CN103119178B - 核酸的检测方法以及装置、试剂盒 - Google Patents

核酸的检测方法以及装置、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供不需要特殊的装置、简单并且高精度地对核酸扩增方法扩增出的多链核酸进行检测的方法以及核酸检测装置。本发明提供利用显色性的无色型染料与多链核酸相接触而产生的显色反应，通过可见光对核酸进行检测的方法，以及使用该方法的核酸检测装置。

Description

核酸的检测方法以及装置、试剂盒
技术领域
本发明属于多链核酸的检测方法、以及多链核酸检测装置或试剂盒技术领域。
技术背景
在分子生物学的研究领域、基因检测等的临床应用领域中，对靶核酸进行特异性扩增的方法成为非常重要的技术。
作为核酸扩增方法，最通用的是PCR法(Polymerase Chain Reaction)，但需要复杂的温度控制；因此，还开发出了LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICAN(lsothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等的等温扩增方法。
通过PCR法、LAMP法、ICAN法等扩增出的核酸是双链的，在检测方法中，使用荧光染料的方法的研究盛行。
最普通的方法是，是对扩增反应后的溶液实施琼脂糖电泳，使之与EthidiumBromide、SYBR Green等荧光性嵌入剂(intercalator)结合，而对特异性的荧光进行观察的方法(非专利文件1)。但是，电泳后利用荧光性嵌入剂进行检测的方法，需要30分钟～1小时左右的泳动时间，而且需要对荧光进行检测的UV照射装置、荧光检测器等昂贵的仪器。
在没有与其他DNA混合的可能性，只是对扩增产物的有无进行判断时，预先在PCR开始前的反应液中添加荧光性嵌入剂，在扩增反应后进行荧光检测，就可以省略电泳(专利文件1)。但是，存在如下问题：荧光性嵌入剂会与引物等单链核酸结合，因此使背景信号增强，而使得检测灵敏度下降。相对于此，有人开发了：使用与单链核酸结合的荧光性嵌入剂优先发生反应的化合物进行处理而降低背景信号的方法(专利文献2)，以及与单链核酸相比，与双链核酸的反应特异性得到提高的荧光染料(专利文献3)；但是，在进行荧光检测这一点上没有变化。
此外，也有人开发了通过采用荧光标记的引物进行核酸扩增反应，并用荧光偏振进行检测的方法(专利文献4)，但通常存在如下问题：荧光引物通常是高价的，或者需要对没能与扩增产物结合的荧光标记引物进行分离操作，因此是较为繁琐的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平5-237000号公报
专利文献2：国际公开第2002/103053号
专利文献3：日本特开2003-240780号公报
专利文献4：日本特开平9-187275号公报
非专利文献
非专利文献1：Molecular Cloning Second Edition，vol.1，6.15(1989)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的问题在于提供不需要复杂的操作和特殊的装置、简单并且迅速地对核酸扩增反应扩增出的多链核酸进行检测的多链核酸的检测方法，以及多链核酸的检测装置或试剂盒。
解决问题的方法
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过使多链核酸与显色性的无色型染料接触，使无色型染料的脱离基解离而显色，利用可视光能够检测出核酸。并且，发现利用这样的原理可以制作多链核酸检测装置或试剂盒，从而完成了本发明。
即，本发明涉及多链核酸的检测方法，其包括：使显色性的无色型染料与多链核酸接触的工序，该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测。
优选无色型染料是通式(I)所表示的化合物，
(化学式1)
(式中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基。L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H。其中，R4表示碱金属或氢原子。X表示卤素原子。R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基)，由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的脱离基解离，因脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。
优选所述通式(I)所表示的化合物是通式(II)所表示的化合物，
(化学式2)
(式中，L与上述相同。R11以及R12分别独立地表示取代或未取代的芳基。R13、R14、R15、R16以及R17分别独立地表示卤素原子、羧基、磺基、硝基、氰基、酰胺基、氨基、烷基、芳基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷氨基、芳氨基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、烷磺酰基或芳磺酰基)。
优选无色型染料为三芳基甲烷类染料与亲核剂的反应产物。
优选三芳基甲烷类染料是选自龙胆紫、结晶紫、甲基绿、孔雀绿、维多利亚蓝、副品红以及它们的衍生物中的1种以上的染料。
优选亲核剂为选自亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂中的1种以上的亲核剂。
此外，本发明还涉及多链核酸检测装置或试剂盒，其含有：(d)保持无色型染料的载体，(e)供被检测物通过载体(d)的通路，以及(f)用可见光检测因被检测物与无色型染料相互作用而呈现的色调，从而对多链核酸的存在进行判定的部位。
优选无色型染料是通式(I)所表示的化合物，
(化学式3)
(式中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基。L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H。其中，R4表示碱金属或氢原子。X表示卤素原子。R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基)，由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的脱离基解离，因脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。
优选载体(d)保持三芳基甲烷类染料和亲核剂的混合液。
优选三芳基甲烷类染料是选自龙胆紫、结晶紫、甲基绿、孔雀绿、维多利亚蓝、副品红以及它们的衍生物中的1种以上的染料。
优选亲核剂为选自亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂中的1种以上的亲核剂。
发明的效果
通过本发明的方法，可以不使用特别的检测仪器，通过多链核酸和无色型染料的接触产生的显色反应，对核酸合成或扩增的有无进行目测检测。此外，本发明所涉及的核酸检测装置，只需将含有多链核酸的被检测物添加在装置上，就可以通过显色反应而迅速目测检测出被检测物。
附图说明
[图1]示出本发明的核酸检测用色谱型装置的一个例子的概略图。
[图2]示出本发明的核酸检测用的过滤器型装置的一个例子的概略图。
[图3]示出本发明的核酸检测用吸引型装置的一个例子的概略图。
[图4]示出本发明的核酸检测用流路型装置的一个例子的概略图。
[图5]示出本发明的核酸检测用管型装置的一个例子的概略图。
符号说明
1.保持有通过与多链核酸接触而显色的无色型染料的载体
2.样品添加部位(玻璃纤维滤纸)
3.判定部位(滤纸)
4.基体材料
5.保持载体的支撑体
6.被检测物收纳容器
7.吸量管尖头
8.具有通路的芯片
9.试剂添加部位
10.通路
11.染料
12.针状结构
13.管
14.判定部位
具体实施方式
以下详细地记载本发明。
1.核酸的检测方法
本发明涉及多链核酸的检测方法，其包括使显色性的无色型染料与多链核酸接触的工序，该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测。
检测对象的多链核酸包括双链核酸、三链核酸、或四链核酸。作为核酸除了DNA或RNA之外，也已知很多它们的化学修饰体，进一步被称为PNA的主链具有多肽链的核酸类似物等也是已知的，这些均包含在多链核酸中。更为优选使用的核酸是双链DNA、双链RNA、DNA和RNA的杂交链、以及PNA等的人工核酸的双链等。但是，即使是就单链核酸，或是多种混合的情况而言，当可以用染料进行染色时，也可以通过上述检测方法进行确认。
显色性的无色型染料是指无色型染料并与显色剂反应时呈现显色状态的物质。无色型染料是指无色或淡色的染料，通过与显色剂的反应以及光等的物理刺激，其结构变化且色调变化的染料。作为显色剂，已知有氧化剂、醇等，在上述检测方法中，多链核酸作为显色剂使用。
在上述的检测方法中，检测原理如下：在多链核酸中添加无色型染料，使多链核酸与无色型染料接触而相互作用，从而产生色调的变化。相互作用是指通过与多链核酸进行可逆结合，从而对无色型染料产生某些物理化学影响。
作为无色型染料，优选通式(I)所示的化合物，
(化学式4)
由于与多链核酸相互作用，无色型染料的脱离基解离，通过脱离基的解离，产生利用可视光能够检测出的色调的化合物。
在所述通式(I)中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基。作为芳基可列举苯基、萘基、蒽基(anthracenyl group)等。这些芳基任选进一步被氨基、羟基、烷氧基、羰基、羧基、磺酸基、烷基等官能基，以及/或者卤素原子这样的其他原子取代。
L表示脱离基，具体来讲，表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H。
R4表示碱金属或氢原子。X表示F、Cl、Br、I等卤素原子。R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基；这些取代基任选进一步被其他的一般性官能基、原子，例如氨基等杂原子官能基(hetero group)、卤素原子等取代。
无色型染料是通过氧化还原等反应而显色的染料，也可以是显色状态的染料与亲核剂的反应产物。例如，通过使亲核剂与三芳基甲烷类处于显色状态的染料反应，转换为无色型染料。此时，即使使用单一的三芳基甲烷类染料，只要改变使用的亲核剂也可得到具有不同结构的无色型染料。
作为染料，只要通过氧化还原等反应显色，通过与多链核酸的相互作用呈现利用可见光能够检测的色调的物质既可，没有特别限制，可以列举三芳基甲烷类染料、呫吨类染料(xanthene)、喹啉类染料、吩噻嗪(dibenzothiazine)类染料、吩嗪类染料以及它们的混合物。在此之中，优选三芳基甲烷类染料。
作为三芳基甲烷类染料，优选通式(II)所示的化合物。
(化学式5)
式中，L与上述相同，R11以及R12分别独立地表示取代或未取代的芳基。
作为取代芳基，是指作为取代基，具有选自卤素原子、羟基、烷氧基、被卤素原子所取代的烷氧基、被芳基所取代的烷氧基、芳氧基、烷基、被卤素原子所取代的烷基、被羟基所取代的烷基、被羧基的酯所取代的烷基、被氰基所取代的烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、氨基、烷氨基、芳氨基、被烷磺酰基所取代的氨基、被酰基所取代的氨基、巯基、烷硫基、被卤素原子所取代的烷硫基、芳硫基、羧基或者其酯或其酰胺、羰基(氧代基)、甲酰基、烷羰基、芳羰基、硫羰基(硫代基)、氰基、硝基、磺酸基、烷磺酰基、被卤素原子所取代的烷磺酰基、以及芳磺酰基中的1个或多个基的芳基。
R13、R14、R15、R16以及R17分别独立地表示卤素原子、羧基、磺基、硝基、氰基、酰胺基、氨基、烷基、芳基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷氨基、芳氨基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、烷磺酰基、芳磺酰基等。
该染料可认为是通过与多链核酸的相互作用，按反应式(III)所表示的机理进行显色，但显色机理不受特别限制。
(化学式6)
作为三芳基甲烷类染料的具体例，可列举甲基绿、孔雀绿、结晶紫、副品红、龙胆紫B、龙胆紫R、夜蓝(night blue)、维多利亚蓝B、维多利亚蓝R等无色型衍生物。在此之中，优选结晶紫、龙胆紫、甲基绿、孔雀绿，更加优选结晶紫、龙胆紫。
除了三芳基甲烷类染料之外，还可以列举喹啉类染料的4-(p-二甲基氨基苯乙烯)喹啉，吩噻嗪类染料的吩噻嗪、苄酰基无色亚甲基蓝，吩嗪类染料的吩嗪等无色型衍生物。但是只要与多链核酸接触而显色即可，不限于这些染料。
作为与显色状态的染料反应而转换为无色型染料的亲核剂，例如可以使用：亚硫酸钠等亚硫酸根离子含有物、亚硫酸氢钠等亚硫酸根氢离子含有物、硝酸钠等硝酸根离子含有物、亚硝酸钠等亚硝酸根离子含有物、氰化钠等氰离子含有物、卤化物离子(ハロゲン化物イオン)、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂等亲核剂，只要可转换为无色型，能通过与多链核酸的相互作用再次转换为显色型即可，没有特别限制。
作为卤化物离子，例如，可以举出：氟化物离子、氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等。
作为氮亲核剂，例如，可以举出：氨、甲胺、正丙胺、二甲胺、苄胺、N-甲基苄基胺、苯胺、正庚胺、1-氨基癸烷、1,3-丙二胺等胺类亲核剂；乙酰胺等酰胺类亲核剂；双乙酰酰亚胺、二甲酰酰亚胺、邻苯二甲酰亚胺、邻苯二甲酰亚胺的金属盐等酰亚胺类亲核剂；苯磺酰基酰胺、对硝基苯磺酰基酰胺、邻硝基苯磺酰基酰胺、间硝基苯磺酰基酰胺、对甲苯磺酰基酰胺等亲核剂等。
作为硫亲核剂，例如，可以举出：硫醇、二硫化物或硫脲。
作为碱金属烷氧化物，例如，可以举出：甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾等。
作为碱金属氢氧化物，例如，可以举出：氢氧化钠、氢氧化钾等。
作为氢化物亲核剂，指能够作为亲核剂供给氢的试剂，例如，可列举三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠、硼氢化锂、硼烷-吡啶络合物、硼烷-四氢呋喃络合物、硼烷-2-甲基吡啶络合物、硼烷-二甲基硫醚络合物、氰基硼氢化钠、三乙基硼氢化锂、氢化铝锂、Red-Al(二氢双(2-甲氧基乙氧基)铝酸钠)、L-Selectride(三仲丁基硼氢化锂)、K-Selectride(三仲丁基硼氢化钾)、DIBAL-H(二异丁基氢化铝)等。
作为亲核剂，具体来讲，优选：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、正丙胺、巯基乙醇、氢氧化钠、氢氧化钾，更优选钠亚硫酸、巯基乙醇、氢氧化钠。
作为染料和亲核剂的组合，优选：结晶紫和亚硫酸钠、龙胆紫和亚硫酸钠、结晶紫和氢氧化钠、甲基绿和2-巯基乙醇、甲基绿和亚硫酸钠、孔雀绿和亚硫酸钠的组合，在此之中，更优选结晶紫和亚硫酸钠、龙胆紫和亚硫酸钠、甲基绿和亚硫酸钠的组合。
在使显色性的无色型染料与多链核酸接触的工序中，只要显色性的无色型染料与多链核酸相接触并两者发生反应即可，无论怎样接触均可。
在可见光下对通过无色型染料和多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测时，不用照射紫外线等非可见光，在如普通的实验室照明的可见光下就可以对色调进行检测。只要是可见光，则不需要照射紫外线等情况时的特殊设备，可简单的进行检测。
作为检测多链核酸的最简单的方法，可通过目测对因无色型染料和多链核酸接触而产生的色调变化进行观察。在这里，目测观察指的是通过目测来观察无色型染料和多链核酸结合了的情况时的色调变化，或者没有与多链核酸相结合的无色型染料的色调变化。基于在可见光下的色调变化，可确认多链核酸是否存在。
色调变化具体而言，可列举在可见光下颜色的种类发生变化(可见光波长)，或颜色的浓淡发生变化(反射率)等，只要能够通过可见光检测即可，没有特别限制。作为颜色种类的变化，例如，可以举出从红紫色到天蓝色的变化，以及从黄色到红紫色的变化。
此外，通过测定样品溶液的可见光区域的吸光度，也可对核酸进行检测。在这里，可见光指特别是380nm～800nm波长的光。测定波长可根据使用的染料进行适当的设定。此外，也可以通过吸光度测定来对样品中的核酸浓度进行定量。此外，由染料和核酸生成不溶性的沉淀物时，可以使用过滤器、膜来进行检测，或也可通过离心分离对沉淀进行检测。此外，为了容易进行核酸有无的判定，也可以与其他色调的染料进行混合。
在上述检测方法中，可检测出被检测物中含有的多链核酸，但被检测物只要含有多链核酸即可，没有特别限制。不只是核酸扩增反应液，也可以是微生物、动物细胞、或植物细胞的提取液，从食品中得到的提取液也可良好适用。
作为核酸扩增方法，只要是以PCR法为代表的使核酸序列扩增的方法即可，没有特别限制。除了PCR法制之外，例如还可以列举LCR(Ligase Chain Reaction)法、SDA(StrandDisplacement Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification)法、CPT(CyclingProbe Technology)法、Q-Beta Replicase Amplification Technology法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)法、NASBA(Nucleic acidSequence-based Amplification method)法以及TMA(Transcription mediatedamplification method)法等公知的方法，但不局限于此。Q-Beta ReplicaseAmplification Technology法、RCA法、NASBA法、SDA法、TMA法、LAMP法、ICAN法等是在一定温度下进行扩增反应的方法，其他的PCR法、LCR法等是利用温度循环进行扩增反应的方法。此外，通过逆转录酶等将RNA逆转录为DNA，以此DNA为模板，使用上述的核酸扩增方法则可间接对RNA进行检测。
对核酸扩增方法的扩增产物的多链核酸进行检测时，优选在核酸扩增反应后的反应液中添加无色型染料，也可以在核酸扩增反应前预先向反应液中添加无色型染料。
此外，无色型染料可以单独添加至含有多链核酸的被检测物中，也可以以与稳定剂的混合物的形式进行添加。
稳定剂指的是防止无色型染料进行显色的化合物，例如，有还原剂、胺、硫醇化合物等，只要可以防止显色即可，并不限制于此。稳定剂可以单独添加，也可以将多种组合添加。
进一步而言，可以将无色型染料直接添加到含有多链核酸的被检测物中，也可以将显色状态的染料用亲核剂等处理转变为无色型染料后进行添加。或者，可添加处于显色状态的染料和亲核剂的混合物。例如，将结晶紫和亚硫酸钠混合而转变为无色型后，可使用该混合液对多链核酸进行目测检测。当无色型染料不稳定而难于分离时，处于显色状态的染料和亲核剂的混合液是特别有效的使用方法。
含有核酸的被检测物中的无色型染料的添加量，只要是能够确认着色即可，没有特别限制，最终浓度通常为10%以下，优选1%以下，更优选0.1%以下。
进行核酸检测后的已着色的被检测物液体，可以直接用于其它分子生物学操作中。这样的分子生物学操作，包括限制酶处理、测序反应、如PCR的酶反应、用电泳进行的确认操作等。
2.核酸检测装置和试剂盒
此外，本发明还涉及多链核酸检测装置或试剂盒，其含有：(d)保持无色型染料的载体，(e)供被检测物通过载体(d)的通路，以及(f)用可见光检测因被检测物与无色型染料相互作用而呈现的色调，从而对多链核酸的存在进行判定的部位。
作为保持无色型染料的载体(d)的材料，只要能够保持染料，能够使包含核酸的被检测物通过即可，没有特别限制。优选的具体例，可以列举：无纺布、滤纸、玻璃纤维滤纸、玻璃纤维布、玻璃过滤器、硝酸纤维素过滤器、聚乙烯或聚丙烯等所构成的多孔材料等。无色型染料在载体(d)上的固定，可以通过物理性吸附或化学性结合等公知的方法进行。作为物理性吸附，例如，可列举将一定量的染料溶液浸渍在载体上后进行干燥的干燥吸附等。
保持在载体(d)中的无色型染料的量，只要是可以通过可见光对色调的变化进行检测即可，没有特别限制，与包含核酸的被检测物混合后的染料的最终浓度优选为10%以下，更优选为1%以下，特别优选为0.1%以下。
被检测物通过保持无色型染料的载体(d)时，当被检测物中含有多链核酸时，通过多链核酸与无色型染料的相互作用，脱离基从无色型染料解离而发生色调的变化。在这里，相互作用是指例如：肽键键合、二硫键键合等共价键合、离子键合、配位键合、范德华键合、π-π相互作用等非共价键合，但不局限于此。
载体(d)中的多链核酸和无色型染料的相互作用，也受到多链核酸与载体的亲和性、载体的吸湿性的影响。因此，为了调整与多链核酸的非特异性吸附、调整吸湿性，可以用亲水性聚合物、表面活性剂覆盖或进行浸渍这些载体表面。
被检测物通过载体(d)的通路(e)，是指上样(apply)到本发明的装置或者试剂盒中的被检测物进行移动的通路。作为通路，只要是能够诱导被检测物移动即可，没有特别限制，可以形成沟，但不是必须的。通路(e)与载体(d)以及判定部位(f)连接，被检测物可沿通路(e)向载体(d)以及判定部位(f)移动。作为通路(e)的材料，只要是能够使包含多链核酸的被检测物通过的材料即可，没有特别限制。
用可见光检测因被检测物与无色型染料相互作用而呈现的色调的变化，对多链核酸的存在进行判定的部位(f)，是通过了载体(d)的被检测物在通路(e)中移动而到达的部位。
通过可见光对判定部位(f)中的色调变化进行检测，则需不用使用UV照射装置或荧光检测器等特别仪器，也可以对多链核酸的有无进行判定。
作为判定部位(f)的材料，只要能使含有多链核酸的被检测物通过或被吸收的材料即可，没有特别限制。作为优选的具体例，可以列举：无纺布、滤纸、玻璃纤维滤纸、玻璃纤维布、玻璃过滤器、硝酸纤维素滤膜、聚乙烯或聚丙烯等所构成的多孔材料等。这些材料在具有适度的吸湿速度，并且具有多链核酸着色并显色时的目测确认性优异等优点。
并且，如果制作显示根据多链核酸的量的显色程度的对比表，则可以推算被检测物中的多链核酸浓度。此外，使用规定浓度的标准核酸制作校准曲线，则可通过分光光度仪、色差仪、反射仪等常用的分析仪器对样品中的多链核酸量进行定量。
对于向多链核酸检测装置或试剂盒上样被检测物的方法没有特别限制，例如被检测物可以通过滴加、浸渍、或吸附、离心来进行上样。此外，添加被检测物后，也可以另外用溶剂进行展开。用溶剂进行展开时，使用的溶剂只要不影响染料的色调既可，没有特别限制，可以列举水、缓冲液等。也可以在本发明的多链核酸检测装置或试剂盒中，另外设置试剂添加部位。此外，也可以将被检测物直接上样至保持有无色型染料的载体(d)。
此外，上述载体(d)可以单独保持无色型染料，也可以保持无色型染料和稳定剂。作为稳定剂，可以使用胺、硫醇、还原剂等，只要能抑制无色型染料的自然显色既可，不局限于这些。此外，可以不在载体上直接保持无色型染料，而是混合与处于显色状态的染料反应而变化为无色型的化合物并共存于载体中。作为与处于显色状态的染料反应而变化为无色型的化合物，可列举：亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂等亲核剂，但不局限于此。此外，可在载体(d)的下游以及/或者上游侧设置保持有稳定剂、其他种类的染料的载体。此时，载体(d)和(e)可相互接触，也可以是不接触的。此外，也可以在两载体的中间以及/或者两载体的前后设置其它载体。如果需要，可另外设置将被检测物上样的区域和对显色进行判断的区域等。
用于设置载体的基体材料构件，只要能够保持载体既可，没有特别限制。例如可以使用塑料、纸、玻璃等材质。此外，也可以使表面具有粘性。
使用上述的多链核酸检测装置或试剂盒，可以通过多链核酸与无色型染料反应导致的显色，迅速并简单地检测多链核酸。
将本实施方式中的多链核酸检测装置或试剂盒的实施方式的具体例子，显示在图1至图4中。
图1显示了色谱型多链核酸检测装置。该检测装置是使用粘合剂等将保持有无色型染料的载体1、试剂添加部位2、判定部位3粘贴在作为基体材料的构件4上的检测装置。
图2显示了过滤器型多链核酸检测装置。在图2的装置中，被检测物被上样至支撑体5内部，边与载体1保持的无色型染料接触，边被收容在被检测物收容容器6中。根据上述结构，根据被收容在被检测物收容容器6中的被检测物溶液的色调，可判定被检测物中所含的多链核酸的有无及其含量。通过离心、加压等使被检测物通过过滤器型载体，则可非常迅速并且简单的对多链核酸的有无以及其含量进行判定。
图3显示了吸引型多链核酸检测装置。图3显示的检测装置由保持有无色型染料的载体1、以及由吸引用具所组成的支撑体7构成。在图3中，作为吸引用具所组成的支撑体，列举了微量滴液管用的吸管(tip)，此时需要在上面开口部装上微量吸液管，再从吸引口吸入被检测物。本实施方式不局限于微量吸液管用尖头，也可以良好的适用：Pasteur吸管、Komagome吸管等吸管类、毛细管、注射器等。通过该构成，可以通过使用分别具备载体的吸引用具来吸入被检测物，而根据色素的色调对于多链核酸的有无迅速并且简单地进行目测检测。
图4中显示了通路型多链核酸检测装置。在图4所示的通路型装置中，其特征在于，保持有无色型染料的载体1被配置于刻出有通路的芯片8上。该芯片也可具备以核酸精制、核酸扩增为目的的结构。在本实施方式的检测装置中，被上样至试样添加部位9的被检测物，在流路10中移动而通过载体1，最后到达判定部位14。多链核酸的有无、含量，可以通过在可见光下观察判定部位14的显色，通过目测判定进行判断。此外，流路10的形状没有特别限制，例如可以是直线或曲线。如图4所示，可以改良为在芯片8上保持有多个通路和载体的组合，通过通路的长度差异，使被检测物达到判定部位14为止的通过流路10的时间产生差异。芯片8具有以核酸扩增为目的的结构时，可以通过被检测物通过时间的差异引发核酸扩增量差异，从而阶段性地进行核酸扩增及其产物的检测。
3.核酸检测装置以及试剂盒
此外，本发明还涉及多链核酸检测装置或试剂盒，其含有：(g)保持无色型染料，具备通过外力开口而将无色型染料放出的开口部的载体，(h)将被放出的无色型染料导向判定部位的通路，以及(i)保持导入的被检测物，利用可见光，检测通过从载体(g)经过通路(h)而被导入的无色型染料与保持的被检测物的反应而产生的色调的变化，对多链核酸的存在进行判定的判定部位。
作为保持无色型染料，具备通过外力开口而将无色型染料放出的开口部的载体(g)的材料，只要是能够一定期间稳定保持无色型染料即可，没有特别限制。在载体(g)中填充有无色型染料，将无色型染料放出的开口部通常是封闭的，只有通过外力使载体(g)开口时，无色型染料才被放出。在这里，外力只要是能够使载体开口即可没有特别地限制，例如用手指按下、或采用机械方式按下。通过外力开口的方式，只要能放出无色型染料即可，没有特别限制。例如，可以列举破坏保持有无色型染料的膜。本实施方式的装置或试剂盒可以具备使载体(g)的开口容易的针状结构。
将被放出的无色型染料导入判定部位的通路(h)，是指使上述载体(g)放出的无色型染料通过的通路。通路(h)的形状、材质，只要能够使无色型染料通过即可，没有特别限制。例如，放出的无色型染料由于重力下落到判定部位(i)时，通路(h)只要不阻碍无色型染料的下落即可。
保持导入的被检测物，利用可见光，检测通过从载体(g)经过通路(h)而被导入的无色型染料与保持的被检测物的反应而产生的物质，对多链核酸的存在进行通过目测进行判定的判定部位(i)如本发明的第一实施方式涉及的多链核酸的检测装置或试剂盒中所说明的。
本实施方式中的多链核酸检测装置的形式的具体例显示在图5中。
图5显示了管型多链核酸检测装置。该管型检测装置中还包含具有通过从外部的物理作用而将染料添加到核酸溶液中的结构的部分。例如，图5中的管13的盖子部分，用膜保持有无色型染料11，通过设置在盖子中的针状结构12，通过例如用手指按下等从外部而来的物理作用将膜破坏，使无色型染料11滴到管下部，可对管下部的被检测物中所含的多链核酸进行染色。
在本发明中，多链核酸检测试剂盒，是指在含有使多链核酸特异性显色的无色型染料的溶液所构成的检测用单元之外，还具有各种试剂、器具等的实施方式。进一步含有上述装置的也称之为试剂盒。在上述各种试剂中，包含用于将目的核酸进行扩增的引物、DNA聚合酶、核酸扩增反应中所用的缓冲液、限制酶等。
使用这些装置而得到的、含有多链核酸的着色的被检测物，可以直接用于其他分子生物学操作中。这样的分子生物学操作包括限制酶处理、测序反应、PCR之类的酶反应、利用电泳的确认操作等。
此外，也可以在被检测物进行自动化处理，进行碱基序列等解析的装置中组入本发明的多链核酸检测装置。例如，通过在核酸精制、核酸扩增装置中组入本发明的核酸检测装置，可对核酸的有无进行判定；通过组入到DNA自动解析装置中，可以切实地只对通过PCR扩增、标记的样品进行筛选、解析。
实施例
以下通过实施例对本发明进行具体的说明。但是本发明的技术范围并不局限于这些实施例。
(实施例1)使用了无色型染料(1)的PCR产物的检测
(i)无色型染料(1)的合成
将结晶紫500mg溶解在水中后，加入正丙胺200mg，搅拌30分钟。将生成的沉淀干燥，得到无色型染料(1)(1,1-三(4-N,N-二甲基氨基丙基)-N-氨基丙烷(1,1-tris(4-N,N-dimethylaminophenyl)-N-aminopropane))450mg。
(ii)PCR产物的制备
使用pUC19(Takara Bio公司制造)作为模板，设计了下述引物F：5’-GGAAACAGCTATGACCATGA-3’以及引物R：5’-CTATGCGGCATCAGAGCAG-3’，使得通过PCR扩增能够使约330碱基对得到扩增。将引物F和引物R各15pmol以及10ng的pUC19，放入0.2mlPCR用管中，按照ExTaq PCR试剂盒(Takara Bio公司制造)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。之后，将管放入热循环仪(GeneAmp PCR System(Applied Bio System制造)中，在95℃进行5分钟的热处理后，进行95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下30秒的循环35次，进行目标的约330bp的扩增，作为阳性对照。此外，不添加ExTaq DNA聚合酶，进行相同的反应，作为阴性对照。
(iii)PCR产物的检测
向阳性对照以及阴性对照50μl中，添加上述合成的无色型染料(1)2μg，进行了色调变化的观察以及吸光度(A590nm)的测定。将其结果显示在表1中。
(比较例1)
除了使用龙胆紫来作为无色型染料的替代物之外，其他采用与实施例1相同的方法，对PCR产物进行检测。将其结果显示在表1中。
(实施例2)使用了无色型染料(1)的LAMP产物的检测
(i)LAMP法产物的制备
使用“Loopamp(R)沙门氏菌检测试剂试剂盒”(荣研化学公司制造)，制备了LAMP法的核酸扩增反应液。通过将10μl的对照(Control)DNA Sal和40μl的Master Mix(将Reaction Mix.Sal与Bst DNA聚合酶(Polymerase)按容量比20:1的比例另外混合的)进行混合，在65℃反应1小时后，进一步在80℃条件下反应20分钟，制备了核酸被扩增了的反应液(阳性对照)。此外，混合10μl的Control DNA Sal和40μl的Reaction Mix.Sal，在65℃反应1小时后，进一步在80℃条件下反应20分钟，制备出没有核酸扩增的反应液(阴性对照)。
(ii)LAMP法产物的检测
除了用LAMP法产物作为被检测物之外，其他与实施例1同样进行。将其结果显示在表1中。
(表1)
在实施例1中，有通过PCR的核酸扩增的阳性对照中，添加无色型染料后马上变化为蓝紫色。一方面，在没有通过PCR的核酸扩增的阴性对照中，没有看到添加无色型染料引起的着色，因此可通过目测对核酸扩增的有无容易地进行判断。此外，通过染料进行检测所需要的时间在1分钟以内。
在比较例1中，无论核酸扩增的有无都呈现蓝紫色，难于对核酸的有无进行判断。
在实施例2中，有通过LAMP法的核酸扩增的阳性对照中，添加无色型染料后马上变化为蓝紫色。一方面，在没有通过LAMP法的核酸扩增的阴性对照中，没有看到添加无色型染料引起的着色，因此可通过目测对核酸扩增的有无容易地进行判断。此外，通过染料进行检测所需要的时间在1分钟以内。
(实施例3)使用了甲基绿的多链核酸的检测
将0.2%甲基绿水溶液100μl和2-巯基乙醇50μl混合，在室温下反应10分钟。采用与实施例1和2相同的方法，制备了PCR产物和LAMP法产物。在各自的核酸扩增产物的阳性对照和阴性对照各50ul中，添加上述混合液2μl，对色调变化进行了观察。将其结果显示在表2中。
(表2)
在具有通过PCR、LAMP法得到核酸扩增的阳性对照中，添加甲基绿水溶液和2-巯基乙醇组成的混合液后马上变化为蓝紫色。一方面，在没有核酸扩增的阴性对照中，没有看到混合液的添加引起的着色，因此可通过目测对核酸扩增的有无容易地进行判断。此外，通过染料进行检测所需要的时间在1分钟以内。
(实施例4)使用了龙胆紫B的多链核酸的检测
将等量的含有0.2%龙胆紫B的50%乙醇溶液和6%亚硫酸钠水溶液进行混合。采用与实施例1和实施例2相同的方法制备了PCR反应液和LAMP法反应液。在各个核酸扩增产物的阳性对照和阴性对照各50μl中，添加上述制备的混合液1μl，对添加后的色调变化进行了观察。之后，对590nm处的吸光度进行测定。将其结果显示在表3中。
(表3)
在具有通过PCR、LAMP法得到核酸扩增的阳性对照中，添加混合液后马上变化为蓝紫色。另一方面，在没有核酸扩增的阴性对照中，没有看到混合液的添加引起的着色，因此可通过目测对核酸扩增的有无容易地进行判断。此外，通过染料进行检测所需要的时间在1分钟以内。
(实施例5)吸引型装置的制作
制备在实施例1中合成的无色型染料(1)的0.2%溶液，将该溶液1μl浸渍在剪成圆形的多孔聚乙烯片中(气孔径50μm、厚度1.5mm、直径1.5mm)中。将此在室温进行干燥，形成保持有染料的载体。将上述载体如图3所示，填充到200μl用的吸量管尖头(pipette tip)的前端，制作了吸引型装置。
(实施例6)通过吸引型装置进行多链核酸的检测
按照分别与实施例1和实施例2相同的方法制备PCR产物和LAMP法产物，准备了阳性对照和阴性对照。将实施例5所制作的吸引型装置装在微量吸液管上，分别吸引被检测物100μl，对吸量管尖头内的被检测物溶液的色调进行了观察。将其结果显示在表4中。
(实施例7)吸引型装置的制作
混合等量的0.2%龙胆紫和6%亚硫酸钠，将该溶液1μl浸渍在剪成圆形的多孔聚乙烯片中(气孔径50μm、厚度1.5mm、直径1.5mm)中。将此在室温进行干燥，形成保持有染料的载体。如图3所示，将上述载体填充到200μl用的吸量管尖头的前端，制作了吸引型装置。
(实施例8)通过吸引型装置进行多链核酸的检测
按照分别与实施例1和实施例2相同的方法制备PCR产物和LAMP法产物，准备了阳性对照和阴性对照。将实施例7所制作的吸引型装置装在微量吸液管上，分别吸引被检测物100μl，对吸量管尖头内的被检测物溶液的色调进行了观察。将其结果显示在表4中。
(表4)
在实施例6中，在有通过PCR法和LAMP法的核酸扩增时，尖头内的被检测物液体呈现蓝紫色，另一方面，不存在扩增核酸时是无色透明的。使用吸引型装置对核酸扩增进行检测所需要的时间只有数秒钟，可以迅速并且简单地通过目测进行判断。
在实施例8中，在有通过PCR法和LAMP法的核酸扩增时，尖头内的被检测物液体呈现蓝紫色，另一方面，不存在扩增核酸时是无色透明的。使用吸引型装置对核酸扩增进行检测所需要的时间只有数秒钟，可以迅速并且简单地通过目测进行判断。
(实施例9)对使用了着色后样品处理进行的探讨
采用与实施例1和3相同的方法，进行PCR产物的着色，使用着色后的样品进行了电泳、PCR、限制酶处理、测序反应。其结果，本发明进行的核酸着色不会影响后续处理，均能够良好地实施。

Claims (9)

1.多链核酸的检测方法，其包括：
使无色型染料与多链核酸接触的工序，所述无色型染料为处于显色状态的染料与亲核剂的反应产物，
该方法中，用可见光对因无色型染料与多链核酸的相互作用而呈现的色调进行检测，其中，
无色型染料是通式(I)所表示的化合物，
式(I)中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基，L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H，其中，R4表示碱金属或氢原子，X表示卤素原子，R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基；
由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的通式(I)中L所表示的脱离基解离，因该脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述通式(I)所表示的化合物是通式(II)所表示的化合物，
式(II)中，L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H，其中，R4表示碱金属或氢原子，X表示卤素原子，R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基，R11以及R12分别独立地表示取代或未取代的芳基，R13、R14、R15、R16以及R17分别独立地表示卤素原子、羧基、磺基、硝基、氰基、酰胺基、氨基、烷基、芳基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷氨基、芳氨基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、烷磺酰基或芳磺酰基。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
无色型染料为三芳基甲烷类染料与亲核剂的反应产物。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，
三芳基甲烷类染料是选自龙胆紫、结晶紫、甲基绿、孔雀绿、维多利亚蓝以及副品红中的1种以上的染料。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，
亲核剂为选自亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂中的1种以上的亲核剂。
6.多链核酸检测装置或试剂盒，其含有：
(d)保持无色型染料的载体，所述无色型染料为处于显色状态的染料与亲核剂的反应产物，
(e)供被检测物通过载体(d)的通路，以及
(f)用可见光检测因被检测物与无色型染料相互作用而呈现的色调，从而对多链核酸的存在进行判定的部位，其中，
无色型染料是通式(I)所表示的化合物，
式(I)中，R1、R2以及R3分别独立地表示取代或未取代的芳基，L表示-SO3R4、-NO3、-NO2、-CN、-X、-NHR5、-N(COR6)(COR7)、-SR8、-SSR9、-OR10、-NHSNH2、-OH或-H，其中，R4表示碱金属或氢原子，X表示卤素原子，R5、R6、R7、R8、R9以及R10分别独立地表示烷基、芳基、酰基、烯基或炔基；
由于无色型染料与多链核酸的相互作用，无色型染料的通式(I)中L所表示的脱离基解离，因该脱离基的解离，呈现用可见光能够检测出的色调。
7.根据权利要求6所述的装置或试剂盒，其中，
载体(d)保持三芳基甲烷类染料和亲核剂的混合液。
8.根据权利要求7所述的装置或试剂盒，其中，
三芳基甲烷类染料是选自龙胆紫、结晶紫、甲基绿、孔雀绿、维多利亚蓝以及副品红中的1种以上的染料。
9.根据权利要求7或8所述的装置或试剂盒，其中，
亲核剂为选自亚硫酸根离子、亚硫酸氢根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、氰离子、卤化物离子、氮亲核剂、硫亲核剂、碱金属烷氧化物、碱金属氢氧化物、以及氢化物亲核剂中的1种以上的亲核剂。
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