CN103483872B

CN103483872B - 用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN103483872B
Application number: CN201310461322.1A
Authority: CN
Inventors: 李建忠; 单虎
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-09-30
Also published as: CN103483872A

Abstract

本发明涉及一种用于肿瘤组织细胞染色剂组合物，具体而言涉及用于组织肿瘤细胞的染色剂组合物，该组合物包括显色剂，0.01-5%；叶酸≤6.5%；隐色剂，0.1-10%；pH调节剂≤10%；水，3-95%。其中，显色剂为亚甲基蓝和/或二氯酚靛酚，隐色剂为还原性试剂，靶向药物制剂为叶酸，以及溶液pH调节剂和水。所述用于肿瘤细胞染色的染色剂，也可用于肿瘤细胞的检测，本发明还涉及所述染色剂组合物用于肿瘤细胞检测的方法以及用于检测肿瘤细胞的试剂盒以及检测载体。

Description

用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物，特别涉及一种用于肿瘤细胞的基于颜色变化的染色剂组合物。本发明还涉及该组合物用于检测肿瘤细胞的组合物以及其使用载体。

技术背景

目前，针对肿瘤细胞的染色剂，世界通用的是姬氏、瑞氏两种染料，它们是以酸碱化学物质经过加热制成的混合物，容易因湿度等原因导致其比例失衡，另外，其对细胞染色不存在特异性。

用于对组织肿瘤细胞进行活体染色的方法主要有基于乙酸白化反应、碘实验、甲苯胺蓝实验、亚甲基蓝实验，其中亚甲基蓝染色较为广泛。乙酸白化反应时通过3-5%乙酸溶液，涂抹于组织细胞，等待一段时间后观察组织细胞有无乙酸白化反应区。若有白化区，则该组织怀疑有肿瘤细胞。碘实验的原理是糖原反应，该反应对肿瘤细胞染色的特异性较低。使用甲苯胺蓝的方法易使中性白细胞和细菌的核碎片着色，容易导致假阳性，且其对肿瘤细胞不易着色。

亚甲基蓝是一种无毒性的生物染色材料，它的氧化型呈蓝色，还原型为无色。其对癌细胞及黑色素有高度的亲和性。在弱酸条件下，还原态的亚甲基蓝可以被癌细胞中具有强氧化性的自由基氧化为亚甲基蓝，呈蓝色，可初步估计判断是否含有癌细胞。有研究将其用于食道上皮组织细胞的定位活体取材，其具有提高活检阳性率的作用。专利CN201110449270采用糖类还原剂，在酸性条件下，制备还原态亚甲基蓝；利用还原态亚甲基蓝的氧化变色特性和叶酸以及叶酸复合物组合使用；通过染色和颜色变化反应，快速定位和检测上皮肿瘤细胞的检测，取得了较好效果。我们研究发现，该实验条件下，糖类是一种弱还原剂，很难实现对亚甲基蓝的还原；采用弱碱性条件，制备还原态亚甲基蓝，当加入酸性试剂，例如醋酸，还原态亚甲基蓝会显蓝色，进而导致染色时颜色变化不稳定。

发明内容

本发明的目的在于生产一种准确率高、操作简便、特异性高的肿瘤细胞染色剂，对手术前组织细胞进行染色，利用颜色变化，加强肿瘤细胞与正常细胞的区别，指导病变区域的检测。本发明涉及一种针对肿瘤细胞的染色剂，其对肿瘤细胞和正常细胞存在染色差异性。

临床研究证明，叶酸受体在大多数肿瘤细胞表面过度表达，而在正常细胞中的存在很少，所以叶酸可以作为肿瘤特异性靶向介导分子，用于肿瘤的诊断和治疗。研究发现叶酸与亚甲基蓝分子能够形成叶酸亚甲基蓝复合物。在酸性条件下，复合物能够与肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体结合，进而容易进入肿瘤细胞。研究发现，尽管肿瘤组织的抗氧化能力比一般正常组织明显增强，但仍存在明显的氧化应激状态。另外，肿瘤细胞的新陈代谢增强，其细胞中氧化还原平衡过程中倾向于氧化，除非肿瘤细胞处于死亡或抑制状态。因此，在活细胞的胞内环境下，在肿瘤细胞的氧化应激态中，还原态亚甲基蓝被迅速氧化，产生颜色变化，亚甲基蓝变为紫黑色。本发明的组合物中的还原态的亚甲基蓝在肿瘤细胞中得到氧化，呈现出氧化态的绿色、蓝绿色和紫黑色。

本发明利用叶酸与肿瘤细胞过度表达的叶酸受体的相互作用，并结合显色剂亚甲基蓝和/或二氯酚靛酚在氧化还原中颜色的变化，能够快速、准确对异常细胞进行染色，进而将其与正常细胞进行区分，并通过本发明组合物的颜色变化快速显示颜色，判断组织细胞是否为肿瘤细胞，由此提供了快速、准确、简单的对异常组织细胞的定位与检测。本发明染色剂组合物，对异常细胞敏感性高，能够快速显色；而对正常组织细胞，不显色。本发明染色剂，操作简便，检查时间短。另外，亚甲基蓝和/或二氯酚靛酚都作为临床上广泛使用的试剂，具有安全、有效、价格低廉并且容易获得，抗坏血酸、叶酸等都是临床广泛应用的药物，使本组合物安全、可靠、无毒副作用，从而使本方法利于推广。

本发明提供了一种肿瘤细胞染色剂组合物，所述组合物包含以下组分（按重量百分比计）：显色剂，0.01-5%；叶酸≤6.5%；隐色剂，0.1-10%；pH调节剂≤10%；水，3-95%。

本发明所述的用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物的实施方案中，其显色剂为亚甲基蓝、二氯酚靛酚、二氯酚靛酚钠之种或其组合物，其中其用量为0.01-5%，优选0.05-1.0%；肿瘤细胞靶向药物为叶酸，其含量为0-6.5%，优选0-1.2%。

本发明所述的用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物的实施方案中，其隐色剂为还原性物质，包括抗坏血酸、锌粉、辛酸亚锡之一种或多种，优选抗坏血酸。

本发明所述的用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物的实施方案中，其隐色剂用量为0.1-10%，优选2-3%。pH调节剂选用甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、丁二酸、酒石酸、硼酸之一种，优选为乙酸、乳酸优选3-6%。

本发明所述的用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物的实施方案中，其制备过程包括以下步骤：

（a）将叶酸、显色剂加入去离子水中搅拌溶解，

（b）向该溶液中加入隐色剂，搅拌反应一段时间，

（c）加入pH调节剂，调节体系pH值，并搅拌反应一段时间。

上述步骤都是在常温常压下进行的。

所述用于肿瘤细胞染色的染色剂，也可用于肿瘤细胞的检测，所述检测载体为任选载体包括脱脂棉签、微囊、纤维膜、滤纸。

本发明还涉及一种肿瘤细胞染色的方法，所述方法包括以下步骤：（a）将本发明的活细胞染色剂由载体施用于受试者的组织细胞表面；（b）观察载体上的颜色变化；（c）根据颜色变化决定所测试的组织细胞区域中是否产生病变。

具体实施方式

实施例1

将医用级别叶酸溶解于含水溶剂中，加入显色剂亚甲基蓝搅拌溶解，加入还原剂抗坏血酸，搅拌1小时，加入分析纯乙酸，搅拌混合，制成染色剂组合物。将检测剂组合物用大棉签蘸取，均匀涂抹于组织表面，观察棉签颜色以及组织颜色变化。

实施例2

将医用级别叶酸溶解于含水溶剂中，加入显色剂亚甲基蓝搅拌溶解，加入还原剂锌粉，搅拌1小时，加入分析纯乙酸，搅拌混合，制成染色剂组合物。将检测剂组合物用大棉签蘸取，均匀涂抹于组织表面，观察棉签颜色以及组织颜色变化。

实施例3

按照表1指定的各组分百分含量重复实施例1的方法，制成染色剂组合物。将检测剂组合物用大棉签蘸取，均匀涂抹于组织表面，观察棉签颜色以及组织颜色变化。

实施例4

按照表1指定的各组分百分含量重复实施例1的方法，选用二氯酚靛酚为显色剂，制成染色剂组合物。实施例5

按照表1指定的各组分百分含量重复实施例4的方法，还原剂选用锌粉，制成染色剂组合物。

实施例6

按照表1指定的各组分百分含量重复实施例4的方法，pH调节剂选用乳酸，制成染色剂组合物。

表1

本发明中，用灵敏度说明染色剂对肿瘤细胞染色，灵敏度越高，发现异常细胞的能力越强；用特异度说明染色剂的准确性，特异度越高，表明染色的异常细胞与病理学检测结果符合率高。灵敏度和特异度计算：

灵敏度=真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100%

特异度=真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100% 。

Claims

1.一种用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物，其特征在于，所述组合物按重量百分比计包含以下组分：显色剂，0.01-5%；叶酸≤6.5%；隐色剂，0.1-10%；pH调节剂≤10%；水，3-95%；

其中，显色剂为亚甲基蓝、二氯酚靛酚、二氯酚靛酚钠之一种或其组合物；

其中，隐色剂为锌粉、辛酸亚锡之一种或多种；

其中，pH调节剂包括甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、丁二酸、酒石酸、硼酸之一种。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物，其特征在于， pH调节剂为乙酸或乳酸。

3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物，其特征在于，显色剂用量0.05-1.0%；叶酸的含量为≤1.2%；隐色剂用量为2-3%；pH调节剂用量3-6%。

4.按照权利要求1-3任一项所述的用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物的制备方法，其特征在于，制备过程包括以下步骤：

（a）将叶酸、显色剂加入去离子水中搅拌溶解，

（b）向该溶液中加入隐色剂，搅拌反应，

（c）加入pH调节剂，调节体系pH值，搅拌反应；

上述步骤都是在常温常压下进行的。

5.权利要求1-3任一项所述的一种用于肿瘤组织细胞的染色剂组合物的用途，用于肿瘤细胞的检测或染色，检测载体包括脱脂棉签、微囊、纤维膜、滤纸。