CN102356161A - 核酸的检测方法以及试剂盒、装置 - Google Patents

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Abstract

简便且高精度地目测检测采用核酸扩增方法扩增的核酸，而无需特殊装置。本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测方法，该检测方法包括：(1)使被检物与染料接触并反应的步骤；(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。此外，本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其具有：(a)保持了能够与核酸结合的染料的载体；(c)被检物通过载体(a)的路径；和(d)在可见光下观察由被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。

Description

核酸的检测方法以及试剂盒、装置
技术领域
本发明涉及能够对通过核酸扩增方法扩增的核酸进行检测的核酸检测方法和试剂盒、装置。
背景技术
在分子生物学研究领域、基因检查等临床应用领域中，特异性扩增靶标核酸片段的方法成为非常重要的技术。在这样的基因扩增方法中，除了最通用的PCR法(Polymerase Chain Reaction)以外，还开发出了无需PCR法中不可缺少的复杂温度控制的LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICAN(lsothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等的等温扩增方法。
作为通过PCR法、LAMP法、ICAN法等扩增出的特定核酸区域的检测方法，大致可以分为对作为扩增产物的DNA进行检测的方法、和对作为副产物的焦磷酸(二磷酸)进行检测的方法这两类。
检测双链核酸的最一般方法已知有对扩增反应后的溶液实施琼脂糖电泳，使之结合Ethidium Bromide、SYBR Green等荧光性嵌入剂，并观察特异性的荧光的方法(非专利文献1)。但是，电泳后用Ethidium Bromide等荧光性嵌入剂进行染色的方法需要30分～1小时左右的泳动时间，而且需要用于检测荧光的紫外线照射装置、荧光检测器等昂贵的机械。
此外，作为无需进行电泳、而对PCR产物进行检测和定量的方法，已知有通过预先在PCR开始前的反应液中添加荧光性嵌入剂，并使用荧光分光光度计测定荧光强度，来测定扩增DNA量的方法(专利文献1)。但是，荧光性嵌入剂与引物等单链核酸结合，因而导致不依赖于双链核酸量的背景信号增强、检测灵敏度降低的问题。与此相对，已知有通过用优先与结合了单链核酸的嵌入剂反应的化合物进行处理，来降低背景信号的方法(专利文献2)。但是，在采用这些方法的情况下，需要用于检测荧光的装置、设备。
作为上述以外的方法，例如已知有使用荧光标记的引物进行核酸扩增反应、并通过荧光偏光来检测该核酸扩增产物的方法(专利文献3)。但是，这需要对未进入扩增产物的荧光标记引物的分离操作，不仅烦杂，而且由于引物的分离操作，存在所得核酸扩增片段的收获量减少、结果导致检测灵敏度降低的隐患。此外，一般而言，标记核苷酸、标记引物非常昂贵，在成本方面也存在问题。
此外，还已知使偏振光通过核酸扩增反应中的反应液，并通过测定该偏振光的旋光度或圆偏光二色性来检测核酸扩增产物的方法(专利文献4)。但是，旋光度、圆偏光二色性的测定需要特殊装置。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开平5-237000号公报
专利文献2：国际公开第2002/103053号
专利文献3：特开平9-187275号公报
专利文献4：特开2002-186481号公报
非专利文献
非专利文献1：Molecular Cloning second edition，vol.1，6.15(1989)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是提供：无需特殊装置、简便且高精度地目测检测采用核酸扩增方法扩增的核酸的核酸检测方法、和核酸检测装置或试剂盒。
解决问题的方法
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过在核酸扩增反应的前或后添加因与核酸结合而色调发生变化的染料，通过在可见光下进行观察，能够检测核酸扩增的有无。而且独立发现：通过添加与结合双链核酸的染料相比、优先和与单链核酸结合了的染料、未与核酸结合的染料反应的化合物，改变或者消除来源于除了与双链核酸结合了的染料以外的色调，能够简便且高精度地目测检测上述核酸扩增片段。而且，还制作了利用本方法的目测核酸检测试剂盒、装置，从而完成了本发明。
即，本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测方法，其包括：
(1)使被检物与染料接触并反应的步骤；
(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。
优选在所述步骤(1)的前或后包括使与染料反应的物质与被检物接触的步骤(3)。
所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
此外，本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其包含：
(a)保持了能够与核酸结合的染料的载体；
(c)被检物通过载体(a)的路径；和
(d)在可见光下观察由被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
优选在所述载体(a)与判定部位(d)之间具有(b)保持与染料反应的物质的载体。
所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
所述染料优选是选自三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、
Figure BDA0000092205010000031
嗪类染料、吖嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、和菲啶
Figure BDA0000092205010000032
盐类染料中的1种以上的染料。
此外，所述染料优选是选自结晶紫、龙胆紫B、维多利亚蓝B、甲基紫、夜光蓝、甲基绿、甲苯胺蓝O、天青B、亚甲基蓝、亮甲酚蓝、甲基橙、派洛宁Y、溴化乙锭和中性红中的1种以上的染料。
所述与染料反应的物质优选是选自氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂中的1种以上的化合物。
所述酸优选是选自盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸和乳酸中的1种以上的酸。
所述碱优选是选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钾、氨和三乙基胺中的1种以上的碱。
所述氧化剂优选是选自过氧化氢、高锰酸钾、氯酸钾、重铬酸钾、溴酸钠、溴酸钾、卤素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钠、二氧化氯、氯胺、四氧化锇、二甲基亚砜和间氯过苯甲酸中的1种以上的氧化剂。
所述还原剂优选是选自硼氢化钠、氰化硼氢化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、2-巯基乙醇、DL-二硫苏糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇和三2-羧基乙基膦中的1种以上的还原剂。
所述pH缓冲剂优选是选自戈氏缓冲液(Good’s Buffers)、甘氨酸、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、乙酸、和碳酸中的1种以上的pH缓冲剂。
此外，本发明涉及核酸的检测装置或试剂盒，其包含：
(e)保持能够与核酸结合的染料、并具备能够因外力而形成开口从而释放出染料的开口部的载体；
(f)将释放出的染料引导向判定部位的路径；和
(d)保持导入的被检物、在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与保持的被检物之间的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
优选存在于所述判定部位的被检物还包含与染料反应的物质。
所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
发明效果
根据本发明的方法，无需使用特殊的检测仪器，即可在核酸扩增后通过染料的色调变化目测检测核酸扩增的有无。而且，通过氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂引起的染料的色调变化，能够目测检测核酸扩增的有无。此外，由于能够用可见光进行检测，能够提供使用可见区域分光光度计(其是一种通用性高的装置)等的简便的核酸检测方法。
附图说明
[图1]显示本发明的色谱型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[图2]显示本发明的滤器型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[图3]显示本发明的吸引型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[图4]显示本发明的流路型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[图5]显示本发明的管型核酸检测装置的一个例子的示意图。
[图6]在实施例5中，向LAMP反应液中添加了甲基绿时的吸收光谱图。
[图7]在实施例5中，向LAMP反应液中添加甲基绿后、再添加了KOH时的吸收光谱图。
[图8]在实施例6中，向LAMP反应液中添加了甲苯胺蓝O时的吸收光谱图。
[图9]在实施例6中，向LAMP反应液中添加甲苯胺蓝O后，再添加了亚硫酸钠时的吸收光谱图。
发明的具体实施方式
以下对本发明进行具体说明。
1.核酸的检测方法
本发明的包含在被检物中的核酸的检测方法包括：
(1)使被检物与染料接触并反应的步骤、
(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。
在使被检物与染料接触并反应的步骤(1)中，只要被检物与染料接触、两者之间发生反应即可，可以以任何形式接触。
在本发明中，检测对象是核酸，双链核酸包括双链DNA、双链RNA、DNA与RNA的杂合链、以及PNA等人工核酸的双链。而且，即使是单链核酸，当其多个混合存在、且能被染料染色时，也能够采用本发明的检测方法进行确认。
对被检物没有特殊限制，只要包含核酸即可。不但可以是核酸扩增方法的反应液，也可以是来自微生物、动物细胞或植物细胞的抽提液，还可以是来自食品的抽提液。
核酸扩增方法只要是以PCR法为代表的扩增核酸序列的方法即可，可以是任何核酸扩增方法。例如，除了PCR法以外，可以示例出LCR(LigaseChain Reaction)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、RCA(RollingCircle Amplification)法、CPT(Cycling Probe Technology)法、Q-Beta ReplicaseAmplification Technology法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic Acids)法、LAMP(Loop-Mediated IsothermalAmplificaton of DNA)法、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplificationmethod)法、以及TMA(Transcription mediated amplification method)法等公知的方法，但不限于此。Q-Beta Replicase Amplification Technology法、RCA法、NASBA法、SDA法、TMA法、LAMP法、ICAN法等是在一定温度下进行扩增反应的方法，其他的PCR法、LCR法等是在温度循环中进行扩增反应的方法。
此外，利用逆转录酶等将RNA逆转录为DNA、以该DNA作为模板采用上述的核酸扩增方法可以间接地对RNA进行检测。
在本发明中，作为染料，可以列举出：三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、
Figure BDA0000092205010000061
嗪类染料、吖嗪类染料、吩嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、菲啶
Figure BDA0000092205010000062
(phenanthridium)类染料、偶氮类染料、内酯类染料、磺内酯(sultone)类染料、靛青类染料、花青类染料、羊杂菁(oxonol)类染料、苯乙烯型(styryl)类染料、卟啉类染料、硫代夹氧杂蒽类染料、方酸盐(squarainium)类染料、克酮酸(croconium)类染料、azulenium类染料、二硫醇金属盐类染料、萘醌类染料、蒽醌类染料、靛酚(indophenol)类染料、香豆素类染料、香豆素酮类染料、吡喃
Figure BDA0000092205010000064
盐类染料、硫代吡喃盐系、噻唑类染料、喹啉类染料、二苯甲酮类染料、硫代二苯甲酮类染料和它们的混合物。优选为三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、
Figure BDA0000092205010000066
嗪类染料、吖嗪类染料、吩嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、菲啶类染料、偶氮类染料、靛青类染料、内酯类染料、磺内酯类染料和它们的混合物。
而且，在本发明中，三苯基甲烷类染料是指具有下述式(1)或式(2)：
[化1]
Figure BDA0000092205010000068
[化2]
Figure BDA0000092205010000069
表示的结构的染料。
这里，R、R’以及R”独立地选自苯基、萘基、蒽基等这样的取代和非取代芳基。芳基可以用例如氨基、羟基、羰基、羧基、磺酸、烷基这样的官能基团、和/或其他官能基团进行取代。
对可用于核酸检测的染料没有特殊限制，只要能够与核酸结合即可。在具体的例子方面，作为三苯基甲烷类染料，可以列举出例如甲基绿、孔雀绿、结晶紫、碱性副品红、龙胆紫B、龙胆紫R、夜光蓝、维多利亚蓝B、维多利亚蓝R、维多利亚蓝4R、维多利亚蓝BO、玫红酸、品红、酸性品红、碱性品红、新品红、溴百里酚蓝、溴甲酚绿、酚酞、溴酚蓝、专利蓝紫、酚红、颜料蓝1、颜料紫3、苄基紫、五甲基碱性副品红、固绿FCF、乙基紫、绿S、蔷薇苯胺(rosaniline)、酸性蓝7、天青蓝G、搔洛铬花青R、酸性蓝147、亮绿SF黄、亮绿SF、乙基绿、苯胺蓝、甲基紫、铬紫CG。
作为噻嗪类染料，可以列举出例如甲苯胺蓝O、亚甲基蓝、硫堇、天青A、硫醇C。
作为
Figure BDA0000092205010000071
嗪类染料，可以列举出例如亮甲酚蓝、尼罗蓝、棓花青、基础蓝3。
作为吖嗪类染料，可以列举出例如苯胺黑、乙炔黑等。
作为吩嗪类染料，可以列举出例如中性红、詹纳斯绿B、基础红2、番红B。
作为夹氧杂蒽类染料，可以列举出例如荧光素、罗丹明、派洛宁Y。作为菲啶(phenanthridium)类染料，可以列举出例如溴化乙锭。
作为偶氮染料，可以列举出例如Bismarck棕、新胭脂红、基础红29。
作为靛青类染料，可以列举出例如靛蓝胭脂红等。
对于染料在含核酸的溶液中的添加量没有特殊限制，只要能够目测确认溶液的显色即可，优选为1％以下，更优选为0.1％以下。
这些染料中，优选具有通过与核酸结合而色调发生变化的性质、以及酸碱响应性或者氧化还原响应性这两种性质的染料，但也可以仅具有通过与核酸结合而色调发生变化的性质或酸碱响应性或者氧化还原响应性其中之一。此外，这些染料可以使用一种，也可以两种以上组合使用。
因溶液中的pH而色调发生变化的染料称作“酸碱响应性染料”，诸如因氧化还原状态而色调发生变化的染料称作“氧化还原响应性染料”。作为氧化还原响应性染料，可以列举出例如用于酸碱指示剂、氧化还原指示剂这样的染料。
作为具有通过与核酸结合而色调发生变化的性质的染料的例子，可以列举出甲苯胺蓝O、甲基绿、亮甲酚蓝、龙胆紫B、维多利亚蓝B等。具体地，甲苯胺蓝O在不存在双链核酸的情况下是深藏青色，通过与核酸结合变为淡蓝色；甲基绿在不存在核酸的情况下是淡蓝色，通过与核酸结合变为蓝绿色。此外，亮甲酚蓝在不存在核酸的情况下是深蓝色，通过与核酸结合变为蓝绿色。
酸碱响应性染料是指：诸如可见于pH指示剂等的、根据溶液中的氢离子浓度(pH)而色调改变的染料。这其中，通过从酸性到碱性，诸如酚酞是从无色变为紫红色，而诸如甲基橙是从红色变为橙色。
此外，氧化还原响应性染料是指：在氧化状态和还原状态下色调发生变化的染料。例如，亚甲基蓝、甲基绿的氧化型呈蓝色，而还原型则变为无色。另一方面，甲苯胺蓝O的氧化型呈蓝色，而还原型则呈紫红色。
在对基于核酸扩增方法的核酸的扩增进行检测时，优选在核酸扩增反应后的反应液中添加染料，也可以在扩增反应前的反应液中预先添加染料。而且，还可以应用于未进行扩增反应的核酸的检测。
在使用酸碱响应性或者氧化还原响应性染料的情况下，通过增设添加下述物质的步骤，能够增强核酸的有无引起的色调的对比度，使利用可见光的检测变得容易，所述物质是，与双链核酸结合了的染料相比、优先和与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应的物质。即，通过使来源于与双链核酸结合了的染料的色调以外的色调发生改变、或消失成为无色，双链核酸的有无引起的色调的对比度增强。通过上述步骤，即使在使用与双链核酸结合、但与双链核酸的结合引起的色调变化少，或者虽然结合、但全然没有色调变化的染料的情况下，只要染料具有酸碱响应性或者氧化还原响应性，就能够进行双链核酸扩增的目测判定。
例如，目测辨别甲基绿与双链核酸结合时的色调的变化是困难的。但是，通过添加优先与与单链核酸结合了的甲基绿和未与核酸结合的甲基绿反应的物质，能够消除未与双链核酸结合的甲基绿来源的淡蓝色。通过该方法，能够容易地目测判定核酸的有无，诸如，在着色的情况为有双链核酸存在，而在无色的情况为没有双链核酸存在。
作为另外一个例子，甲苯胺蓝O若与双链核酸结合，则从深藏青色变化为淡蓝色。进而，通过添加优先与与单链核酸结合了的甲苯胺蓝O、和未与核酸结合的甲苯胺蓝O反应的物质，可以使未与双链核酸结合的甲苯胺蓝来源的深藏青色变化为紫红色，能够容易地目测判定核酸的有无，诸如，蓝色的情况下为有双链核酸存在，紫红色的情况为没有双链核酸存在。
作为另外一个例子，目测辨别龙胆紫B与双链核酸结合时的色调变化是困难的。但是，通过添加优先与与单链核酸结合了的龙胆紫B、和未与核酸结合的龙胆紫B反应的物质，可以消除未与双链核酸结合的龙胆紫B来源的青紫色，能够容易地目测判定核酸的有无，诸如，青紫色的情况为有双链核酸存在，无色的情况为没有双链核酸存在。
作为另外一个例子，在中性溶液中目测辨别维多利亚蓝B与双链核酸结合时的色调变化是困难的。但是，在中性以上的碱区域的pH环境下，未与双链核酸结合的维多利亚蓝B来源的蓝色变化为淡红色，因而可以容易地目测判定核酸的有无，诸如，蓝色的情况为有双链核酸存在，而淡红色的情况为没有双链核酸存在。
在希望通过本步骤得到色调的对比度的增强效果的情况下，对使用的染料没有特殊限制，可以是在不与双链核酸结合的情况下，显色的变化依赖于pH、氧化还原状态而从有色到无色、或从无色到有色的染料。此外，也可以是例如从蓝色到红色这样的、色调发生变化的染料。这其中，优选为显色的变化依赖于pH、氧化还原状态而从有色到无色、或从无色到有色的染料，因为容易判定核酸的有无。
在使用氧化还原响应性的染料时，作为优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应而使色调发生变化的物质，可以列举出氧化剂和还原剂等。
对上述氧化剂没有特殊限制，具有氧化作用即可，包括过氧化氢、高锰酸钾、氯酸钾、重铬酸钾、溴酸钠、溴酸钾、卤素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钠、二氧化氯、氯胺、四氧化锇、二甲基亚砜、间氯过苯甲酸等。
同样地，对还原剂没有特殊限制，具有还原作用即可，包括硼氢化钠、氰化硼氢化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、2-巯基乙醇、DL-二硫苏糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇、三2-羧基乙基膦及其衍生物等。
此外，在使用酸碱响应性染料时，优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应而使色调发生变化的物质，可以使用酸和碱。作为酸，适合使用盐酸、硫酸、硝酸等无机酸，或者乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸、乳酸等有机酸，对此没有限制。优选盐酸、硫酸、乙酸、柠檬酸，特别优选盐酸、乙酸。作为碱，适合使用氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钾、氨、三乙基胺等，对此没有限制。优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠，特别优选氢氧化钠、碳酸氢钠。
此外，作为优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应而使色调发生变化的物质，也可以使用pH缓冲剂，通过被检物的pH变化而使色调发生变化。对于这样的pH缓冲剂没有特殊限制，能改变被检物的pH即可，适合使用MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS等戈氏缓冲液(Good’s buffer)，甘氨酸、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、碳酸。
优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应而使色调发生变化的物质的具体添加量因染料以及所述物质的种类而变化，因此不能一概而论，本领域技术人员可以实验性地确定目测判定最容易的添加量。一般地，与染料反应的物质的量优选为染料量的1000摩尔当量以下，更优选100摩尔当量以下。
在通过该方法对核酸扩增产物进行检测的情况下，可以向核酸扩增反应后的反应液中添加染料，再添加氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂等使色调发生变化的物质来增强对比度。此外，也可以在预先添加了该染料的状态下进行扩增反应，反应后添加氧化剂、还原剂、酸、碱等来增强对比度。此外，这些氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂可以仅使用1种，也可以2种以上组合使用。而且，在这些氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂最初包含在含核酸的被检物中的情况下，可以仅通过与染料反应的步骤来进行核酸检测。
然后，在于可见光下观察通过步骤(1)中的反应生成的物质、并目测判定核酸的存在的步骤(2)中，无需照射紫外线这样的不是可见光的光，而是在通常的实验室中的照明这样的可见光下进行观察。如果是可见光，则无需像照射紫外线的情况那样使用特殊的装置，能够简便地进行观察。
将目测观察染料与核酸结合时的显色的变化、未与核酸结合的染料的显色的变化称作通过可见光下的观察进行的目测判定。基于可见光下的染料的显色的有无，可以确认是否存在核酸。
这里，对于“色调发生变化”没有特殊限制，能够进行目测判定即可，可以列举出：可见光下颜色的种类发生变化(可见光波长)、或者颜色的浓淡发生变化(反射率)等。作为颜色的种类的变化，可以列举出例如：从紫红色到淡蓝色的变化、以及从黄色到紫红色的变化。
此外，通过测定试样溶液的可见光区域的吸光度，可以检测核酸。而且，在本发明中，可见光特别指380nm～800nm的光。测定波长可以根据使用的染料适宜设定。此外，通过吸光度测定，也可以对试样中的核酸浓度进行定量。
此外，在因染料和核酸而生成不溶性的沉淀物的情况下，使用滤器、膜，或通过离心分离回收沉淀物，也可以从沉淀物的量判断核酸的量。
在本发明中，核酸检测后的着色了的被检物液，也可以直接用于其他分子生物学的操作。这样的分子生物学的操作包括限制酶反应、测序反应、PCR这样的酶反应、利用电泳进行的确认操作等。
而且，本发明的检测方法也可以包含在步骤(1)的前或后，使氧化剂、还原剂、酸、碱或pH缓冲剂等前述的与染料反应的物质与被检物接触的步骤(3)。
2.核酸检测装置或试剂盒
本发明的第一方式的核酸的检测装置或试剂盒具有：
(a)保持了能够与核酸结合的染料的载体、
(c)被检物通过载体(a)的路径、和
(d)在可见光下观察因被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
对于保持了能够与核酸结合的染料的载体(a)的材料没有特殊限制，能够保持染料、含核酸的被检物能通过即可。作为优选的具体例子，可以列举出无纺布、滤纸、玻璃纤维滤纸、玻璃纤维布、玻璃滤器、硝酸纤维素滤膜、由聚乙烯、聚丙烯等制成的多孔质材料等。将染料固定于载体(a)上，可以采用物理吸附或化学结合的公知方法进行。作为物理吸附，可以列举出将载体浸渍于一定量的染料溶液中后再进行干燥的干燥吸附等。
对载体(a)所保持的染料的量没有特殊限制，能够通过目测辨别核酸即可，与含核酸的被检物混合后的染料浓度优选为1％以下，更优选为0.1％以下。
在被检物通过保持染料的载体(a)时，染料与核酸结合。在被检物中包含核酸的情况下，通过被检物与染料接触，核酸与染料结合。此外，在载体所保持的染料的量相对于核酸为过剩量的情况下，有游离的染料残留。这里，结合包括肽键、二硫键这样的共价键、离子键、配位键、范德华键、π-π相互作用这样的非共价键。
载体(a)中核酸与染料的结合还会受到核酸与载体的亲和性、载体的吸湿性的影响。因此，为了调整核酸的非特异性吸附、吸湿性，这些载体的表面可以用亲水性聚合物、表面活性剂包覆或浸渍。
被检物通过载体(a)的路径(c)是指：被提供给本发明的装置或试剂盒的被检物移动的路径。对于路径没有特殊限制，能够引导被检物的移动即可，并非一定要形成沟。路径(c)将载体(a)与判定部位(d)相连接，被检物能够沿路径(c)向载体(a)以及判定部位(d)移动。作为路径(c)的材料没有特殊限制，含核酸的被检物能够通过即可。
在可见光下观察由被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位(d)是指：通过载体(a)后的被检物在路径(c)上移动而到达的部位。
通过在可见光下观察而目测判定判定部位(d)中显色的、色调的差异，能够判定核酸的有无，而无需使用UV照射装置、荧光检测器等特殊的仪器。
作为判定部位(d)的材料，没有特殊限制，含核酸的被检物能够通过或被吸收即可。作为优选的具体例子，可以列举出无纺布、滤纸、玻璃纤维滤纸、玻璃纤维布、玻璃滤器、硝酸纤维素滤膜、由聚乙烯、聚丙烯等制成的多孔质材料等。这些材料在具有适度的吸湿速度的同时，还具有核酸着色而显色时的目测确认性良好等优点。
而且，如果制作显示与核酸的量相应的显色程度的对比表，则也可以推定被检物中的核酸浓度。此外，如果预先使用标定了浓度的标准核酸制作标准曲线，则也可以使用分光光度计、色差计、反射计等通用分析仪器来对试样中的核酸量进行定量。
对于将被检物提供给本发明的核酸检测装置的方法没有特殊限制，被检物可以以例如滴下、浸泡、或吸引、离心的方式提供。此外，也可以在添加被检物后，另行用溶剂展开。在用溶剂展开的情况下，对使用的溶剂没有特殊限制，不影响染料的色调即可，可以列举出水、缓冲液等。本发明的核酸检测装置中可以另行设置试样添加部位。此外，被检物也可以直接提供给保持有染料的载体(a)。
而且，上述的检测装置或试剂盒还可以具有保持与染料反应的物质的载体(b)。该情况下，所述载体(b)优选位于保持染料的载体(a)的下游侧。这里，上游侧和下游侧是指相对的方向，其中，添加被检物的一侧为上游侧，而被检物流动或展开的侧为下游侧。在载体(a)与染料反应后的被检物在载体(b)和与染料反应的物质接触后，通过路径(c)到达判定部位(d)。
包含与核酸结合了的染料和游离的染料的被检物，在与保持有染料反应的物质的载体(b)中，和与染料反应的物质接触并混合。跟与核酸结合了的染料相比较，游离的染料和与染料反应的物质的反应性高，因而优先反应、变色。这里所称的变色包括所有的色调变化，可以列举出例如：从有色到无色透明的变化、从红色到蓝色的变化。
作为被保持在载体(b)中的、与染料反应的物质，可以列举出氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂。作为载体(b)的材料，没有特殊限制，能够保持与染料反应的物质、含核酸的被检物能够通过即可。
而且，上述的载体(a)和(b)可以相互接触，也可以不接触。此外，两载体之间和/或其前后还可以配置其它载体。而且，如有必要，还可以另行具备提供被检物的区域、判定显色的区域、促进被检物与染料、以及染料和与染料反应的物质混合的区域。在被检物中包含与染料反应的物质的情况下，本发明的核酸装置或试剂盒也存在仅由保持了染料的载体构成的情况。
此外，通过将染料和与染料反应的氧化剂等物质保持在同一载体中，可以用1种载体制作核酸检测装置。而且，在染料的色调能够因核酸扩增反应液等被检物来源的化合物而变化的情况下，能够制作仅具有保持染料的载体(a)的核酸检测装置。
在本发明的检测装置中，对作为用于配置载体的基体材料的部件没有特殊限制，能够保持载体即可，可以使用例如塑料、纸、玻璃等材质。此外，表面也可以具有粘合性。
如上述，根据本发明的核酸检测装置，能够将核酸与染料的结合步骤、增强核酸的有无引起的色调的对比度的步骤一起进行，能够迅速且简便地检测核酸。
本方式中的核酸检测装置的形式的具体例子如图1～4所示。
图1示出了色谱型核酸检测装置。图1中所示的检测装置是使用粘合剂等将保持了能够与核酸结合的染料的载体1、保持与染料反应的物质的载体2、试样添加部位3、判定部位4贴合于作为基体材料的部件5上而成的。
图2a中示出了滤器型核酸检测装置。图2a所示的检测装置由保持了能够与核酸结合的染料的滤器型载体1、保持与染料反应的物质的滤器型载体2和判定部位4构成，它们垂直叠合。本形式的装置不具有试样添加部位，被检物直接提供给保持能够与核酸结合的染料的载体1，在载体1中被检物与染料混合。然后，被检物与染料的混合物在垂直方向上浸透，在载体2中接触与染料反应的物质。被检物与染料、以及染料和与染料反应的物质的混合物浸透至判定部位4，根据判定部位4中的色调可以目测判定核酸的有无。
图2b也示出了滤器型核酸检测装置。图2b的装置中，被检物被提供至支持体6的内部，一边依次接触载体1中保持的染料、载体2中保持的与染料反应的物质，一边被收纳于被检物收纳容器7。根据上述构成，根据收纳于被检物收纳容器7中的被检物溶液的色调，能够判定包含在被检物中的核酸的有无或量。如果利用离心、加压等来进行被检物在滤器型载体中的通过，能够非常迅速且简便地判定核酸的有无或量。
图3中示出了吸引型核酸检测装置。图3所示的检测装置由保持了能够与核酸结合的染料的载体1、保持了与染料反应的物质的载体2、以及包括吸引用具的支持体8构成，在吸引用具的吸引口α的相对近端位置配置有保持了能够与核酸结合的染料的载体1，在远端位置配置有保持了与染料反应的物质的载体2。图3中，作为包括吸引用具的支持体示例出了微量加液器用尖头(チツプ)，这种情况下，在上部口β安装微型加液器来从吸引口α吸引被检物。本形式并不限于微量加液器用尖头，可以适合使用巴斯德吸管、Komagome型吸管等吸管类、毛细管、注射器等。根据该构成，通过使用具备各个载体的吸引用具吸引被检物，能够通过染料的色调极迅速且简便地目测检测核酸的有无。
图4中示出了流路型核酸检测装置。图4所示的流路型装置中，保持了能够与核酸结合的染料的载体1以及保持了与染料反应的物质的载体2被配置于开出了流路的芯片9。该芯片还可以具备用于核酸纯化、核酸扩增等目的的机构。在本形式的检测装置中，被提供至试样添加部位10的被检物在流路13中移动，依次通过载体1和2，最后到达判定部位4。核酸的有无或量可以通过在可见光下观察判定部位4中的显色并进行目测判定来判断。需要说明的是，对流路13的形状没有特殊限制，可以是例如直线、曲线。如图4所示，芯片9上保持多个流路与载体的组合，可以根据流路的长度，实现对直至被检物到达判定部位4的在流路13中的通过时间赋予差异。在芯片9具有以核酸扩增为目的的机构的情况下，能够利用被检物的通过时间的差异对核酸的扩增量赋予差异，进行梯度性核酸的扩增及其产物的检测。
本发明的第二方式的核酸检测装置或试剂盒具有：
(e)保持能够与核酸结合的染料、且具备能够因外力而形成开口、释放出染料的开口部的载体、
(f)将释放出的染料引导向判定部位的路径、和
(d)保持导入的被检物、在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与保持的被检物之间的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
作为保持能够与核酸结合的染料、具备能够因外力而形成开口、释放出染料的开口部的载体(e)的材料，没有特殊限制，能够在一定期间内稳定保持染料即可。载体(e)中充填有染料，释放出染料的开口部通常是闭合的。仅在载体(e)因外力而开口的情况下，染料被放出。这里，对外力没有特殊限制，能够形成载体的开口即可，可以列举出例如用手指按压、机械按压。对因外力而开口的方式没有特殊限制，能够放出染料即可，可以列举出例如破坏保持染料的膜。为了使载体(e)的开口容易，本方式的装置或试剂盒可以具备针状结构。
将释放出的染料引导向判定部位的路径(f)是指从上述载体(e)释放出的染料通过的路径。对路径(f)的形状/材质没有特殊限制，染料能够通过即可。例如，在释放出的染料因重力而落下、从而到达判定部位(d)的情况下，路径(f)只要不阻碍染料的落下即可。
保持导入的被检物、在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与保持的被检物之间的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位(d)，与在本发明的第一方式的核酸的检测装置或试剂盒中说明的相同。
本方式中的核酸检测装置的形式的具体例子如图5所示。
图5示出了管型核酸检测装置。该管型装置也包括具有利用来自外部的物理作用而将染料添加至核酸溶液中的机构的装置。例如，在图5中，在管14的盖部分，利用膜保持染料11，借助装入盖中的针状结构12，例如通过利用手指按压等来自外部的物理作用破坏膜，染料11滴落至管下部，对管下部的被检物中所含的双链核酸进行染色。
而且，在图5所示的管型装置中，当在管14所含的被检物中预先包含与染料反应的物质的情况下，通过利用外力使染料11滴落至管14的下部，能够极迅速且简便地增强双链核酸的存在所引起的显色的对比度。
在本发明中，核酸检测试剂盒是指：除了具备由包含与核酸结合的染料的溶液和/或包含与染料反应的物质的溶液构成的检测用单元之外，还具备各种试剂、器具等的形式。再加上上述装置的形式也可以视为试剂盒。所述各种试剂中包括：用于扩增目的核酸的引物、DNA聚合酶、核酸扩增反应中使用的缓冲液、限制酶等。
使用这些装置获得的含核酸的着色后的被检物也可以直接在其他分子生物学操作中使用。这样的分子生物学操作包括：限制酶处理、测序反应、PCR这样的酶反应、利用电泳进行的确认操作等。
此外，自动处理被检物、对碱基序列等进行解析的装置中也可以组合本发明的核酸检测装置。例如，通过在核酸纯化、扩增装置中组合本发明的核酸检测装置，能够判定核酸的有无；通过组合在DNA自动解析装置中，能够切实地仅鉴别出PCR扩增、标记的样品，并进行解析。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明。但，本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
[实施例1]
使用甲苯胺蓝O和甲基绿进行核酸检测
在含1mg/ml浓度的鲑鱼(サケ)来源的核酸的PBS缓冲液(阳性对照)、或不含核酸的PBS缓冲液(阴性对照)100μl中添加5μl的0.1％甲苯胺蓝O或0.2％甲基绿，目测观察色调的变化。而且，将混合液10倍稀释后，使用分光光度计(spectrophotometer V630、日本分光公司制造)测定了可见光区域的极大吸收波长。
结果如表1所示。
[表1]
Figure BDA0000092205010000161
对于任何染料而言，核酸的有无引起的色调差异均是显著的，刚添加后即可进行目测判断。此外，各染料的极大吸收波长方面，甲苯胺蓝O从630nm移动至645nm，甲基绿从630nm移动至640nm。
[实施例2]
使用甲苯胺蓝O进行PCR反应产物的检测
使用pUC19(TAKARA Bio公司制造)作为模板，设计了以下的引物F：5’-GGAAACAGCTATGACCATGA-3’和引物R：5’-CTATGCGGCATCAGAGCAG-3’，使得能够通过PCR扩增得到约330碱基对。
将引物F和引物R各15pmol以及10ng的pUC19装入0.2ml的PCR用管，按照ExTaq PCR试剂盒(TAKARA Bio公司制造)的说明书制备了100μl的PCR反应液。然后，将管置于热循环仪(GeneAmp PCR System(Applied BioSystem制造))，95℃热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环35次，进行目的的约330bp的扩增，作为阳性对照。此外，不添加ExTaq DNA聚合酶进行同样的反应，作为阴性对照。向通过PCR法进行核酸扩增而得到的样品、和未进行核酸扩增的反应液100μl中分别添加0.1％的甲苯胺蓝O 5μl，目测观察色调。而且，将混合液10倍稀释后，使用分光光度计测定了可见光区域的极大吸收波长。
结果如表2所示。
[表2]
 PCR法   色调   极大吸收波长
 -   深藏青   630nm
 +   淡蓝   645nm
在使用基于PCR法的核酸扩增反应液的情况下，也确认到甲苯胺蓝O的色调的变化。此外，观察到了极大吸收光谱的移动。
[实施例3]
使用甲基绿进行LAMP法反应产物的检测
使用“Loopamp(R)沙门氏菌(サルモネラ)检测试剂试剂盒”(荣研化学公司制造)，制备了基于LAMP法的核酸扩增反应液。将10μl的Control DNA Sal与40μl的Master Mix(另行将Reaction Mix.Sal与Bst DNA Polymerase以容量比20∶1的比例混合而成)混合，65℃反应1小时后，再于80℃反应20分，从而制备了核酸得到扩增的反应液(阳性对照)。此外，将10μl的Control DNASal与40μl的Reaction Mix.Sal混合，65℃反应1小时后，再于80℃反应20分，从而制备了核酸未扩增的反应液(阴性对照)。在阳性对照和阴性对照50μl中分别添加0.1％的甲基绿5μl。对反应液的色调进行目测观察后，用分光光度计测定了极大吸收波长。
结果如表3所示。
[表3]
  LAMP法   色调   极大吸收波长
  -   淡蓝   630nm
  +   蓝绿   640nm
在向基于LAMP法的核酸扩增反应液中添加了甲基绿的情况下，能够目测反应液的色调变化。此外，也能够观察到极大吸收光谱的移动。
[实施例4]
使用甲基绿进行PCR反应产物的检测以及亚硫酸钠的对比度增强效果
按照与实施例2相同的方法，制备了基于PCR的核酸扩增反应液。在阳性对照和阴性对照50μl中分别添加0.1％的甲基绿5μl。而且，对添加0.1％的亚硫酸钠2μl后的色调变化进行了观察。然后，将反应液10倍稀释，测定了450nm～750nm的吸收光谱和极大吸收波长处的吸光度。
结果如表4所示。
[表4]
Figure BDA0000092205010000181
在没有基于PCR的核酸扩增的阴性对照的情况下，添加染料后呈淡蓝色，再添加亚硫酸钠则变为无色。另一方面，在有基于PCR的核酸扩增的阳性对照的情况下，添加亚硫酸钠后仍然呈蓝绿色，没有因添加亚硫酸钠而引起的色调的变化。添加亚硫酸钠前的640nm处的吸光度方面，阳性对照为0.695，阴性对照为0.193，该值的吸光度比(阳性/阴性)为3.60；与此相对，添加亚硫酸钠后的吸光度比达到了64.7。如上述，通过添加染料后再添加亚硫酸钠，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
此外，使用用甲基绿和亚硫酸钠着色后的含核酸的样品进行了电泳、PCR、限制酶处理、测序反应，全部能够良好地实施。
[实施例5]
使用甲基绿检测LAMP法反应产物以及KOH的对比度增强效果
按照与实施例3相同的方法，制备了基于LAMP法的核酸扩增反应液。在阳性对照和阴性对照50μl中，分别添加0.1％的甲基绿5μl。而且，对添加1N的KOH 2μl后的色调变化进行了观察。然后，将反应液10倍稀释，测定了450nm～750nm的吸收光谱和极大吸收波长处的吸光度。
结果如表5和图6、7所示。
[表5]
在没有基于LAMP法的核酸扩增的阴性对照的情况下，添加染料后呈淡蓝色，再添加KOH则变为无色。另一方面，在有基于LAMP法的核酸扩增的阳性对照的情况下，添加KOH后仍呈蓝绿色，没有因KOH的添加而引起的色调变化。KOH添加前的640nm处的吸光度方面，阳性对照为0.679，阴性对照为0.176，该值的吸光度比(阳性/阴性)为3.86；与此相对，KOH添加后的吸光度比达到70.6。如上述，通过染料添加后的KOH添加，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
[实施例6]
使用甲苯胺蓝O进行LAMP法反应产物的检测以及亚硫酸钠的对比度 增强效果
按照与实施例3相同的方法，制备了基于LAMP法的核酸扩增反应液。在阳性对照和阴性对照50μl中，分别添加0.1％的甲苯胺蓝O 2.5μl。而且，对添加0.1M的亚硫酸钠2μl后的色调变化进行了观察。然后，将反应液10倍稀释，测定了450nm～750nm的吸收光谱和极大吸收波长处的吸光度。结果如表6和图8、9所示。
[表6]
Figure BDA0000092205010000201
对于阴性对照而言，添加染料呈深藏青色，再添加亚硫酸钠则变为紫红色。另一方面，对于阳性对照而言，没有亚硫酸钠的添加引起的色调变化，呈淡蓝色。亚硫酸钠添加前的645nm处的吸光度方面，阳性对照为0.505，阴性对照为0.586，该吸光度比为0.86；与此相对，亚硫酸钠添加后的吸光度比达到了4.31。
如上述，通过染料添加后的亚硫酸钠添加，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
[实施例7]
使用派洛宁Y进行LAMP法反应产物的检测以及亚硫酸钠的对比度增 强效果
进行了与实施例6相同的实验，不同的是：使用派洛宁Y作为染料。目测观察色调，并测定了极大吸收波长(560nm)处的吸光度。
结果如表7所示。
[表7]
其结果是，就阴性对照而言，添加染料呈紫红色，再添加亚硫酸钠则变为淡红色。另一方面，就阳性对照而言，基本上没有亚硫酸钠的添加引起的色调变化。亚硫酸钠添加前的560nm处的吸光度方面，阳性对照为0.212，阴性对照为0.288，吸光度比为0.74。与此相对，亚硫酸钠添加后的吸光度比达到2.09，通过染料添加后的亚硫酸钠添加，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分以内。
[实施例8]
使用中性红进行LAMP法反应产物的检测以及KOH的对比度增强效果
进行了与实施例6相同的实验，不同的是：使用中性红作为染料，使用KOH代替亚硫酸钠。目测观察色调，并测定了极大吸收波长(525nm)处的吸光度。
结果如表8所示。
[表8]
其结果是，就阴性对照而言，添加染料呈红色，再添加KOH则变为黄色。另一方面，就阳性对照而言，基本上没有因KOH的添加而引起的色调变化。KOH添加前的525nm处的吸光度方面，阳性对照为0.496，阴性对照为0.729，其吸光度比为0.680。与此相对，KOH添加后的吸光度比达到1.80，通过染料添加后的KOH处理，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
[实施例9]
还原剂对利用甲基绿进行的LAMP法反应产物的检测的效果
进行了与实施例5相同的实验，不同的是：作为还原剂，使用抗坏血酸钠、谷胱甘肽、DL-二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、或硫代硫酸钠来代替亚硫酸钠。目测观察色调。
结果如表9所示。
而且，为了观察碱添加引起的色调变化，添加氢氧化钠进行了同样的实验。
[表9]
  还原剂   无核酸扩增   有核酸扩增
  未添加   淡蓝色   蓝绿
  氢氧化钠   无色   蓝绿
  抗坏血酸   淡青   蓝绿
  谷胱甘肽   无色   蓝绿
  DL-二硫苏糖醇   无色   蓝绿
  2-巯基乙醇   无色   蓝绿
  硫代硫酸钠   无色   蓝绿
其结果是，全部还原剂的添加均改变未进行核酸扩增的反应液的色调，对比度得到了增强。
[实施例10]
利用染料进行PCR产物的检测
按照与实施例2相同的方法，制备了基于PCR的核酸扩增反应液。在阳性对照和阴性对照50μl中，添加各种染料，使得终浓度为0.01～0.1％。然后，适量添加还原剂(亚硫酸钠)、氧化剂(过氧化氢)、酸(盐酸)、碱(氢氧化钠)中的任意物质，目测进行扩增核酸检测试验。
其结果是，在作为染料使用碱性副品红、基础绿1、基础蓝3、夜光蓝、龙胆紫B、铬花青R(エリオクロムシアニンR)、乙基紫、甲基紫、阳离子桃红FG、孔雀绿、结晶紫、维多利亚蓝B、维多利亚蓝R、维多利亚蓝4R、碱性品红、新品红的情况下，通过染料添加后的还原剂添加，核酸扩增的有无引起的色调的差异变得更明显，能够进行目测辨别。
此外，在作为染料使用底片红(pinacyanol)、碱性副品红的情况下，通过染料添加后的氧化剂添加，核酸扩增的有无引起的色调的差异变得更明显，能够进行目测辨别。
此外，在作为染料使用底片红、詹纳斯绿B、碱性副品红、基础蓝7、乙基紫、维多利亚蓝R、碱性品红、新品红、甲基紫、噻唑橙的情况下，通过染料添加后的酸添加，核酸扩增的有无引起的色调的差异变得更明显，能够进行目测辨别。
此外，在作为染料使用洋红、硫酸原黄素、天青A、硫堇、碱性副品红、基础红29、基础绿1、阳离子桃红FG、孔雀绿、结晶紫、维多利亚蓝4R、维多利亚蓝R、碱性品红、新品红、龙胆紫B、夜光蓝、基础蓝7、乙基紫、甲基紫、维多利亚蓝B的情况下，通过染料添加后的碱添加，核酸扩增的有无引起的色调的差异变得更明显，能够进行目测辨别。
[实施例11]
使用维多利亚蓝B进行的核酸检测
在含1mg/ml浓度的鲑鱼来源的核酸的各种pH的Tris-HCl缓冲液(阳性对照)、或不含核酸的各种pH的Tris-HCl缓冲液(阴性对照)100μl中，添加2μl的0.01％维多利亚蓝B，目测观察色调变化。
结果如表10所示。
[表10]
  pH   6.5   7   7.5   8   8.5   9   9.5   10
  阴性对照   蓝   蓝   蓝   蓝   淡紫   淡红   淡红   淡红
  阳性对照   蓝   蓝   蓝   蓝   蓝   蓝   蓝   蓝
  目测判定   不可   不可   不可   不可   可   可   可   可
如果使用pH高于pH8.0的缓冲液，核酸的有无引起的色调差异在刚添加后即可进行目测判断。使用pH8.5～pH9.5的缓冲液时，核酸的有无引起的色调差异更为显著。而且，在使用夜光蓝实施相同实验的情况下，核酸的有无引起的色调差异也能够在刚添加后即进行目测辨别。
[实施例12]
使用维多利亚蓝B进行PCR反应产物的检测
按照与实施例2相同的方法，制备了基于ExTaq PCR的核酸扩增反应液(pH8.8)。在阳性对照和阴性对照50μl中，分别添加0.01％的维多利亚蓝B1μl，观察色调变化。
其结果是，在没有基于PCR的核酸扩增的阴性对照的情况下，添加染料呈淡红色。另一方面，在有基于PCR的核酸扩增的阳性对照的情况下，添加染料呈蓝色。如上述，通过染料添加，核酸的有无引起的色调差异更为明显，目测辨别容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
此外，使用用维多利亚蓝B着色后的含核酸的样品进行了电泳、PCR、限制酶处理、测序反应，全部能够良好地实施。
[实施例13]
核酸检测用色谱型装置的制作
(1)保持了能够与核酸结合的染料的载体的制作
在宽5mm、长度9mm的带状纤维素滤纸(SureWick C068、日本Millipore公司制造)中含浸0.1％甲基绿水溶液50μl，将其在室温进行干燥，作为保持了能够与核酸结合的染料的载体。
(2)保持了与染料反应的物质的载体的制作
在宽5mm、长度9mm的带状纤维素滤纸(SureWick C048、日本Millipore公司制造)中浸渍0.1M亚硫酸钠水溶液50μl，将其在室温进行干燥，作为保持了与染料反应的物质的载体。
(3)色谱型装置的组装
除上述的两载体以外，还准备了宽5mm、长度15mm的玻璃(グラス)纤维滤器(SureWick G028、日本Millipore公司制造)的试样添加部位、和宽5mm、长度20mm的纤维素滤纸(CFSP22300、日本Millipore公司制造)的判定部位。将这些部件配置在贴有粘合片的PVC制基体材料上，使得像图1那样各自端部重叠1mm，制作了核酸检测用色谱型装置。
[实施例14]
利用核酸检测用色谱型装置进行核酸检测
按照与实施例2相同的方法，制备了基于PCR的核酸扩增反应液。此外，不添加ExTaq DNA聚合酶进行相同的反应，作为阴性对照。
在各被检物100μl中添加400μl的20mM Tris-HCl(pH8.0)后，用微量加液器将该混合液滴下至实施例13中制作的装置的试样添加部位。室温放置10分后，目测观察判定部位的色调。其结果如表11所示。
[表11]
Figure BDA0000092205010000241
在有基于PCR法的核酸扩增的情况下，判定部位呈蓝绿色；另一方面，在没有核酸扩增的情况下，染料的颜色消失，呈现滤纸颜色的白色，可以通过判定部位的显色容易地判定核酸的有无。
[比较例1]
像实施例13那样制作了装置，不同的是：未在保持与染料反应的物质的载体中浸渍亚硫酸钠。其结果如表11所示。
无论是否有基于PCR法的核酸扩增，判定部位均呈蓝绿色，目测判定核酸的有无是困难的。
[实施例15]
核酸检测用滤器型装置的制作
(1)保持了能够与核酸结合的染料的载体的制作
使用6mm的打孔器(パンチ)将玻璃纤维制的滤纸(GA100、ADVANTEC东洋公司制造)冲成圆形。在其中含浸0.1％孔雀绿水溶液50μl，将其在室温进行干燥，作为保持了能够与核酸结合的染料的载体。
(2)保持了与染料反应的物质的载体的制作
将玻璃(グラス)纤维制的滤纸(GA100、ADVANTEC东洋公司制造)用6mm的打孔器冲成圆形。在其中含浸0.01％亚硫酸钠溶液50μl，将其在室温进行干燥，作为保持了与染料反应的物质的载体。
(3)滤器型装置的组装
将上述的两载体按从下方起依次为保持了与染料反应的物质的载体、保持了能够与核酸结合的染料的载体的顺序，配置于图2b的6所示的形状的管筒中。而且，将配置有各载体的管筒装设于微管中，制作了滤器型装置。
[实施例16]
利用核酸检测用滤器型装置进行核酸的检测
按照与实施例2相同的方法，制备了基于PCR的核酸扩增反应液。此外，不添加ExTaq DNA聚合酶进行相同的反应，作为阴性对照。用微量加液器将各被检物250μl滴下至实施例15中制作的装置的管筒部位。然后，进行离心处理(10,000rpm、10秒)，目测观察汇集在微管中的被检物的色调。其结果如表12所示。
[表12]
Figure BDA0000092205010000251
根据核酸扩增的有无，被检物溶液的色调变化为蓝或无色，目测判定能够容易地进行。
[实施例17]
核酸检测用吸引型装置的组装
(1)保持了能够与核酸结合的染料的载体的制作
在冲成圆形的多孔质聚乙烯片(气孔径50μm、厚度1.5mm、直径1.5mm)中含浸10％甲基绿2μl，将其在室温进行干燥，作为保持了能够与核酸结合的染料的载体。
(2)保持了与染料反应的物质的载体的制作
在冲成圆形的多孔质聚乙烯片(气孔径50μm、厚度1.5mm、直径1.5mm)中含浸1％亚硫酸钠水溶液2μl，将其在室温进行干燥，作为保持了与染料反应的物质的载体。
(3)吸引型装置的组装
将上述的两载体如图3所示那样，按从尖端起依次为保持了能够与核酸结合的染料的载体、保持了与染料反应的物质的载体的顺序，充填200μl用的吸管尖头(ピペツトチツプ)的端部。
[实施例18]
使用核酸检测用吸引型装置进行PCR产物的检测
像实施例2那样进行PCR反应，准备了阳性对照和阴性对照。将实施例17中制作的吸引型装置安装于微量加液器，吸引各被检物100μl，观察吸管尖头内的被检物溶液的色调。其结果如表13所示。
[表13]
 PCR法   +   -
 色调   蓝绿   无色透明
在有基于PCR反应的核酸扩增的情况下，尖头内的被检物液呈蓝绿色；另一方面，在不存在扩增核酸的情况下是无色透明。使用吸引型装置检测扩增核酸所需要的时间仅为数秒，能够迅速且简便地目测判定。此外，使用用吸引型装置进行了核酸扩增的判定后的被检物液1μl，再次进行了PCR反应，从着色后的核酸样品也能够正常地扩增目的核酸。
[实施例19]
使用核酸检测用吸引型装置进行低浓度核酸的检测
像实施例2那样进行PCR反应，得到了含160ng/μl的扩增核酸的反应液。制备将该反应液2倍稀释(80ng/μl)、4倍稀释(40ng/μl)、8倍稀释(20ng/μl)、16倍稀释(10ng/μl)的样品，将各样品用实施例17中制作的吸管尖头吸引。
其结果是，全部样品均可以进行扩增核酸的目测检测，还可以进行低浓度核酸的目测检测。
[实施例20]
使用核酸检测用吸引型装置进行菌落PCR产物的检测
将大肠杆菌用质粒载体pUC19(TAKARA Bio公司制造)按照附带的规程导入大肠杆菌JM109(TAKARA Bio公司制造)，使导入了载体的大肠杆菌菌落在含100μg/ml浓度的氨苄西林的LB琼脂培养基上37℃生长24小时。用牙签挑取该菌落，将菌落悬浮于10μl的灭菌水中。使用该灭菌水1μl，像实施例2那样实施PCR，用实施例17中制作的吸管尖头吸起PCR后的反应液，确认了其显色为蓝色。而且，将该蓝色的反应液提供给1.0％琼脂糖电泳，确认了扩增核酸确实存在。作为对照，在对未导入使用的载体的大肠杆菌同样进行PCR的情况下，未确认到扩增核酸，且未见显色。
[实施例21]
可使用检测后的样品实施的处理的研究
将像实施例2那样进行PCR反应所得的反应溶液中的扩增核酸使用实施例17中制作的吸管尖头进行检测。使用该检测后的着色的含核酸的样品进行了电泳、PCR、限制酶处理、测序反应。
电泳的结果是，通过核酸检测用吸管尖头进行了着色的样品的迁移率与未处理样品的迁移率相同，可以确认检测后也能够进行电泳。此外，使用检测后的反应溶液1μl作为模板，进行实施例2那样的PCR反应，结果是能够进行目的序列的扩增。而且，对检测后的样品进行限制酶处理，酶反应未受到抑制而完成了切割。相似地，使用检测后的反应溶液1μl作为模板进行了测序反应，能够测定碱基序列。
[实施例22]
能够在扩增反应后通过离心进行核酸检测的装置
按照与实施例3相同的方法，制备了100μl的LAMP法反应液，将其转移至Ultrafree-MC(PVDF膜、0.45μm、日本Millipore公司制造)的微管部位。而且，在Ultrafree-MC的滤器管筒的上部添加0.001％的维多利亚蓝B溶液50μl。然后，通过于65℃反应1小时，制备了核酸得到扩增的反应液(阳性对照)。
扩增反应后，通过将反应容器离心(10,000rpm、1分)，使滤器管筒上部的维多利亚蓝B滴下至微管部位。其结果是，仅在有核酸扩增时反应溶液着色，能够在不开合反应容器的盖的情况下，判定核酸扩增的有无。
[实施例23]
利用微流路型装置进行核酸的检测
制作了在流路上的上游侧装入了含甲基绿的珠、含还原剂的珠的图4所示形式的微流路装置。在该微流路型装置内进行核酸扩增反应，样品溶液通过两珠后的反应液显现蓝色。与此相对，在微流路型装置内未进行核酸扩增的情况下，通过珠后变为透明，能够容易地目测判定核酸扩增。
[实施例24]
利用管型装置进行核酸的检测
在PCR管(Eppendorf公司制造)的盖部分固定针，于其中添加实施例12中使用的0.01％的维多利亚蓝B溶液10μl，用市售滤器密闭，制作了图5所示形式的管型装置。使用该管，像实施例3那样进行了基于LAMP法的核酸扩增反应。反应后按压盖，用针在膜上开孔，将维多利亚蓝B溶液添加到反应液中，能够确认核酸扩增。
[实施例25]
使用龙胆紫B进行PCR反应产物的检测
按照与实施例2相同的方法，制备了基于PCR的核酸扩增反应液。在阳性对照和阴性对照50μl中，分别添加1.5μl的0.1％龙胆紫B。而且，对添加1％亚硫酸钠1.5μl后的色调变化进行了观察。此外，测定了590nm处的吸光度。
结果如表14所示。
[表14]
Figure BDA0000092205010000281
在没有基于PCR的核酸扩增的阴性对照的情况下，添加染料呈青紫色，再添加亚硫酸钠则变为无色。另一方面，在有基于PCR的核酸扩增的阳性对照的情况下，亚硫酸钠添加后也呈青紫色，而亚硫酸钠的添加未引起色调变化。亚硫酸钠添加前的590nm处的吸光度方面，阳性对照为0.959，阴性对照为1.255，该值的吸光度比(阳性/阴性)为0.76；与此相对，亚硫酸钠添加后的吸光度比达到6.04。如上述，通过染料添加后的亚硫酸钠添加，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
此外，使用用龙胆紫B和亚硫酸钠着色后的含核酸的样品进行了电泳、PCR、限制酶处理、测序反应，全部能够良好地实施。
[实施例26]
使用龙胆紫B进行LAMP法反应产物的检测
按照与实施例3相同的方法，制备了基于LAMP法的核酸扩增反应液。在阳性对照和阴性对照50μl中，分别添加1.5μl的0.1％龙胆紫B。而且，对添加1％亚硫酸钠1.5μl后的色调变化进行了观察。
就阴性对照而言，添加染料呈青紫色，再添加亚硫酸钠则变为无色。另一方面，就阳性对照而言，没有因亚硫酸钠的添加而引起的色调变化，呈青紫色。如上述，通过龙胆紫B添加后的亚硫酸钠添加，核酸的有无引起的色调的差异变得更明显，目测辨别变得容易。此外，利用染料进行检测所需要的时间是1分钟以内。
[实施例27]
利用使用龙胆紫B和亚硫酸钠的核酸检测用吸引型装置进行的PCR产 物的检测
采用像实施例17那样的方法制作了吸引型装置，不同的是：在保持了能够与核酸结合的染料的载体中使用了龙胆紫B。像实施例2那样进行了PCR反应，准备了阳性对照和阴性对照，将各被检物100μl用吸引型装置吸引，对吸管尖头内的被检物溶液的色调进行了观察。其结果如表15所示。
[表15]
 PCR法   +   -
 色调   青紫   无色透明
在有基于PCR反应的核酸扩增的情况下，芯片内的被检物液呈青紫色；另一方面，在不存在扩增核酸的情况下是则为无色。使用吸引型装置进行扩增核酸的检测所需要的时间仅为数秒，能够迅速且简便地进行目测判定。此外，使用用吸引型装置进行核酸扩增判定后的被检物液1μl，再次进行了PCR反应，从着色后的核酸样品也能够正常地进行目的核酸的扩增。
符号说明
1.保持了能够与核酸结合的染料的载体
2.保持了与染料反应的物质的载体
3.试样添加部位(玻璃(グラス)纤维滤纸)
4.判定部位(滤纸)
5.基体材料
6.保持载体的支持体
7.被检物收纳容器
8.吸管尖头
9.具有流路的芯片
10.试样添加部位
11.染料
12.针状结构
13.流路
14.管

Claims (17)

1.包含在被检物中的核酸的检测方法，该检测方法包括：
(1)使被检物与染料接触并反应的步骤；
(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其还包括(3)在步骤(1)之前或之后，使与染料反应的物质与被检物接触的步骤。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述染料是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
4.包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其具有：
(a)保持有能够与核酸结合的染料的载体；
(c)被检物通过载体(a)的路径；和
(d)在可见光下观察被检物与染料的反应生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
5.根据权利要求4所述的检测装置或试剂盒，其中，在载体(a)与判定部位(d)之间还具有(b)保持与染料反应的物质的载体。
6.根据权利要求4所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
7.根据权利要求6所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是选自三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、
Figure FDA0000092205000000011
嗪类染料、吖嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、和菲啶
Figure FDA0000092205000000012
盐类染料中的1种以上的染料。
8.根据权利要求6所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是选自结晶紫、龙胆紫B、维多利亚蓝B、甲基紫、夜光蓝、甲基绿、甲苯胺蓝O、天青B、亚甲基蓝、亮甲酚蓝、甲基橙、派洛宁Y、溴化乙锭和中性红中的1种以上的染料。
9.根据权利要求5所述的检测装置或试剂盒，其中，所述与染料反应的物质是选自氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂中的1种以上的化合物。
10.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述酸是选自盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸和乳酸中的1种以上的酸。
11.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述碱是选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钾、氨和三乙胺中的1种以上的碱。
12.权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述氧化剂是选自过氧化氢、高锰酸钾、氯酸钾、重铬酸钾、溴酸钠、溴酸钾、卤素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钠、二氧化氯、氯胺、四氧化锇、二甲基亚砜和间氯过苯甲酸中的1种以上的氧化剂。
13.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述还原剂是选自硼氢化钠、氰化硼氢化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、2-巯基乙醇、DL-二硫苏糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇和三2-羧基乙基膦中的1种以上的还原剂。
14.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述pH缓冲剂是选自戈氏缓冲液(Good’s Buffers)、甘氨酸、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、乙酸、和碳酸中的1种以上的pH缓冲剂。
15.一种核酸的检测装置或试剂盒，其具有：
(e)保持能够与核酸结合的染料、并具备能够因外力而形成开口从而释放出染料的开口部的载体；
(f)将释放出的染料引导向判定部位的路径；和
(d)保持导入的被检物，在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与保持的被检物之间的反应而生成的物质，并目测判定核酸的存在的判定部位。
16.根据权利要求15所述的检测装置或试剂盒，其中，存在于判定部位的被检物还包含与染料反应的物质。
17.根据权利要求15所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
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