CN105924427A

CN105924427A - 一种具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针及应用

Info

Publication number: CN105924427A
Application number: CN201610322293.4A
Authority: CN
Inventors: 徐健; 邵士俊; 梁卿; 刘红
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-09-07

Abstract

本发明公开了一种具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针。本发明将甲基苯硼酸频哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶作为催化剂，氩气保护下室温反应，然后减压除去溶剂，将剩余的物料进行柱色谱分离，收集洗脱液，除去洗脱剂得红色固体即为具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针。本发明所述探针结构简单，易于分离与纯化，对过氧化氢的检测具有操作简便、选择性好、灵敏度高、检测限低等特点，可以用于体外过氧化氢的检测、活体细胞线粒体内外源和内生过氧化氢的检测以及细胞线粒体的荧光定位分析。

Description

一种具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针及应用

技术领域

本发明涉及一种具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针及其在体外过氧化氢的检测、活体细胞线粒体内外源和内生过氧化氢的检测以及细胞线粒体的荧光定位分析中的应用。

背景技术

线粒体是一种广泛存在于动物和植物细胞中的亚细胞器，是细胞有氧呼吸和制造能量的主要场所。过氧化氢（H₂O₂）是一种重要活性氧类物质（ROS），主要产生于细胞线粒体有氧呼吸电子传递链，参与了生物体内氧化还原和信号转导过程。过氧化氢可以激活 NF-kappaB等因子（调节炎症反应重要的转录因子），这些信号途径与哮喘、炎症性关节炎、动脉硬化以及神经退行性疾病等许多疾病相关。过氧化氢在细胞内过量积聚会引起生物体代谢紊乱，导致一系列人类疾病，如癌症，糖尿病，帕金森症等。同时，过氧化氢和细胞凋亡、细胞增殖等密切相关。因此发展高选择性、高灵敏度、具有生物兼容性的过氧化氢检测与分析技术对于相关疾病的研究具有十分重要的意义。

过氧化氢的检测主要包括荧光法、光度法、电化学法及化学发光法等。其中，荧光法具有非侵入性、高灵敏性和高信号特异性的特点，与激光扫描共聚焦显微镜技术结合为过氧化氢的检测和活体示踪开辟了一条新的途径。近年来用于检测过氧化氢的荧光探针主要有: (1) 基于过氧化氢的氧化作用而设计的探针，如二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFDA)、二氢罗丹明123等；(2) 基于过氧化氢水解切断荧光团的保护基团，使荧光团荧光恢复的探针，如单五氟苯磺酸酯二氟荧光素、二硼酸酯基荧光素等。然而，部分探针存在易光漂白、发射波长短、选择性差以及生物相容性差等问题，尤其能够精准定位于细胞线粒体，实现对过氧化氢特异性检测的荧光探针还十分匮乏。因此，发展新型用于过氧化氢检测的高选择性、高灵敏度荧光探针以及对生物活性物质的实时-动态-可视化的成像技术在生物、医疗、临床诊断等诸多领域有着广泛的应用前景。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的就是提供一种用于过氧化氢及生物活性氧类物质检测与成像分析的具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针。

本发明将甲基苯硼酸频哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶作为催化剂，氩气保护下室温反应，然后减压除去溶剂，将剩余的物料进行柱色谱分离，收集洗脱液，除去洗脱剂得红色固体即为具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针。

本发明所述的探针结构简单，易于分离与纯化，对过氧化氢的检测具有操作简便、选择性好、灵敏度高、检测限低等特点。由于良好的生物相容性，探针可用于活体细胞线粒体内外源和内生过氧化氢的快速、高灵敏、特异性检测与荧光成像分析。

一种具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针，其特征在于该探针通过以下方法制备得到：

将甲基苯硼酸频哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶（作为催化剂），氩气保护下室温反应1～2 h，然后减压除去溶剂，将剩余的物料进行柱色谱分离，收集洗脱液，除去洗脱剂得红色固体，即为具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针。

所述甲基苯硼酸频哪酯基喹啉、咔唑醛和哌啶的用量比为1.00 mmol：1.00 mmol：0.05 mL。

所述柱色谱分离的条件：体积比为20:1～5:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，100～300目硅胶为固定相。

上述具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针，细胞渗透性好，细胞毒性低，可以用于体外过氧化氢的检测、活体细胞线粒体内外源和内生过氧化氢的检测以及细胞线粒体的荧光定位分析。具体应用时，方法如下：

一种利用具有线粒体靶向功能的荧光探针检测体外过氧化氢的方法：将探针加入含有质量百分数为0.5 %～1.5 %的DMSO溶液的待检测物中，反应5～20 min，进行荧光检测及成像；若检测出荧光，则表明待检测物中具有过氧化氢，若未检测到荧光，则表明待检测物中不具有过氧化氢。优选的，所述加入的探针的浓度为5～15 μM，检测过氧化氢的浓度范围为0.2～10 μM。

一种利用具有线粒体靶向功能的荧光探针检测细胞外源过氧化氢的方法：首先在待检测细胞的培养液中加入探针，在37 °C生物摇床中培养孵育20～40 min，然后加入过氧化氢继续培养60～120 min，进行荧光检测及成像；若检测出荧光，则表明待检测细胞内具有外源过氧化氢，若未检测到荧光，则表明待检测细胞内不具有外源过氧化氢。所述探针的浓度为2～10 μM。

进一步地，还可设置阳性对照，以过氧化氢组作为阳性对照。

所述待检测细胞可以是各种病变细胞（比如人宫颈癌细胞，肝癌细胞），也可以是正常细胞（可以作为阴性对照）。

一种利用具有线粒体靶向功能的荧光探针检测细胞内生过氧化氢的方法：首先在待检测细胞的培养液中加入探针，在37 °C生物摇床中培养孵育20～40 min，然后用佛波醇乙酯（PMA）对细胞进行刺激，进行荧光检测及成像；若检测出荧光，则表明待检测细胞内具有内生过氧化氢，若未检测到荧光，则表明待检测细胞内不具有内生过氧化氢。所述探针的浓度为2～10 μM。

所述用佛波醇乙酯刺激待检测细胞的具体方式为：1 µg/mL佛波醇乙酯培养孵育待检测细胞60～120 min。佛波醇乙酯是活性氧自由基诱导剂，会导致活性氧的过量产生，由于佛波醇乙酯的细胞毒性大，低浓度的即可引起细胞凋亡等异常现象，优选1 µg/mL佛波醇乙酯对细胞处理未发现细胞形态异常变化及细胞凋亡等现象。

一种利用具有线粒体靶向功能的荧光探针定位细胞线粒体的方法：在待检测细胞的培养液中同时加入探针和线粒体深红色荧光探针（Mito Tracker Deep Red），在37 °C生物摇床中培养孵育20～40 min，进行荧光检测及成像；在荧光显微镜下观察，若488 nm 波长激发下细胞的绿色荧光图像与638 nm 波长激发下细胞的红色荧光图像相似度大于95%，则表明该荧光探针具有细胞线粒体定位功能。所述探针的浓度为2～10 μM，线粒体深红色荧光探针浓度为50 nM。

细胞线粒体定位的原理为：线粒体深红色荧光探针是一种商业化的远红外荧光染料（吸收波长/发射波长为 640/662 nm），用于对活细胞线粒体进行染色。在共染实验中，若本发明所合成的荧光探针与线粒体深红色荧光探针具有相似的荧光染色效果，则表明本发明所合成的荧光探针就有细胞线粒体定位功能，可用于活细胞线粒体的荧光染色。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1．合成路线简单，反应产物易分离纯化。

2．所制备化合物细胞渗透性好，细胞毒性低。

3．可用于细胞线粒体的荧光标记与染色。

4. 可用于细胞外源、内生过氧化氢的高灵敏、特异性检测与荧光成像分析。

附图说明

图1：A为探针与过氧化氢反应前后的紫外吸收图，其中1为探针的紫外吸收图，2为探针与过氧化氢反应后的紫外吸收图；B为探针与过氧化氢反应前后的荧光发射图，其中1为探针的荧光发射图，2为探针与过氧化氢反应后的荧光发射图。反应条件：探针5 μM，过氧化氢50 μM，DMSO 1%，反应5 min。

图2：A为探针与过氧化氢反应体系荧光强度随时间变化图，反应条件：探针5 μM，过氧化氢50 μM，DMSO 1%，反应时间0～10 min；B为探针与过氧化氢反应体系荧光强度随加入过氧化氢浓度变化图，反应条件：探针5 μM，过氧化氢0～10 μM，DMSO 1%，反应时间5min。

图3：人宫颈癌细胞外源、内生过氧化氢的检测和探针的线粒体染色。A、F为人宫颈癌细胞加入10 μM探针培养30 min后成像；B为探针孵育的细胞继续加入100 μM过氧化氢培养90 min后成像；G为探针孵育的细胞继续加入1 µg/mL佛波醇乙酯培养90 min后成像；C和H为探针孵育的细胞加入50 nM线粒体深红色荧光探针90 min后成像；D为B和C的叠加图；I为G和H的叠加图；E和J分别为相应明场成像图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例 1 具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针的合成

依次包括以下3个步骤：

1、将甲基苯硼酸频哪酯基喹啉 (1.00 mmol) 和等量咔唑醛加入到反应溶剂20 mL乙醇中，加入哌啶 (0.05 mL) 作为催化剂，氩气保护下室温反应1 h；

2、上述反应结束后，在减压下旋转蒸发除去溶剂，加热温度低于50 °C。

3、以二氯甲烷/甲醇=10/1（v/v）为洗脱剂，200目硅胶为固定相，进行柱色谱分离。收集洗脱液，溶剂旋干，得红色固体。

实施例 2 体外过氧化氢的检测实验

体外对过氧化氢的检测原理主要是基于探针与过氧化氢的专一性反应：探针由于自身分子内电荷转移作用荧光淬灭。当探针与过氧化氢作用，探针分子被氧化，分子内发生重排、消去反应，得到的反应产物具有很强的荧光，从而导致反应体系荧光恢复达到检测的目的。在过氧化氢检测试剂中，探针的浓度为5 μM，过氧化氢浓度为0.2～10 μM。并且探针在含有浓度为1 %（质量百分数）的DMSO溶液的检测体系中对于过氧化氢具有良好的选择性。

体外过氧化氢检测结果见附图1、附图2及附图说明。探针自身的紫外吸收峰在490nm，相应的溶液颜色为浅红色。当探针与过氧化氢反应后，反应体系的紫外吸收峰在376nm，溶液颜色变为无色（如图1A所示）。因此，本发明可通过比色法和肉眼观测的方法实现对体外过氧化氢的检测，检测方法简单易行，灵敏度高。同时，探针在与过氧化氢反应前荧光强度很弱，而与过氧化氢反应后527 nm处荧光强度明显增强（如图1B所示）。在365 nm 紫外灯照射下，反应后溶液呈现明显的黄绿色荧光。探针对过氧化氢的检测，反应时间较短，在5分钟内反应达到平衡（如图2A所示），有利于复杂体系中对过氧化氢的快速检测。探针对过氧化氢的检测，线性范围较宽（0.2～10 μM），检测限较低达到0.04 µM（如图2B所示）。该结果说明，探针对过氧化氢的检测具有较高的灵敏度，适用于体外微量过氧化氢检测。

实施例 3 细胞内过氧化氢的检测实验

主要通过两种方式对细胞内过氧化氢进行检测，一种是外加过氧化氢培养细胞，一种是用佛波醇乙酯刺激待检测细胞产生内生过氧化氢的方式。在细胞外源过氧化氢检测试剂中，在细胞培养液中首先加入10 μM探针孵育30 min，然后加入过氧化氢继续培养90 min，进行荧光检测及成像。在细胞内生过氧化氢检测试剂中，在细胞培养液中首先加入10 μM探针孵育30 min，然后加入1 µg/mL佛波醇乙酯继续培养90 min，进行荧光检测及成像。

细胞内过氧化氢检测结果见附图3和附图说明。如图3A和图3F所示，用探针孵育的细胞有微弱荧光，说明细胞内过氧化氢含量较低，不足以与探针反应。而在探针孵育的细胞中继续加入适量过氧化氢后，细胞呈现显著黄绿色荧光（如图3B所示），说明探针在细胞内与外源过氧化氢反应生成强荧光物质，探针可在细胞内检测外源性过氧化氢。如图3G所示，当在探针孵育的细胞中加入适量佛波醇乙酯培养，细胞的荧光强度明显增强，这主要是由于佛波醇乙酯能刺激细胞的氧化呼吸代谢，产生大量的活性氧类物质包括过氧化氢，细胞内生性的过氧化氢与探针反应生成强荧光物质。该实验证明探针对细胞内生性过氧化氢的检测具有很好的效果。同时如图3E和图3J所示，细胞明场实验表明细胞在用探针孵育和对过氧化氢检测的过程中始终保持良好的细胞形态，说明该探针具有较好的生物相容性和较低的细胞毒性。

实施例 4 细胞线粒体的荧光染色和定位实验

细胞线粒体的荧光染色和定位实验主要采取共染的方式确定探针的线粒体靶向功能。具体方法如下：在细胞的培养液中加入10 μM探针和50 nM线粒体深红色荧光探针，37 °C生物摇床中培养孵育30 min，进行荧光检测及成像。

细胞内线粒体荧光染色和定位结果见附图3和附图说明。如图3B和图3C所示，当用该发明合成探针和商品化线粒体深红色荧光探针同时孵育细胞而后加入外源过氧化氢时，488 nm 波长激发下细胞呈现的绿色荧光为合成探针染色的结果，638 nm 波长激发下细胞呈现的红色荧光为线粒体深红色荧光探针染色的结果。将两图叠加（如图3D所示），我们发现在细胞内两种探针染色和定位的区域基本一致，相似度大于95 %，结果表明该发明合成探针具有细胞线粒体染色和定位功能。如图3G和图3H所示，当用该发明合成探针和商品化线粒体深红色荧光探针同时孵育细胞而后加入佛波醇乙酯刺激细胞产生内生过氧化氢时，488 nm 波长激发的绿色荧光图与638 nm 波长激发的红色荧光图基本重合，结果同样表明该发明合成探针具有细胞线粒体染色和定位功能。

Claims

1.一种具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针，其特征在于该探针通过以下方法制备得到：

将甲基苯硼酸频哪酯基喹啉和咔唑醛加入到乙醇中，加入哌啶，氩气保护下室温反应1～2 h，然后减压除去溶剂，将剩余的物料进行柱色谱分离，收集洗脱液，除去洗脱剂得红色固体，即为具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针。

2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于所述甲基苯硼酸频哪酯基喹啉、咔唑醛和哌啶的用量比为1.00 mmol：1.00 mmol：0.05 mL。

3.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于所述柱色谱分离的条件：体积比为20:1～5:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，100～300目硅胶为固定相。

4.如权利要求1至3中任一项所述具有线粒体靶向功能的过氧化氢荧光探针在体外过氧化氢的检测、活体细胞线粒体内外源和内生过氧化氢的检测以及细胞线粒体的荧光定位分析中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于利用具有线粒体靶向功能的荧光探针检测体外过氧化氢的方法：将探针加入含有质量百分数为0.5 %～1.5 %的DMSO溶液的待检测物中，反应5～20 min，进行荧光检测及成像；若检测出荧光，则表明待检测物中具有过氧化氢，若未检测到荧光，则表明待检测物中不具有过氧化氢。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述加入的探针的浓度为5～15 μM，检测过氧化氢的浓度范围为0.2～10 μM。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于利用具有线粒体靶向功能的荧光探针检测细胞外源过氧化氢的方法：首先在待检测细胞的培养液中加入探针，在37 °C生物摇床中培养孵育20～40 min，然后加入过氧化氢继续培养60～120 min，进行荧光检测及成像；若检测出荧光，则表明待检测细胞内具有外源过氧化氢，若未检测到荧光，则表明待检测细胞内不具有外源过氧化氢。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于利用具有线粒体靶向功能的荧光探针检测细胞内生过氧化氢的方法：首先在待检测细胞的培养液中加入探针，在37 °C生物摇床中培养孵育20～40 min，然后用佛波醇乙酯对细胞进行刺激，进行荧光检测及成像；若检测出荧光，则表明待检测细胞内具有内生过氧化氢，若未检测到荧光，则表明待检测细胞内不具有内生过氧化氢。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述用佛波醇乙酯刺激待检测细胞的具体方式为：1 µg/mL佛波醇乙酯培养孵育待检测细胞60～120 min。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于利用具有线粒体靶向功能的荧光探针定位细胞线粒体的方法：在待检测细胞的培养液中同时加入探针和线粒体深红色荧光探针，在37°C生物摇床中培养孵育20～40 min，进行荧光检测及成像；在荧光显微镜下观察，若488 nm波长激发下细胞的绿色荧光图像与638 nm 波长激发下细胞的红色荧光图像相似度大于95%，则表明该荧光探针具有细胞线粒体定位功能。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述线粒体深红色荧光探针的浓度为50nM。

12.如权利要求7、8或10所述的应用，其特征在于所述探针的浓度为2～10 μM。