CN104949946A - 一种荧光探针在过氧化氢分子检测中的应用 - Google Patents

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本发明公开了一种荧光探针在过氧化氢分子检测中的应用，所述荧光探针用于水环境和细胞溶酶体中过氧化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。本发明实现了H2O2分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。此探针可以应用于检测细胞内溶酶体中的过氧化氢的检测，通过与商业化溶酶体染料进行比较其对溶酶体内过氧化氢成像的重合率高，两种染料的共定位系数为0.94。

Description

一种荧光探针在过氧化氢分子检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种荧光探针在过氧化氢分子检测中的应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
活性氧（ROS）是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧自由基（羟基自由基和超氧阴离子自由基等）和非自由基（过氧化氢和次氯酸等）的总称。生物体内在氧化应激、炎症等生理和病理情况下通过酶促和非酶促反应产生各种ROS。近代的生物医学研究表明，体内产生的ROS与一些疾病的发生、发展和机体的老化有着密切的关系。过氧化氢（H2O2）作为信号分子参与各种各样的信号传导过程，也是氧化应激等相关疾病的标记物，抵抗病原物的侵害，以及介导细胞死亡等。在细胞内，细胞因子，生长因子和神经递质等激活白细胞氧化酶（NADPH氧化酶），催化细胞周围环境中的氧生成H2O2。体内适量水平的H2O2对生物正常的生理过程是有益的，它们参与细胞内蛋白质的可逆氧化，调节蛋白质的磷酸化到基因表达等细胞过程。然而，体内H2O2浓度的异常变化也与人类的许多疾病密切相关，例如癌症，糖尿病，心血管疾病和神经系统性疾病。因此，检测生物体系中H2O2的产生与动态变化对于调查研究相关疾病的发生、发展与研究H2O2的功能是非常重要的。
然而目前对H2O2 的检测缺少靶向性，不能对细胞内某一特定的细胞器内的过氧化氢进行检测，特别缺少对细胞内溶酶体靶向的过氧化氢探针，从而缺少研究细胞病变过程中对溶酶体中过氧化氢浓度变化情况的检测工具。
发明内容
针对目前过氧化氢分子荧光探针检测所面临的问题现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快以及溶酶体靶向性的过氧化氢分子荧光探针，简记为Lys- H2O2，可以检测细胞溶酶体中的过氧化氢，与商业化溶酶体红进行共定位实验其共定位系数为0.94。
本发明采用以下技术方案：
一种如式Ⅰ所示的荧光探针在过氧化氢分子检测中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于水环境和细胞溶酶体中过氧化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测；
                                                   。
上述过氧化氢分子荧光探针的合成路线如下：
上述过氧化氢分子荧光探针的制备方法如下：
1）将1eq的 4-溴-1,8-萘二甲酸酐与 1eq的N-(2-氨基乙基)吗啉溶于乙醇中，氮气保护，100℃加热回流，反应5h，用TCL板检测反应，反应完全后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，并用硅胶柱进行分离，得到化合物1，其结构式如下：
 ；
2）将1eq化合物1，1.5eq联硼酸频哪醇酯与3eq乙酸钾溶于1,4-二氧六环中，再加入0.1eq的双（二苯基磷基）二茂铁氯化钯，氮气保护，加热回流，反应10 h，用TCL板检测反应，反应完全后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，并用硅胶柱进行分离，得到目标探针化合物Lys-H2O2。
所述步骤1）中硅胶柱分离洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷=1:40。
所述步骤2）中硅胶柱分离洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚=1:1。
本发明的优点：（1）本发明实现了H2O2分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。(2) 此探针可以应用于检测细胞内溶酶体中的过氧化氢的检测，通过与商业化溶酶体染料进行比较其对溶酶体内过氧化氢成像的重合率高，两种染料的共定位系数为0.94，说明此探针可以作为细胞内溶酶体内过氧化氢检测探针。基于此探针的特异性且显著的颜色变化，该试剂也可作为显示水溶液中过氧化氢分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的过氧化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中探针Lys-H2O2的1H NMR图谱；
图2是探针Lys-H2O2随过氧化氢的加入荧光谱图的变化情况；
图3是探针Lys-H2O2对不同离子和分子的选择性荧光谱图；
图4是探针Lys-H2O2对不同离子和分子的选择性柱状图数据，其中1. 空白; 2. 谷胱甘肽; 3.过氧叔丁醇; 4. 过氧叔丁醚; 5. MnO4 -; 6. S2-; 7. NH2NH2; 8. NH3; 9. SO3 2-; 10. SO4 2-；
图5是探针Lys-H2O2溶液在过氧化氢加入前后溶液颜色的变化图；
图6是探针Lys-H2O2溶液在过氧化氢加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化图；
图7是探针Lys-H2O2检测外源性过氧化氢荧光成像图，图中a）过氧化氢加入前荧光成像图，b) 探针浓度为5μM加入到SiHa细胞中培养30min后明场图，c）过氧化氢  20μM加入后5 min 后的绿通道荧光成像图，d)明场与荧光成像图重合图片；
图8是Lys-H2O2荧光探针检测外源性过氧化氢荧光成像图与商业化染料溶酶体红的共定位成像图，图中a) 探针浓度为5μM与溶酶体红加入到SiHa细胞中培养30min后明场图， b)加入双氧水后绿通道荧光成像图， c) 商业染料溶酶体红荧光成像图，d）明场、绿通道与红通道叠加图，e) 绿通道与红通道叠加图， f) 绿通道与红通道叠加箭头部分荧光强度比较， g) 绿通道与红通道叠加画圈部分强度散点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
1）化合物1的合成：
将4-溴-1,8-萘二甲酸酐（2.77g，10mmol，1eq）与 N-(2-氨基乙基)吗啉 (1.3mg，10mmol，1eq)溶于50mL乙醇中，氮气保护，100℃加热回流，反应5 h。用TCL板检测反应，反应完全后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:40，产率为80%。
2）化合物Lys-H2O2的合成：
将化合物1（500mg，1.29 mmol，1eq），联硼酸频哪醇酯（688 mg，1.93 mmol, 1.5 eq）与乙酸钾（378 mg，3.86 mmol, 3 eq）溶于20 mL 1,4-二氧六环中，再加入双（二苯基磷基）二茂铁氯化钯（94.4 mg，0.013 mmol, 0.1eq），氮气保护，加热回流，反应10 h，用TCL板检测反应，反应完全后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:1，产率为76%。其核磁谱图如图1所示。1H-NMR (400MHz, DMSO) δ 9.15 (dd, J = 8.5, 1.0 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.81 (dd, J = 8.4, 7.4 Hz, 1H), 4.38 (s, 2H), 3.71 (s, 4H), 2.69 (d, J = 43.0 Hz, 6H), 1.47 (s, 11H).
实施例2
化合物Lys-H2O2过氧化氢荧光探针随过氧化氢加入当量的增加荧光谱图的变化
取实施例1制备的Lys-H2O2过氧化氢荧光探针溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，制成1mmol/L 储备液。从储备液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，加入不同当量（0-80 eq）的过氧化氢标准溶液，用PBS缓冲溶液（0.1mol/L，pH=7.5）与DMF体积比为1:1的溶液稀释至3 mL，测量其荧光性质。，以410 nm 为激发光，荧光光谱如图2 所示。由图2可见，随着过氧化氢加入当量的增加荧光逐渐增强。
实施例3
化合物Lys-H2O2过氧化氢荧光探针对不同分子或离子的选择性
从实施例2 中荧光探针储备液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的过氧化氢标准溶液，30min 后以410 nm 为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，由图3 和图4 可以发现，其他金属离子对化合物Lys-H2O2的荧光几乎没有影响，而过氧化氢溶液的加入使化合物Lys-H2O2的荧光显著增强。
实施例4
化合物Lys-H2O2荧光探针对过氧化氢的可视化检测
从实施例2 中荧光探针储备液中取出30μL 加入到5mL 的样品管当中，加入80摩尔量的过氧化氢标准溶液，如图5所示，过氧化氢可以使合物Lys-H2O2荧光探针的PBS：DMF体积比为1:1的缓冲溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成黄色。伴随着紫外灯下肉眼可视的过氧化氢诱导荧光探针发出明亮的黄色荧光（图6），说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。
实施例5
化合物Lys-H2O2过氧化氢荧光探针对细胞外源性过氧化氢荧光成像
我们将本发明探针用于SiHa细胞中对外源性的过氧化氢进行荧光成像应用（图7）。具体操作步骤如下：将5μM Lys-H2O2过氧化氢探针DMF溶液加入到育有SiHa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30 min后用共聚焦显微镜进行成像。首先进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓。然后用蓝光进行激发观察在未加入过氧化氢前的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射。向体系中加入20μM的过氧化氢水溶液后，等待5min后在用蓝光进行激发可以观察到有绿光发出，说明此荧光探针可以对外源性的过氧化氢进行荧光成像。
实施例6
化合物Lys-H2O2过氧化氢荧光探针对细胞外源性过氧化氢荧光成像与商业溶酶体染料共定位比较
我们将本发明探针应用于SiHa细胞中与商业化的溶酶体染料进行共定位实验，说明本探针可以定位到溶酶体中，并对溶酶体内的外源性的过氧化氢进行荧光成像应用（图8）。具体操作步骤如下：将5μM Lys-H2O2过氧化氢探针DMF溶液和商业化溶酶体染料-溶酶体红5μM加入到育有SiHa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30 min后，向体系中加入20μM的过氧化氢水溶液后，再等待10 min后用共聚焦显微镜进行成像，此时用蓝光（Ex=488 nm）进行激发可以观察到有绿光发出，此为Lys-H2O2过氧化氢探针与过氧化氢响应后发射的光，用绿光（Ex=561 nm）进行激发可以观察到有绿光发出，此为商业化染料溶酶体红发出的红光，用软件进行处理可以得出两种染料的共定位系数为0.94。

Claims (1)

1.一种如式Ⅰ所示的荧光探针在过氧化氢分子检测中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于水环境和细胞溶酶体中过氧化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测；
。
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