CN109897625A - 选择性检测半胱氨酸荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种选择性检测半胱氨酸荧光探针、合成方法及应用。所述的荧光探针以对羟基萘醛为原料，经三步反应得到，具有反应原料廉价易得，反应步骤少，产率高等特点。经紫外可见光谱吸收和荧光光谱表明荧光探针对半胱氨酸具有良好的选择性和灵敏性；且成功用于宫颈癌Hela细胞成像实验，可潜在应用宫颈癌细胞中半胱氨酸的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种选择性检测半胱氨酸探针、合成方法及其应用。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(HCY)等生物硫醇在人体的许多重要细胞中起着关键作用。它们的异常水平可以和许多疾病或癌症密切相关。据报道，人体内半胱氨酸缺乏可以导致生长缓慢、皮肤损伤和虚弱、肌肉和脂肪的丧失、毛发色素脱失、水肿、代谢紊乱等。动脉粥样硬化和冠心病患者血液内同型半胱氨酸的含量明显升高。而人体内谷胱甘肽水平异常，又会和肝损伤、神经变性疾病、白细胞丢失、银屑病和癌症相关。因此，对于生物分子硫醇的检测始终吸引着科学家们极大的兴趣。
目前为止，研究人员基于不同的机理已设计出多种检测生物硫醇的荧光探针，如迈克尔加成反应、硫双键断裂等。但这些荧光探针合成相对复杂，需要极大的成本，且硫醇分子间的相似性，将他们区分开来仍然是个难题。因此，通过较少的合成步骤，较低的成本制备新型具有特异性检测半胱氨酸的荧光探针具有重要的社会价值和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种选择性检测半胱氨酸荧光探针及其制备方法。
本发明的另一目的是将这一种荧光探针应用于宫颈癌Hela细胞中半胱氨酸的检测。
实现本发明的技术解决方案是：一种选择性检测半胱氨酸荧光探针，所述荧光探针具有如下化学结构：
一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：将化合物3和对羟基萘醛发生羟醛缩合反应制备化合物2的步骤，
步骤2：将化合物2和丙烯酰氯发生酯化反应制备目标探针的步骤，
进一步的，步骤1中，反应体系的溶剂采用乙醇。
进一步的，步骤1中，反应在催化剂哌啶存在下进行，哌啶与化合物3的摩尔比为量为1:1。
进一步的，步骤1中，反应温度为40-100℃。
进一步的，步骤2中，反应体系的溶剂采用二氯甲烷。
进一步的，步骤2中，反应在三乙胺存在下进行，三乙胺与化合物2的摩尔比为2:1
进一步的，步骤2中，反应温度为0℃-50℃。
一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的应用，将上述制备的荧光探针用于宫颈癌Hela细胞中半胱氨酸的检测。
本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)该荧光化合物简单易得，成本较低。(2)该荧光化合物和半胱氨酸反应前后变化迅速，荧光稳定，适用于体系内的半胱氨酸的即时荧光检测。(3)该荧光化合物可简单进入活细胞中，特异性与细胞中的半胱氨酸反应，导致探针的荧光强度显著增加，可应用于活细胞中半胱氨酸的测定(4)该荧光化合物的荧光团斯托克位移为145nm。
附图说明
图1为荧光探针中不加入(左边)和加入(右边)Cys的荧光变化图片。
图2为荧光探针和半胱氨酸反应前后紫外(a)和荧光(b)光谱图。
图3为荧光探针和半胱氨酸的动力学分析曲线图。
图4为荧光探针的抗干扰能力测试图。
图5为荧光探针与宫颈癌细胞HeLa细胞毒性实验效果图。
图6为探针(A-C)和探针+NEM(D-F)和探针+NEM+Cys(G-I)与宫颈癌细胞HeLa细胞成像分析图像。
具体实施方式
以下提供本发明一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成及其在癌细胞成像上的应用测试。需要指出的是，本发明的方法和应用通过较佳的实施实例进行了描述，但所有对工艺参数的类似替换和改动，都被视为包括在本发明。
本发明所述的选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：将步骤1中得到的淡黄色固体1溶解在乙醇中，加入对羟基苯甲醛，哌啶，加热回流，TLC板跟踪反应至原料消失；除去溶剂，乙醇重结晶，得红色固体2。反应方程式如下：
步骤2：将红色固体2和三乙胺溶于二氯甲烷中，缓慢滴入丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，搅拌，TLC板跟踪反应至原料消失，；除去溶剂，柱层析，得荧光探针
实施例1
化合物2的制备
将1.86g化合物3和1.72g 6-羟基-2-萘甲醛溶于40mL乙醇中，滴加5滴哌啶。氮气保护下加热回流，TLC显示反应完全。降至室温，红色沉淀析出，抽滤得化合物2(2.93g，86％)
1H NMR(500MHz,DMSO)δ10.02(s,1H),8.01(s,1H),7.77(ddd,J＝44.9,22.4,5.1Hz,3H),7.39(q,J＝16.1Hz,2H),7.21–7.04(m,2H),6.86(s,1H),3.37(s,2H),2.56(s,2H),2.53(s,2H),1.01(s,6H).
13C NMR(126MHz,DMSO)δ＝169.63,155.87,137.64,134.80,129.85,127.43,123.72(s),121.69(s),118.73,113.06,108.55,75.11,41.74,37.64,31.10,26.92.
HRMS[M+H]+:calcd for C23H20N2O340.1576,Found 341.1648.
实施例2
荧光探针制备
将0.34g化合物2和0.5mL三乙胺溶于20mL二氯甲烷中，冰水浴下，加入0.27g丙烯酰氯的二氯甲烷溶液10mL,继续反应1h，转移至室温反应2h。有机层经水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，旋蒸，柱层析得荧光探针0.24g，产率61％。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.15(s,1H),7.92(dt,J＝12.6,8.9Hz,3H),7.71(d,J＝2.1Hz,1H),7.51(d,J＝16.1Hz,1H),7.45–7.33(m,2H),6.89(s,1H),6.56(dd,J＝17.3,1.0Hz,1H),6.43(dd,J＝17.3,10.3Hz,1H),6.16(dd,J＝10.3,1.0Hz,1H),2.56(d,J＝18.2Hz,4H),0.99(s,7H).
13C NMR(126MHz,DMSO)δ＝169.74(s),163.74(s),155.16(s),148.23(s),136.76(s),134.17–132.11,130.59,129.52,128.75–126.69,124.29,122.51,121.68,118.14,112.91,76.02,41.77,37.66,31.16,26.93.
HRMS[M+H]+:calcd for C26H22N2O2 394.1681,Found 395.1754.
实施例3
荧光探针和半胱氨酸反应前后紫外、荧光光谱图，荧光探针和半胱氨酸的动力学分析。
将50μM的Cys滴加10μM的荧光探针的PBS/DMSO(V:V＝4:6)溶液中，5min后，测定紫外和荧光强度变化。结果可参见图1和图2，所有的紫外和荧光强度均进行了归一法。
如图1所示，荧光探针溶液中不加入(左边)和加入(右边)Cys后的荧光变化图片。左边为不加Cys的荧光探针溶液，右边为加入Cys的荧光探针溶液。荧光发生明显的变化，由黄色变为橙色。
如图2所示荧光探针溶液在加入Cys前后的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的变化(445nm激发，pH＝7.4缓冲液,37℃)。可以发现，在加入Cys后，紫外光谱的最大吸收峰出现明显的红移，由410nm红移至445nm。而荧光显示在590nm处出现了一个新的吸收峰，说明Cys将底物切断，释放出荧光团。
如图3所示，荧光溶液中加入Cys荧光发射光谱随时间变化(400s，445nm，pH＝7.4缓冲液,37℃)；荧光探针溶液中加入Cys后，荧光发射光谱随时间的变化在300s内基本完成。
实施例4
在10μM的荧光探针的PBS/DMSO(V:V＝4:6)溶液中分别加入500μM的1.Al3+,2.Cu2 +,3.Fe3+,4.NO3 -,5.NO2 -,6.SO4 2-,7.SO3 2-,8.S2O3 2-,9.F-,10.Cl-,11.Leu,12.Tyr,13.Arg,14.Glu,15.Lys,16.Thr,17.Ser,18.GSH,19.Hcy.溶液，测定在590nm处的荧光强度，进而确定探针对半胱氨酸反应的专一性，结果如图4所示。
图4所示，探针对于半胱氨酸具有很高的选择性，能够专一的和半胱氨酸反应，在反应前后荧光强度有明显的区别，因此，该荧光探针能够被应用于生物系统中进行半胱氨酸的荧光检测和成像。
实施例5
首先通过MTT法测试荧光探针对于宫颈癌细胞HeLa细胞的细胞毒性测试，其结果如图5所示，细胞在加入荧光探针后，生存状态良好，没有明显的毒性，表明该荧光探针可用于活细胞中Cys的检测。
荧光成像前，将宫颈癌细胞HeLa细胞于96孔培养板中培养12小时。然后，细胞分为三组，普通细胞；预先以N-乙基马来酰亚胺处理的细胞；预先以N-乙基马来酰亚胺处理后又用Cys处理的细胞。将荧光探针(10μM)与细胞在37℃孵育20分钟，用PBS漂洗两次，然后用荧光显微镜进行成像。如图6B所示，荧光探针对于宫颈癌细胞HeLa细胞具有很好的显色效果。由于N-乙基马来酰亚胺能抑制宫颈癌细胞HeLa细胞中Cys的生成，所以在6E中，没有明显的显色效果。而当经N-乙基马来酰亚胺预处理的细胞再经Cys处理后，染色效果最佳如图6H所示。由此可见，该荧光探针具有良好的渗透性，对半胱氨酸具有较好的识别能力。
Claims (10)
1.选择性检测半胱氨酸荧光探针，其特征在于，具有如下化学结构：
2.选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将化合物3和对羟基萘醛发生羟醛缩合反应制备化合物2的步骤，
步骤2：将化合物2和丙烯酰氯发生酯化反应制备目标探针的步骤，
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中，反应体系的溶剂采用乙醇。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中，反应在催化剂哌啶存在下进行，哌啶与化合物3的摩尔比为量为1:1。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中，反应温度为40-100℃。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中，反应体系的溶剂采用二氯甲烷。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中，反应在三乙胺存在下进行，三乙胺与化合物2的摩尔比为2:1。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中，反应温度为0℃-50℃。
9.如权利要求1所述的荧光探针在非诊断非治疗目的选择性检测半胱氨酸中的应用。
10.如权利要求1所述的荧光探针在非诊断非治疗目的选择性检测宫颈癌Hela细胞中半胱氨酸中的应用。
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