 1,2-etileno,
1,2-propileno,
2-hidroxi-1,3-propileno,
3-hidroxi-1,2-propileno,
1,4-butileno, 1,3-butileno,
1,2-hexileno y otros grupos alquileno bivalentes que
serían inmediatamente obvios para aquél experto en la materia. Con
preferencia, R es 1,2-etileno o
1,2-propileno como en el polióxido de etileno o el
polióxido de propileno, que se conocen comúnmente como
polietilenglicol y polipropilenglicol,
respectivamente.
En la fórmula indicada, el número entero "n"
representa el peso molecular medio en peso del compuesto dividido
por el peso molecular de la unidad monomérica. Para los compuestos
preferidos indicados en el párrafo anterior, los pesos moleculares
medios son como mínimo aproximadamente 1000, preferentemente como
mínimo aproximadamente 3000, y por lo general hasta aproximadamente
20.000. Aquél experto en la materia puede determinar fácilmente el
número de unidades "n" apropiado para un compuesto y un peso de
compuesto determinados. Por lo general, n es un número entero de 15
a 1000. Tal y como se usa en la definición de los pesos moleculares,
el término "aproximadamente" se refiere a una varianza de \pm
10%.
También se encuentran incluidos en la definición
de poliéteres los productos de condensación del óxido de etileno,
del óxido de propileno o de otros óxidos de alquileno o diversos
grupos funcionales tales como dioles, trioles, azúcares o ácidos,
incluidos los poliglicidoles. Tales materiales son bien conocidos en
la técnica como tensioactivos o detergentes no iónicos y pueden ser
de utilidad en la presente invención a condición de que cumplan los
criterios de solubilidad en el agua o aptitud a hincharse en el agua
requeridos.
Los polisacáridos no iónicos de utilidad en la
práctica de esta invención incluyen el dextrano, el glucógeno y
otros polisacáridos inmediatamente obvios para aquél experto en la
materia.
Los ejemplos de poliacrilatos incluyen, pero no
se restringen al poli(hidroxietil acrilato), el
poli(2,3-dihidroxipropil acrilato) y otros
poliacrilatos inmediatamente obvios para aquél experto en la
materia.
Los reactivos para PCR que se describen en la
presente invención se proporcionan y se usan en la PCR en
concentraciones adecuadas para proporcionar la amplificación del
ácido nucleico diana. La cantidad mínima de ADN polimerasa es por lo
general como mínimo aproximadamente 1 unidad/100 \mul de solución,
prefiriéndose de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 unidades/100
\mul. Una "unidad" se define en la presente invención como la
cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar 10 nmoles
de nucleótidos totales (dNTP) dentro de una cadena de ácido nucleico
en elongación en 30 minutos a 74ºC. La concentración de cada cebador
es de por lo menos aproximadamente 0,025 \mumolar, e inferior a
aproximadamente 1 \mumolar, prefiriéndose de aproximadamente 0,05
a aproximadamente 0,2 \mumolar. Todos los cebadores se encuentran
presentes en aproximadamente la misma cantidad (dentro de una
variación del 10% de cada uno de ellos). El cofactor se encuentra
generalmente presente en una cantidad de aproximadamente 1 a
aproximadamente 15 mmolar, y cada dNTP se encuentra generalmente
presente a desde aproximadamente 0,15 a aproximadamente 3,5 mmolar
en la mezcla de reacción. El agente de exclusión de volumen se
encuentra presente en una cantidad de por lo menos aproximadamente 4
por ciento en peso, prefiriéndose cantidades dentro del intervalo de
aproximadamente 6 a aproximadamente 12% en peso. Tal y como se usa
en la definición de las cantidades de materiales, el término
"aproximadamente" se refiere a una variación de \pm 10% de la
cantidad indicada.
Los reactivos para la PCR pueden suministrarse
por separado, o en una solución amortiguada que tiene un pH en el
intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 mediante el uso
de cualquier tampón adecuado. Por lo tanto, una mezcla de reacción
para PCR puede contener un juego de cebadores para cada ácido
nucleico diana de bajo número de copias, un juego de cebadores para
cada ácido nucleico diana de alto número de copias, dNTP adecuados,
una ADN polimerasa termoestable, un cofactor para la ADN polimerasa,
uno o más agentes de exclusión de volumen, y cualquier otro artículo
adicional que un experto en la materia considerase útil en la
amplificación o detección final de los ácidos nucleicos diana.
Se puede obtener un ácido nucleico diana de una
cualquiera de diversas fuentes como se indicó arriba. Por lo
general, hay que extraerlo de alguna manera para volverlo disponible
para el contacto con los cebadores y otros materiales de reacción.
Habitualmente, esto significa eliminar proteínas y elementos
celulares no deseados de la muestra de una manera adecuada. Se
conocen diversos procedimientos en la técnica, incluidos aquellos
descritos por Laure y col. en The Lancet, pp.
538-540 (3 de septiembre de 1988), Maniatis y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp.
280-281 (1982), Gross-Belland y col.
en Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973) y el documento
US-A-4.965.188 (señalado arriba). La
extracción de ADN de sangre total o de componentes de la misma se
describe, por ejemplo, en el documento
EP-A-0393744 (publicado el 24 de
octubre de 1990), Bell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78(9), pp. 5759-5763 (1981), Saiki y col.,
Bio/Technology, 3, pp. 1008-1012
(1985) y el documento US-A-5.231.015
(Cummins y col.). El procedimiento de extracción particular no es
esencial para la práctica de la presente invención.
Puesto que el ácido nucleico diana que hay que
amplificar y detectar se encuentra habitualmente en forma de doble
hebra, hay que separar las dos hebras (es decir, desnaturalizarlas)
antes de que pueda tener lugar el cebado. Esto se puede hacer
durante el procedimiento de extracción, pero con preferencia, se
hace posteriormente en una etapa separada. El calentamiento hasta
una temperatura adecuada (identificada como "primera
temperatura" o T_{1} en la presente invención) es un medio
preferido para la desnaturalización. Por lo general, esta primera
temperatura se encuentra en el intervalo de aproximadamente 85 a
aproximadamente 100ºC durante un tiempo adecuado, por ejemplo desde
1 hasta aproximadamente 240 segundos (preferentemente 1 a
aproximadamente 40 segundos). Esta etapa de desnaturalización
inicial puede incluirse también en el primer ciclo de amplificación.
En tales casos, la desnaturalización puede ser más larga en el
primer ciclo (por ejemplo, hasta 240 segundos) mientras que los
ciclos posteriores pueden tener etapas de desnaturalización mucho
más cortas (por ejemplo, hasta 30 segundos).
A continuación, las hebras desnaturalizadas se
ceban con el juego apropiado de cebadores al enfriar la mezcla de
reacción hasta una segunda temperatura, T_{2}, que se encuentra
generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 55 a
aproximadamente 70ºC. Se desea que el enfriamiento se efectúe tan
rápidamente como sea posible, pero con los equipos que se conocen
actualmente, éste se produce generalmente en un periodo de tiempo de
aproximadamente 5 a aproximadamente 40 segundos, y con mayor
preferencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 segundos.
Preferentemente, T_{2} se define como:
(T_{mH}
- 15)^{o}C \leq T_{2} \leq (T_{mH} +
5)^{o}C
en la que T_{mH} es la
temperatura de fusión de los cebadores para el ácido nucleico diana
de alto número de
copias.
Una vez que las hebras desnaturalizadas se hayan
enfriado, se incuba la mezcla de reacción que contiene los reactivos
para la PCR a una tercera temperatura, T_{3}, por lo general
durante 1 a aproximadamente 120 segundos, y preferentemente durante
1 a aproximadamente 80 segundos, para lograr la formación de
productos de elongación de los cebadores. Por lo general, la tercera
temperatura se define como:
(T_{mH}
- 15)^{o}C \leq T_{3} \leq (T_{mH} +
15)^{o}C
y se encuentra por lo general
dentro del intervalo de aproximadamente 55 a aproximadamente 70ºC.
Con preferencia, se encuentra dentro del intervalo de
aproximadamente 62 a aproximadamente
70ºC.
En una forma de realización muy preferida, la
segunda y la tercera temperatura son idénticas y se encuentran
dentro del intervalo de aproximadamente 62 a aproximadamente 70ºC.
Por lo tanto, el cebado y la elongación de los cebadores se llevan
preferentemente a cabo en la misma etapa.
Cada cebador para el ácido nucleico diana de alto
número de copias tiene también una temperatura de fusión
identificada en la presente invención como T_{mH}. Habitualmente,
la diferencia entre T_{mL} y T_{mH} es de 0 a aproximadamente
8ºC, y tanto T_{2} como T_{3} son por lo general inferiores a
T_{mL} o T_{mH} o iguales a cualquiera de T_{mL} o T_{mH}.
T_{mL} es la temperatura de fusión de los cebadores para el ácido
nucleico diana de bajo número de copias.
Temperatura de fusión se define en la presente
invención como la temperatura a la cual una mitad de un cebador se
encuentra desnaturalizada de una hebra complementaria (tal como la
plantilla). La determinación de las temperaturas de fusión puede
realizarse mediante el uso de varios procedimientos ordinarios,
basados en el efecto hipocrómico en ultravioleta, por ejemplo,
mediante el seguimiento del espectro a 260 nm como se describe en
Biochemistry-The Molecular Basis of Cell
Structure and Function, 2ª edición, Lehninger, Worth Publishers,
Inc., 1970, pp. 876-7. Los diversos procedimientos
de determinación de las temperaturas de fusión pueden producir
valores que difieren ligeramente para la misma molécula de ADN, pero
esos valores no deberían variar de más de aproximadamente 2 ó 3ºC.
Además, la diferencia entre T_{mL} y T_{mH} no debería variar
dentro de un procedimiento determinado para la determinación de las
temperaturas de fusión.
Preferentemente, se calculan las temperaturas de
fusión mediante el uso de la fórmula:
T_{m} (^{o}C)
= 67,5 + 0,34(%G + C) -
395/N
en la que "G" y "C"
representan el número de nucleótidos de guanina y de citosina,
respectivamente, y "N" representa el número total de
nucleótidos en el oligonucleótido (es decir, el cebador). Los
valores de temperatura de fusión obtenidos mediante este cálculo
están en muy buena correlación con los valores que se determinan
empíricamente a temperatura ambiente mediante el uso del efecto
hipocrómico en UV convencional y un espectrofotómetro de red de
diodos convencional de Hewlett-Packard (velocidad de
exploración de aproximadamente +1ºC/min) para una solución de
cebador en tampón tris(hidroximetil) aminometano 10 mmolar
(pH 8,5) que tiene una fuerza iónica de como mínimo 20 mmolar
aproximadamente proporcionada por una o más sales orgánicas o
inorgánicas, tales como el cloruro de magnesio, el cloruro sódico y
otras inmediatamente obvias para aquél experto en la materia. Las
cantidades de cebador y de su complemento en la solución usada para
determinar la fórmula para la temperatura de fusión indicada fueron
suficientes para proporcionar una densidad óptica de aproximadamente
0,5 a aproximadamente 1,0 unidad de
DO.
DO.
Por lo tanto, un ciclo de amplificación
"primario" comprende las etapas de desnaturalización, cebado (o
hibridación) y elongación del cebador descritas arriba. Por lo
general, se llevan a cabo como mínimo 15 de tales ciclos de
amplificación primarios en la práctica de esta invención, dejándose
el número máximo de ciclos al criterio del usuario particular. En la
mayoría de los casos, se usan 15 a 50 ciclos de amplificación
primarios en el procedimiento, prefiriéndose 15 a 40 ciclos. Cada
ciclo de amplificación primario dura por lo general de
aproximadamente 20 a aproximadamente 360 segundos, prefiriéndose una
duración de ciclo de aproximadamente 30 a aproximadamente 120
segundos y prefiriéndose aún más una duración de aproximadamente 30
a aproximadamente 90 segundos. Sin embargo, se pueden usar
duraciones de ciclo más largas o más cortas si se desea.
El procedimiento de esta invención puede
comprender únicamente los ciclos "primarios" indicados, pero en
otra forma de realización, el procedimiento puede comprender como
mínimo 15 ciclos de amplificación primarios tales como se definieron
arriba, seguidos de uno o más ciclos de amplificación
"secundarios". Tales ciclos de amplificación secundarios se
llevan a cabo mediante el uso de las mismas etapas que los ciclos de
amplificación primarios, excepto por la inclusión de una etapa de
renaturalización después de cada etapa de desnaturalización y antes
de la etapa de cebado.
La renaturalización se lleva a cabo mediante el
enfriamiento de la mezcla de reacción hasta una cuarta temperatura,
T_{4}, que se define como:
(T_{mH}
+ 5)^{o}C \leq T_{4} \leq
T_{PH}
en la que T_{PH} es la
temperatura de fusión de las dobles hebras del ácido nucleico diana
de alto número de copias. Por lo general, T_{4} vale de
aproximadamente 65 a aproximadamente 90ºC. El tiempo necesario para
alcanzar T_{4} es tan corto como sea posible, pero puede ser de
hasta aproximadamente 45 segundos, y se puede mantener esta
temperatura durante aproximadamente 15 a aproximadamente 100
segundos.
Se usan por lo menos 5 ciclos de amplificación
secundarios en el procedimiento dejándose el límite superior al
criterio del usuario. Con preferencia, una forma de realización del
procedimiento incluye de 5 a 20 ciclos secundarios, prefiriéndose
particularmente 15 ciclos. La duración de cada ciclo secundario es
de aproximadamente 20 a aproximadamente 360 segundos. Una duración
de ciclo preferida es de aproximadamente 30 a aproximadamente 120
segundos.
La inclusión de una etapa de renaturalización del
producto en los ciclos posteriores a una temperatura de o por debajo
de la T_{m} (temperatura de fusión) eficaz del producto de alto
número de copias pero varios grados por encima de la T_{m} eficaz
de los cebadores que se usan en la reacción de amplificación permite
la renaturalización de los productos de amplificación de una manera
que depende de la concentración. La etapa de renaturalización
relativamente corta de los ciclos secundarios no influye
sustancialmente en la eficiencia del cebado del ácido nucleico diana
de bajo número de copias, pero disminuirá el cebado del ácido
nucleico diana de alto número de copias.
Tal y como se usa en esta solicitud, cuando se
usa con referencia a la duración de una etapa determinada, el
término "aproximadamente" se refiere a \pm10% de este límite
de duración. Cuando se usa con referencia a temperaturas, el término
"aproximadamente" se refiere a \pm5ºC.
La cinética de las reacciones de hibridación de
ácidos nucleicos, tales como la renaturalización de los productos de
amplificación, están relacionados linealmente con la concentración
de los ácidos nucleicos que se estén hibridando. Por lo tanto, si la
concentración en productos amplificados aumenta, por ejemplo, 10
veces, la velocidad de hibridación aumenta también 10 veces (y la
t_{1/2} para la renaturalización disminuye 10 veces). En el
supuesto de una constante de velocidad hacia delante para la
hibridación de 5 \times 10^{6} molar^{-1} s^{-1}, la
t_{1/2} sería de aproximadamente 14 segundos para una
concentración en producto de 10^{-8} molar, y de 140 segundos para
una concentración en producto de 10^{-9} molar. La inclusión de un
agente de exclusión de volumen como se describe en la presente
invención lleva a un aumento efectivo de las macromoléculas
reaccionantes, tales como los cebadores de amplificación, los ácidos
nucleicos diana, los productos de elongación de los cebadores y la
ADN polimerasa. Este aumento resultante de la concentración efectiva
de cebador permite una reducción correspondiente de la concentración
absoluta de cebador en la reacción de amplificación sin perdida de
eficacia de la amplificación. Por eso, en la práctica preferida de
esta invención, se puede reducir considerablemente la concentración
de cebador sin perdida de eficacia.
El procedimiento de amplificación de esta
invención se lleva a cabo preferentemente de manera continua,
automatizada para que la mezcla de reacción pase por oscilaciones
térmicas de manera controlada por un número de veces deseado. Se han
desarrollado varios instrumentos para este fin, como lo sabrá aquél
con experiencia normal en la materia. Preferentemente, el
instrumento que se use será también programable para ciclos de
amplificación tanto primarios como secundarios.
Un instrumento semejante para este propósito se
describe con cierto detalle en los documentos
US-A-4.965.188 y
EP-A-0.236.069. Por lo general, este
instrumento incluye un recipiente conductor de calor para contener
varios tubos de reacción que contienen mezcla de reacción, un medio
para el calentamiento, enfriamiento y mantenimiento de la
temperatura, y un medio informático para generar señales para
controlar la secuencia de amplificación, los cambios de temperatura
y el cronometraje.
El documento
EP-A-0402994 proporciona detalles de
conjuntos de pruebas químicas de utilidad que se pueden procesar
mediante el uso del instrumento descrito en el documento
US-A-5.089.233 (Devaney, Jr. y
col.). También se describe en el mismo un medio para calentar y
enfriar el conjunto de pruebas a intervalos repetidos (es decir, a
través de ciclos) apropiados para el procedimiento de la presente
invención. Se pueden conseguir detalles adicionales con respecto a
equipos de procesamiento de PCR de utilidad a partir de la
considerable bibliografía en el campo, y éstos serán fácilmente
conocidos por aquél experto en la materia.
Aparte de los conjuntos de pruebas químicas
descritos arriba, se puede llevar a cabo el procedimiento en otros
recipientes como aquellos descritos con más detalle en los
documentos US-A-4.902.624 (Columbus
y col.), US-A-5.173.260 (Zander y
col.) y US-A-5.229.297 (Schnipelsky
y col.) y cualquier otro recipiente adecuado que es directamente
evidente para el experto en la materia. Tales conjuntos de pruebas
también se conocen como dispositivos de prueba independientes que
poseen compartimientos separados para diversos reactivos que se usan
en el procedimiento de esta invención. Los compartimientos se
encuentran apropiadamente conectados en el dispositivo para que se
puedan llevar los reactivos y las soluciones de ensayo en contacto
con el reactivo de captura en los momentos adecuados sin abrir el
dispositivo.
La detección de los productos amplificados se
puede llevar a cabo mediante el uso de cualquier procedimiento
conocido, incluidas las técnicas de hibridación de tipo Southern,
como se describe en el documento
US-A-4.965.188 (señalado arriba), o
mediante el uso de sondas o cebadores marcados, como se sabe en la
técnica.
Como alternativa a las formas de realización
descritas arriba, se pueden detectar los productos amplificados
mediante el uso de un oligonucleótido marcado que sea complementario
de uno de los productos de elongación de los cebadores. Los
procedimientos para unir marcadores a los oligonucleótidos son bien
conocidos. Los marcadores de utilidad incluyen enzimas, la ferritina
y otras partículas magnéticas, los radioisótopos, los reactivos
quimioluminiscentes (por ejemplo, el luminol), la biotina y diversos
fluorógenos y cromógenos. Los marcadores enzimáticos de utilidad
incluyen la glucosa oxidasa, la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.
También se conocen substratos y reactivos que proporcionan
coloración para diversos marcadores, tales como las enzimas.
En una forma de realización preferida, se usa un
marcador enzimático (como la peroxidasa) para la detección, y se usa
una composición adecuada para proporcionar una coloración o la
emisión de luz con ese marcador. Por ejemplo, se describen sistemas
que proporcionan coloraciones colorimétricas particularmente útiles
en el documento US-A-5.024.935
(McClune y col.). A continuación se procede a la detección bien sea
visualmente sin ayuda alguna, ó con espectrofotómetros o
luminómetros adecuados.
También es posible que uno de los cebadores de
cada juego de cebadores que se usan en el procedimiento esté marcado
con un radical de unión específica. Este radical puede ser idéntico
o distinto para diversos cebadores, e incluye cualquier molécula
para la cual existe un receptor de unión específica que reacciona
específicamente con ese radical. Los ejemplos de parejas de unión
especificas (una de las cuales puede ser el marcador) incluyen, pero
no se restringen a, estreptavidina/biotina, azúcar/lectina,
anticuerpo/hapteno, anticuerpo/antígeno y otras que el experto en la
materia advierte de inmediato.. La molécula receptora se conjuga a
continuación con un radical marcador detectable adecuado, tal como
una enzima, un radioisótopo u otros descritos arriba para los
oligonucleótidos.
Con mayor preferencia, uno o ambos cebadores de
cada juego de cebadores se marcan con la biotina (o un derivado
equivalente de la misma), y se detecta el producto amplificado
mediante el uso de un conjugado de estreptavidina y una enzima, como
la peroxidasa de rábano.
En los sistemas de detección heterogéneos de esta
invención, los productos amplificados se capturan en un sustrato
insoluble en el agua de algún tipo, y los demás materiales en la
mezcla de reacción se eliminan de manera adecuada, tal como la
filtración, la centrifugación, el lavado u otra técnica de
separación.
Se pueden unir sondas de captura a soportes
insolubles en el agua mediante el uso de técnicas de unión conocidas
(incluidas la absorción y reacciones covalentes). Una técnica
semejante se describe en el documento
EP-A-0439222 (publicado el 18 de
septiembre de 1991). Otras técnicas se describen, por ejemplo, en
los documentos US-A-4.713.326
(Dattagupta y col.), US-A-4.914.210
(Levenson y col.) y EP-B-0070687
(publicado el 26 de enero de 1983). Los medios de separación de
utilidad incluyen la filtración a través de membranas tales como las
membranas microporosas de poliamida que se pueden conseguir en el
mercado de Pall Corporation.
Sin embargo, se puede usar cualquier soporte
sólido de utilidad para anclar la sonda de captura y el producto de
hibridación final, incluidos placas de microvaloración, tubos de
ensayo, vasos, partículas magnéticas o poliméricas, metales,
cerámicas, y fibra de vidrio, para nombrar algunos. Son materiales
particularmente útiles las partículas magnéticas o poliméricas que
llevan grupos reactivos de utilidad para unir de manera covalente la
sonda de captura. Tales partículas tienen por lo general de
aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 \mumetros. Se
proporcionan detalles suplementarios acerca de ejemplos de tales
materiales en los documentos
US-A-4.997.772 (Sutton y col.),
US-A-5.147.777 (Sutton y col.),
US-A-5.155.166 (Danielson y col.) y
US-A-4.795.698 (Owen y col.).
La sonda de captura se puede pegar a un soporte
llano, como una película polimérica, membranas, papeles de filtro, o
papel revestido con resina o sin revestir. Las sondas de captura
pegadas a partículas poliméricas pueden también inmovilizarse encima
de soportes llanos semejantes de manera adecuada, por ejemplo, como
depósitos desecados, o adherirse por fusión térmica o con adhesivos.
Se puede pegar la sonda de captura, por ejemplo, a un soporte llano
en el dispositivo de pruebas independiente de esta invención. Se
proporcionan otros detalles de tales materiales en los documentos
EP-A-0408738 (publicado el 23 de
enero de 1991), WO 92/16659 (publicado el 1 de octubre de 1992) y
US-A-5.173.260 (Sutton y col.).
Se pueden disponer las sondas de captura en un
soporte adecuado según cualquier configuración, por ejemplo, filas
de depósitos redondos o franjas.
También se puede utilizar la presente invención
en lo que se conoce como procedimientos de amplificación
"homogéneos" en los que múltiples ácidos nucleicos diana se
detectan simultáneamente sin necesidad de reactivos de captura. Los
detalles de ensayos semejantes se conocen en la técnica, tales como
los documentos EP-A-0487218
(publicado el 27 de mayo de 1992) y
EP-A-0512334 (publicado el 11 de
noviembre de 1992).
La composición para reacción de amplificación de
esta invención se puede incluir como un componente envasado
individualmente de un kit de pruebas útil para varios ensayos de
amplificación. El kit puede incluir otros reactivos, soluciones,
herramientas e instrucciones de utilidad en el procedimiento de esta
invención, incluidos reactivos de captura inmovilizados sobre un
sustrato insoluble en el agua, soluciones de lavado, soluciones de
extracción, reactivos de detección y otros materiales inmediatamente
obvios para aquél experto en la materia.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar
la práctica de esta invención, y no se pretende que sean
restrictivos de manera alguna. Todos los porcentajes son en peso a
menos que se indique lo contrario.
Los cebadores que se usaron en los ejemplos
tenían las siguientes secuencias. Los dos primeros son
complementarios de la región gag del ADN del HIV1 provírico,
y los dos segundos cebadores son complementarios del ADN de la
\beta-globina humana.
En los cebadores, X representa un radical
biotinil (derivado de un reactivo fosforamidita de biotina, DuPont)
atado al oligonucleótido a través de dos grupos espaciadores de
amino-tetraetilenglicol mediante el uso de la
tecnología descrita en el documento
US-A-4.962.029 (Levenson y
col.).
Las sondas de captura que se usaron en los
ejemplos tenían las secuencias siguientes, siendo la primera para el
ADN del HIV-1 provírico y la segunda para el ADN de
la \beta-globina humana:
"Y" representa dos espaciadores de
tetraetilenglicol conectados con un único grupo conector aminodiol
mediante el uso de las enseñanzas del documento
US-A-4.914.210 (Levenson y
col.).
Los cebadores y las sondas de captura se
prepararon mediante el uso de materiales de partida y procedimientos
conocidos mediante el uso de un sintetizador de ADN de tres
columnas, modelo 380B de Applied Biosystems, química clásica de la
fosforamidita y el protocolo de ciclo rápido, a escala 1 \mumolar
de ABI. Se consiguieron las
nucleósido-3'-fosforamiditas y los
soportes de vidrio de poros controlados con nucleósidos
derivatizados de Applied Biosystems. Todas las purificaciones se
llevaron a cabo mediante el uso de una columna para purificación de
ácidos nucleicos, seguida de técnicas de HPLC en fase inversa.
Para producir reactivos de captura, se unieron
las sondas de forma covalente con partículas poliméricas (de 1
\mum de diámetro medio) que se prepararon mediante el uso de
técnicas de polimerización en emulsión convencionales, a partir de
poli[estireno-co-ácido-3-(p-vinilbenciltio)propiónico]
(proporción ponderal 95:5, diámetro medio 1 \mum). Se lavó una
suspensión de las partículas en agua con tampón ácido
2-(N-morfolino etanolsulfónico (0,1 molar, pH 6), y
se puso en suspensión hasta aproximadamente 10% en sólidos. Se
mezcló una muestra (3,3 ml) de las partículas lavadas, diluidas
hasta 3,33% en sólidos en el tampón (0,1 molar), con clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(2,1 ml de 84 mg/ml agua) y la sonda (983 \mul de DO 44,44/ml de
agua nanopura). La suspensión que se obtuvo se calentó hasta 50ºC en
un baño de agua durante aproximadamente dos horas con mezcla
intermitente y se centrifugó. A continuación, las partículas se
lavaron tres veces con tampón
tris(hidroximetil)aminometano (0,01 molar, pH 8) que
contenía sal disódica del ácido (etilendinitrilo)tetraacético
(0,0001 molar) y se volvieron a poner en suspensión en el mismo
hasta 4% en sólidos.
Tras diluirlos con tampón hasta 0,25% en sólidos,
se aplicaron los reactivos de captura (1,2 \mul) a, y se secaron
en, regiones definidas de las membranas microporosas (membrana de
poliamida LOPRODYNE™, tamaño de poro medio 5 \mum, de Pall Corp.)
en los pocillos para pruebas de dispositivos de pruebas desechables
SURECELL™ (que se pueden conseguir de Eastman Kodak Company), que se
describen en detalle en el documento
US-A-4.948.561 (Hinckley y
col.).
Se llevó a cabo la PCR mediante el uso de un
procesador de PCR automatizado Kodak que se describe en detalle en
el documento US-A-5.089.233, que se
incorpora en la presente invención a modo de referencia, mediante el
uso del protocolo de calentamiento y enfriamiento que se describe en
los ejemplos abajo.
Se obtuvo la ADN polimerasa recombinante de
Thermus aquaticus mediante el uso de procedimientos
convencionales.
El glicerol, el tampón
tris(hidroximetil)aminometano y los dNTP se
consiguieron de Sigma Chemical.
Se extrajo ADN diana del HIV1 provírico de bajo
número de copias de la línea celular 8E5/LAV mediante el uso de
procedimientos convencionales. Después de la lisis de las células y
la digestión de las proteínas, se purificó el ADN por extracción al
fenol/cloroformo: se añadió fenol saturado con tris (750 \mul) a
la suspensión de células, y las soluciones de fenol/productos de
lisis se mezclaron y se separaron por centrifugación. La fase acuosa
se transfirió a continuación dentro de un nuevo tubo de 2 ml. Este
procedimiento se repitió mediante el uso de cloroformo alcohol
isoamílico. La capa acuosa se llevó hasta 0,3 molar en acetato de
sodio. Se precipitaron los ácidos nucleicos por adición de etanol
frío al 95% y almacenamiento a -70ºC durante 1 hora. A continuación,
se determinó la concentración en ADN del HIV1 provírico a A_{260}
y se hicieron diluciones seriadas de número de copias variable en
tampón TE [tris(hidroximetil)aminometano (1 mmolar) y
ácido (etilendinitrilo)tetraacético (0,1 mmolar)] para su uso
experimental.
El ADN de la \beta-globina
humana de alto número de copias se obtuvo del ADN de placenta humano
(0,5 mg/ml) del que se supone que posee dos copias del gen de la
\beta-globina humana por célula.
La dispersión del colorante leuco contenía
agarosa (0,5%), colorante leuco
4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)imidazol
(250 \mumolar), ácido dietilentriaminopentaacético (100
\mumolar), 4'-hidroxiacetanilida (5 mmolar),
polivinilpirrolidona (112 mmolar) y fosfato sódico, monobásico,
1-hidrato (10 mmolar).
La solución de conjugado que se usó en los
ejemplos contenía un conjugado (126 \mul/l) de estreptavidina y
peroxidasa de rábano obtenidos de fuentes comerciales (Zymed
Laboratories, Inc.), caseína (0,5%) y mertiolato (0,5%) en solución
salina con tampón fosfato (fosfato sódico 24 mmolar y cloruro sódico
75 mmolar). La concentración final del conjugado fue de 312
ng/ml.
La solución de lavado que se usó en los ejemplos
contenía cloruro sódico (373 mmolar), sal disódica de ácido
(etilendinitrilo)tetraacético (2,5 mmolar), decilsulfato
sódico (38 mmolar) y ácido etilmercuriotiosalicílico, sal sódica (25
\mumolar) en tampón fosfato sódico, monobásico
1-hidrato (25 mmolar, pH 7,4).
Se usó el anticuerpo monoclonal "TP4" en la
mezcla de reacción. Este anticuerpo es específico para la ADN
polimerasa de Thermus aquaticus y se describe con más detalle
en el documento US-A-5.338.671
(señalado arriba).
Para los ejemplos 1-4, la mezcla
para la reacción en cadena de la polimerasa (200 \mul) contenía
tampón tris(hidroximetil)aminometano (10 mmolar, pH
8), cloruro potásico (50 mmolar), cloruro de magnesio (10 mmolar),
dATP, dCTP, dGTP y dTTP (1,5 molar de cada), cebadores (bien sea 0,1
ó 0,4 \mumolar de cada), gelatina (0,01%), la ADN polimerasa
señalada (8 unidades/200 \mul), el anticuerpo monoclonal
"TP4" (proporción molar 50:1 con respecto a la ADN polimerasa),
y las cantidades indicadas de PEG-8000 como agente
de exclusión de volumen.
Para el ejemplo 5, dado a continuación, la mezcla
para reacción de PCR era idéntica a excepción de que se usaron
únicamente los cebadores que tienen la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº:
2, que la cantidad de cada cebador fue de 0,2 molar, y que la
cantidad de ADN polimerasa fue de 32 unidades/200 \mul.
El PEG-8000, un
poli(etilen glicol) se consiguió de Sigma Chemical. Tiene un
peso molecular de aproximadamente 8000 dalton.
El sulfato de dextrano se consiguió de 5
Prime>3 Prime, Inc.
El resto de los reactivos y materiales se
obtuvieron mediante el uso de fuentes comerciales o se prepararon en
Eastman Kodak Company mediante el uso de procedimientos
convencionales.
Estos ejemplos son una demostración de la
práctica de esta invención mediante el uso de varios protocolos de
amplificación distintos para amplificar y detectar un ácido nucleico
diana de bajo número de copias, el ADN del HIV1 provírico, en
presencia de un ácido nucleico diana de alto número de copias, el
ADN de la \beta-globina humana, en condiciones muy
rigurosas.
La mezcla de reacción para PCR (200 \mul) que
se describió arriba contenía 10 copias de ADN del HIV1 provírico, y
aproximadamente 1 millón de copias de ADN de la
\beta-globina humana, y cebadores (bien sea 0,1 ó
0,4 \mumolar de cada uno de los cuatro cebadores). Las mezclas de
reacción control no contenían agentes de exclusión de volumen,
mientras que las mezclas que se usaron en la práctica de esta
invención contenían 10% de PEG-8000. Los ensayos
control A-D siguieron los protocolos de PCR de los
ejemplos 1-4, respectivamente.
En el ejemplo 1, el protocolo de PCR incluía 40
ciclos de amplificación, cada ciclo de:
1) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para
la desnaturalización (195 segundos para el primer ciclo únicamente),
y
2) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 30 segundos.
El protocolo del ejemplo 2 era similar al del
ejemplo 1 excepto que el cebado y la elongación en cada ciclo se
llevaron a cabo durante 60 segundos.
En el ejemplo 3, el protocolo de PCR incluía:
I) 20 ciclos de amplificación primarios, cada
ciclo de:
A) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para
la desnaturalización (195 segundos para el primer ciclo únicamente),
y
B) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 30 segundos, y
II) 20 ciclos de amplificación secundarios, cada
ciclo de:
A) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos,
y
B) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 60 segundos.
En el ejemplo 4, el protocolo de PCR incluía:
I) 20 ciclos de amplificación primarios, cada
ciclo de:
A) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para
la desnaturalización (195 segundos para el primer ciclo únicamente),
y
B) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 30 segundos, y
II) 20 ciclos de amplificación secundarios, cada
ciclo de:
A) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos,
B) renaturalización a 75ºC durante 30 segundos,
y
C) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 30 segundos.
La detección de los productos de amplificación se
llevó a cabo de la manera siguiente: se mezcló una parte (5 ml) de
la mezcla de reacción de amplificación final con una solución tampón
[tris(hidroximetil)aminometano (10 mmolar, pH 8),
cloruro potásico (50 mmolar), cloruro de magnesio (10 mmolar) y
gelatina (0,01%)] (95 ml) y se incubó a 95ºC durante 5 minutos para
desnaturalizar los ácidos nucleicos. La solución obtenida se
transfirió a continuación a dispositivos de pruebas SURECELL™
(descritos arriba) para que los ácidos nucleicos diana amplificados
pudieran hibridarse con las sondas de captura a 50ºC.
Los pocillos de prueba de los dispositivos de
pruebas se lavaron a continuación a 55ºC con la solución de lavado
señalada (250 \mul). Se añadió entonces la solución (50 \mul) de
conjugado de estreptavidina-peroxidasa señalada
arriba a cada pocillo de prueba y se dejó fluir a través de la
membrana a temperatura ambiente. Al cabo de dos minutos, los
pocillos de prueba se lavaron una segunda vez.
Se añadió la dispersión de colorante leuco (100
\mul) señalada arriba a cada pocillo de prueba, y se incubaron los
dispositivos a temperatura ambiente durante dos minutos. Se añadió
una solución (100 \mul) de azida de sodio (0,1%) para detener el
desarrollo de la coloración. Las señales de coloración obtenidas que
se observaron en los ensayos se calificaron visualmente en una
escala de densidad de color desde 0 a 10 (densidad más elevada).
Los resultados de los ensayos para diversos
niveles de cebadores, en presencia y en ausencia de
PEG-8000, se muestran abajo en la tabla I. Queda
claro que, en presencia de cantidades reducidas de ADN polimerasa,
la presencia del agente de exclusión de volumen aumentó la eficacia
de la amplificación. Este resultado es particularmente evidente
cuando se usó 0,1 \mumolar de cada cebador en los ejemplos 2 y 3,
aunque se observó un aumento de la señal con cada protocolo de
PCR.
| Ensayo | Nivel de cebadores (\mumolar) | Señal de colorante |
| Ejemplo 1 | 0,4 | 0,50 |
| Ejemplo 1 | 0,1 | 4,25 |
| Control A | 0,4 | 0,50 |
| Control A | 0,1 | 1,25 |
| Ejemplo 2 | 0,4 | 4,25 |
| Ejemplo 2 | 0,1 | 7,50 |
| Control B | 0,4 | 1,50 |
| Control B | 0,1 | 6,25 |
| Ejemplo 3 | 0,4 | 4,50 |
| Ejemplo 3 | 0,1 | 8,00 |
| Control C | 0,4 | 5,00 |
| Control C | 0,1 | 3,75 |
| Ejemplo 4 | 0,4 | 4,50 |
| Ejemplo 4 | 0,1 | 6,50 |
| Control D | 0,4 | 2,50 |
| Control D | 0,1 | 0 |
Este ejemplo compara el uso de
PEG-8000 con el de sulfato de dextrano como agentes
de exclusión de volumen en una PCR para amplificar y detectar un
ácido nucleico diana de bajo número de copias, el ADN del HIV1
provírico. Aunque no se llevara a cabo coamplificación, este
experimento demuestra que no se puede usar el sulfato de dextrano
como agente de exclusión de volumen en PCR. La utilidad del PEG en
la coamplificación se ha demostrado en los ejemplos
1-4.
La mezcla de reacción para PCR (200 \mul) que
se describió arriba contenía 12 copias de ADN del HIV1 provírico, y
aproximadamente 1 millón de copias de ADN de placenta humana (como
fondo), y cebadores (0,2 \mumolar de cada uno). Las mezclas de
reacción control no contenían PEG-8000 ni sulfato de
dextrano, mientras que las otras mezclas contenía 1 a 10% de
PEG-8000 o de sulfato de dextrano.
El protocolo de PCR incluía 40 ciclos de
amplificación primario, cada ciclo de:
1) calentamiento a 95ºC durante 15 segundos para
la desnaturalización (195 segundos para el primer ciclo únicamente),
y
2) cebado (hibridación) y elongación a 64ºC
durante 30 segundos.
La detección de los productos de amplificación se
llevó a cabo de la manera siguiente: se mezcló una parte (5 ml) de
la mezcla de reacción de amplificación final con una solución tampón
[tris(hidroximetil)aminometano (10 mmolar, pH 8),
cloruro potásico (50 mmolar), cloruro de magnesio (10 mmolar) y
gelatina (0,01%)] (95 ml) y se incubó a 95ºC durante 5 minutos para
desnaturalizar los ácidos nucleicos. La solución obtenida se
transfirió a continuación a dispositivos de pruebas SURECELL™
(descritos arriba) para que los ácidos nucleicos diana amplificados
pudieran hibridarse con las sondas de captura a 50ºC.
Los pocillos de prueba de los dispositivos de
pruebas se lavaron a continuación a 55ºC con la solución de lavado
señalada (250 \mul). Se añadió entonces la solución (50 \mul) de
conjugado de estreptavidina-peroxidasa señalada
arriba a cada pocillo de prueba y se dejó fluir a través de la
membrana a temperatura ambiente. Al cabo de dos minutos, los
pocillos de prueba se lavaron una segunda vez.
Se añadió la dispersión de colorante leuco (100
\mul) señalada arriba a cada pocillo de prueba, y se incubaron los
dispositivos a temperatura ambiente durante dos minutos. Se añadió
una solución (100 \mul) de azida de sodio (0,1%) para detener el
desarrollo de la coloración. Las señales de coloración obtenidas que
se observaron en los ensayos se calificaron visualmente en una
escala de densidad de color desde 0 a 10 (densidad más elevada).
Los resultados de los ensayos, en presencia y en
ausencia de PEG-8000 o de sulfato de dextrano, se
muestran abajo en la tabla II. Queda claro que, la presencia
PEG-8000 aumentó la eficacia de la amplificación,
mientras que la presencia de sulfato de dextrano impide
completamente la PCR.
| Agente de exclusión de volumen | Señal del colorante |
| Ninguno | 4,5 |
| 1% PEG-8000 | 6 |
| 2% PEG-8000 | 7,5 |
| 4% PEG-8000 | 8,5 |
| 6% PEG-8000 | 9 |
| 8% PEG-8000 | 8,5 |
| 10% PEG-8000 | 8,5 |
| Ninguno | 6,5 |
| 1% sulfato de dextrano | 0 |
| 2% sulfato de dextrano | 0 |
TABLA II
(continuación)
| Agente de exclusión de volumen | Señal del colorante |
| 4% sulfato de dextrano | 0 |
| 6% sulfato de dextrano | 0 |
| 8% sulfato de dextrano | 0 |
| 10% sulfato de dextrano | 0 |
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: JOHNSON & JOHNSON CLINICAL DIAGNOSTICS, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 100 INDIGO CREEK DRIVE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROCHESTER
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 14650-0880
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COAMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DIANA USANDO UN AGENTE DE EXCLUSIÓN DE VOLUMEN EN UNA COMPOSICIÓN DE REACCIÓN, KIT DE PRUEBAS Y DISPOSITIVO DE PRUEBAS DE UTILIDAD PARA ELLO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTTCATC CACGTTCACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACAACTGT GTTCACTAGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C
\hfill31
Claims (20)
1. Un procedimiento para la coamplificación de
dos o más ácidos nucleicos diana, procedimiento que comprende como
mínimo 15 ciclos de amplificación primarios, cada ciclo de
amplificación primario constando de las etapas secuenciales de:
A) calentar una mezcla de reacción de dos o más
ácidos nucleicos diana, o sus productos de elongación de los
cebadores, a una primera temperatura, T1, para las desnaturalización
de las hebras de dichos ácidos nucleicos diana o de sus productos de
elongación de los cebadores,
B) cebar dichas hebras desnaturalizadas con un
juego de cebadores específicos para, y que se pueden hibridar con,
hebras opuestas de cada ácido nucleico diana que se pretende
amplificar, mediante el enfriamiento hasta una segunda temperatura,
T2, y
C) bien sea como prolongación de la etapa B), o
en una etapa distinta, formar productos de elongación de los
cebadores en una mezcla de reacción de reactivos de PCR, por
incubación a una tercera temperatura, T3, siempre que, cuando el
cebado y la formación de productos de elongación de los cebadores se
llevan a cabo en la misma etapa, T2 y T3 sean idénticas, en el que
dicha mezcla de reacción en por lo menos uno de dichos ciclos de
amplificación primarios comprende por lo menos 4% en peso
aproximadamente de un agente de exclusión de volumen polimérico, no
iónico, y en el que por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido
nucleico diana de bajo número de copias, y por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de alto número de
copias.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho agente de exclusión de volumen se escoge entre el grupo
formado por un poliéter, un producto de reacción de un azúcar con la
epiclorohidrina, un polisacárido, y un poliacrilato.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que dicho agente de exclusión de volumen es un poliéter que tiene la
fórmula:
H-(O-R-)_{n}-H
en la que R es alquileno de 1 a 6
átomos de carbono y n es un número entero de 15 a
1000.
4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el
que dicho agente de exclusión de volumen es el polietilenglicol o el
polipropilenglicol.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho agente de exclusión de volumen tiene un peso molecular
medio de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 dalton.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho agente de exclusión de volumen se encuentra presente en
dicha mezcla de reacción en una cantidad de aproximadamente 4 a
aproximadamente 12% en peso.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana
de bajo número de copias, y por lo menos un ácido nucleico diana es
un ácido nucleico diana de alto número de copias, y del que se
sospecha que se encuentra presente a una concentración de por lo
menos 1000 veces la concentración de dicho ácido nucleico diana de
bajo número de copias.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que cada cebador de cada conjunto de cebadores para los ácidos
nucleicos diana que se pretende amplificar se encuentra presente a
la misma concentración que es de por lo menos aproximadamente 0,025
\mumolar, e inferior a aproximadamente 1 \mumolar.
9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el
que cada cebador de cada conjunto de cebadores se encuentra presente
a una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2
\mumolar.
10. El procedimiento de la reivindicación 7, que
comprende además como mínimo 5 ciclos de amplificación secundarios,
cada ciclo secundario comprendiendo la repetición de las etapas A) a
C) secuencialmente, y además,
entre las etapas A) y B) de cada ciclo de
amplificación secundario, el enfriamiento de la mezcla de reacción y
su mantenimiento a una cuarta temperatura, T4, que se define
como:
(T_{mH}
+ 5)^{o}C \leq T4 \leq
T_{PH}
en la que T_{mH} es la
temperatura de fusión de los cebadores para dicho ácido nucleico
diana de alto número de copias, y T_{PH} es la temperatura de
fusión de la doble hebra de dicho ácido nucleico diana de alto
número de copias, durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente
120
segundos.
11. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que las etapas B) y C) son las mismas para todos los ciclos y T2 y
T3 son la misma temperatura que es de aproximadamente 62 a
aproximadamente 70ºC.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que uno de los dos o ambos cebadores específicos para por lo
menos un ácido nucleico diana se encuentra biotinilado, y la
detección de dicho ácido nucleico diana amplificado se lleva a cabo
por captura de la hebra biotinilada amplificada obtenida mediante el
uso de un oligonucleótido insolubilizado complementario con respecto
a la misma, y detección de dicha hebra biotinilada capturada con un
conjugado de estreptavidina marcado de forma detectable.
13. El procedimiento de la reivindicación 12 en
el que dicho oligonucleótido se encuentra inmovilizado en una
partícula magnética o polimérica.
14. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que cada ciclo de amplificación primario se lleva a cabo de
aproximadamente 30 a aproximadamente 120 segundos.
15. Un procedimiento para la coamplificación de
dos o más ácidos nucleicos diana y la detección de uno o más de
dichos ácidos nucleicos diana, dicho procedimiento comprendiendo
como mínimo 15 ciclos de amplificación primarios, cada ciclo de
amplificación primario constando de las etapas secuenciales de:
A) calentar una mezcla de reacción de dos o más
ácidos nucleicos diana, o sus productos de elongación de los
cebadores, a una primera temperatura, T1, para las desnaturalización
de las hebras de dichos ácidos nucleicos diana o de sus productos de
elongación de los cebadores,
B) cebar dichas hebras desnaturalizadas con un
juego de cebadores específicos para, y que se pueden hibridar con,
hebras opuestas de cada ácido nucleico diana que se pretende
amplificar, mediante el enfriamiento hasta una segunda temperatura,
T2,
C) bien sea como prolongación de la etapa B), o
en una etapa distinta, formar productos de elongación de los
cebadores en una mezcla de reacción de reactivos de PCR, por
incubación a una tercera temperatura, T3, siempre que, cuando el
cebado y la formación de productos de elongación de los cebadores se
llevan a cabo en la misma etapa, T2 y T3 sean idénticas,
en el que dicha mezcla de reacción en por lo
menos uno de dichos ciclos de amplificación primarios comprende por
lo menos 4% en peso aproximadamente de un agente de exclusión de
volumen polimérico, no iónico, y en el que por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
y por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de
alto número de copias, y
D) después del último ciclo de amplificación
primario, detectar uno o más de dichos productos de extensión de los
cebadores como indicación de uno o más de dichos ácidos nucleicos
diana.
16. Un procedimiento para la coamplificación de
dos o más ácidos nucleicos diana, en el que por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
y por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de
alto número de copias, y en el que el procedimiento usa una
composición de reacción de amplificación que se encuentra
amortiguada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 y que
comprende:
uno o más conjuntos de cebadores,
una ADN polimerasa termoestable,
una pluralidad de dNTP, y
por lo menos aproximadamente 4% en peso de un
agente de exclusión de volumen polimérico, no iónico.
17. El procedimiento de la reivindicación 16 en
el que:
cada cebador de cada conjunto de cebadores se
encuentra presente a la misma concentración que es inferior a
aproximadamente 1 \mumolar, y
dicho agente de exclusión de volumen se escoge a
partir del grupo formado por un poliéter, un producto de reacción de
un azúcar con la epiclorohidrina, un polisacárido, y un
poliacrilato, tiene un peso molecular medio de aproximadamente 1000
a aproximadamente 20.000 dalton, y se encuentra en dicha mezcla de
reacción en una cantidad de aproximadamente 4 a aproximadamente 12%
en peso.
18. Un procedimiento para la coamplificación de
dos o más ácidos nucleicos diana, en el que por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
y por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de
alto número de copias, y en el que el procedimiento usa un kit de
pruebas que comprende, envasados por separado:
a) una composición de reacción de amplificación
amortiguada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 y que
comprende:
uno o más conjuntos de cebadores,
una ADN polimerasa termoestable,
una pluralidad de dNTP, y
por lo menos aproximadamente 4% en peso de un
agente de exclusión de volumen polimérico, no iónico, y
b) un reactivo de captura que consta de un
oligonucleótido inmovilizado en un sustrato insoluble en el
agua.
19. El procedimiento de la reivindicación 18 en
el que:
cada cebador de cada conjunto de cebadores se
encuentra presente a la misma concentración que es inferior a
aproximadamente 1 \mumolar,
dicho agente de exclusión de volumen se escoge a
partir del grupo formado por un poliéter, un producto de reacción de
un azúcar con la epiclorohidrina, un polisacárido, y un
poliacrilato, tiene un peso molecular medio de aproximadamente 1000
a aproximadamente 20,000 dalton, y se encuentra en dicha mezcla de
reacción en una cantidad de aproximadamente 4 a aproximadamente 12%
en peso, y
dicho agente de captura comprende partículas
magnéticas o poliméricas.
20. Un procedimiento para la coamplificación de
dos o más ácidos nucleicos diana, en el que por lo menos un ácido
nucleico diana es un ácido nucleico diana de bajo número de copias,
y por lo menos un ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana de
alto número de copias, y en el que el procedimiento usa un
dispositivo de pruebas independiente que comprende, en
compartimientos distintos:
a) una composición de reacción de amplificación
amortiguada a un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9 y que
comprende:
uno o más conjuntos de cebadores,
una ADN polimerasa termoestable,
una pluralidad de dNTP, y
por lo menos aproximadamente 4% en peso de un
agente de exclusión de volumen polimérico, no iónico, y
b) un reactivo de captura que consta de un
oligonucleótido inmovilizado en un sustrato insoluble en el
agua,
dichos compartimientos encontrándose conectados
en dicho dispositivo para pruebas de modo que se puede llevar dicha
composición de reacción de amplificación en contacto con dicho
reactivo de captura después de la amplificacion sin abrir dicho
dispositivo para pruebas.
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