CN105418662A - 一种基于bodipy的半胱氨酸荧光探针化合物的制备与应用 - Google Patents
一种基于bodipy的半胱氨酸荧光探针化合物的制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种半胱氨酸荧光探针化合物及其制备与应用，所述半胱氨酸荧光探针化合物具有式I的结构。制备方法是：将4-氰基联萘酚与多聚甲醛反应，得到的产物II与吡咯反应得到中间产物III，之后DDQ氧化脱氢、与三氟化硼-乙醚螯合，丙烯酰氯羟基氢而得。该探针化合物对半胱氨酸具有很好的选择性和灵敏性，且对细胞没有毒性，可以应用于细胞内的检测和成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种半胱氨酸荧光探针化合物及其制备与应用，属于荧光探针技术领域。
技术背景
众所周知，细胞是组成生命最基本的单元结构，然而目前人们对于细胞中的各种生命现象的了解还远远不够深入、直观，所以能够检测分子的荧光探针以及生物成像具有很大的研究价值。在众多组成生命的物质中，巯基化合物特别是含有巯基的氨基酸在生命代谢中起着不可或缺的作用。研究表明，巯基化合物与很多疾病有关，比如帕金森病、心血管疾病、肾功能衰竭等。其中，半胱氨酸是参与蛋白质合成的、人体必需的20种基本氨基酸之一，也是构成谷胱甘肽的重要部分。半胱氨酸在体内能够增强细胞膜的稳定，减轻心肌细胞的损伤；刺激淋巴细胞分化增加人体的抵抗力；参与肝脏内的代谢过程，促进肝功能等作用。相反，如果体内缺少半胱氨酸就会导致代谢失调从而引发一系列疾病。因此，如何高效快速地检测生物体内半胱氨酸已成为化学、生物领域亟待解决的重大课题之一。荧光探针检测方法不仅灵敏度高、选择性好，而且可以应用于活细胞中的检测，目前很多科研工作者正在致力于这项研究。在现有技术中，CN103755672A提供了一种基于7-羟基香豆素衍生物的半胱氨酸荧光探针，该探针激发波长较短，可能对细胞本身有一定伤害，该技术也未能给出一个最低的检测限。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种半胱氨酸荧光探针化合物，可以灵敏检测半胱氨酸。
本发明还提供所述半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一种半胱氨酸荧光探针化合物，具有式I所示（图1）的结构。
本发明所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将4-氰基联苯酚和无水氯化镁混合溶于乙腈中，再加入适量的三乙胺和多聚甲醛，反应加热回流五小时，得到化合物II（如图2）；
（2）将制得的化合物II溶于二氯甲烷中，缓慢加入吡咯和少量三氟乙酸催化，室温反应搅拌一小时，得到化合物Ⅲ（如图3）；
（3）将上步制得化合物III溶于二氯甲烷中，加入适量DDQ并在室温下搅拌1.5小时，之后再加入三乙胺和三氟化硼-乙醚溶液，并在室温下搅拌反应22小时，得到化合物Ⅳ（如图4）；
（4）将上步制得的化合物Ⅳ溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和丙烯酰氯，在冰浴下反应4小时，得到探针分子I（如图1）。
根据本发明，优选的，步骤（1）所述氰基联苯酚、无水氯化镁、三乙胺和多聚甲醛的摩尔比为1:1.5:4:15；
根据本发明，优选的，步骤（2）所述化合物Ⅱ、三氟乙酸和吡咯的摩尔比为1:0.1:20；
根据本发明，优选的，步骤（3）所述化合物Ⅲ、DDQ、三乙胺和三氟化硼-乙醚的摩尔比为1:1.2:10:15；
根据本发明，优选的，步骤（4）所述化合物Ⅳ、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:1.2:1.2；
根据本发明，优选的，步骤（1）-（4）全程在氮气保护下进行；
根据本发明，优选的，步骤（1）反应回流温度为81℃。
更为详细的，所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，步骤如下：
(a)取6.24g（32mmol）的氰基联苯酚和4.56g（48mmol）的无水MgCl2于三口烧瓶中，氮气保护，再加入16.3ml（122mmol）三乙胺，然后加入80mL无水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32g（440mmol）。加热回流8小时。反应完成后，冷却至室温，然后用少量水进行淬灭，再加入大量的6M盐酸进行酸化，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得白色固体化合物Ⅱ3.51g，产率约为50%。
(b)取2.00g（8.96mmol）化合物Ⅱ加入150mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50mL干燥的二氯甲烷，室温下搅拌。待溶解后再缓慢地加入12.0mL（174.4mmol）新蒸馏的吡咯，然后再加入0.03mL的三氟乙酸作催化剂，室温搅拌1小时。反应停止后，将粗产物用饱和碳酸钠溶液洗涤，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得到1.42g的灰白色固体化合物Ⅲ，产率为46%。
(c)取0.71g（2.06mmol）化合物Ⅲ加入150mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50mL干燥的二氯甲烷，然后加入0.51g（2.24mmol）DDQ，室温下搅拌1.5h。再加入2.9mL（20.61mmol）三乙胺，最后缓慢加入3.9mL（30.86mmol）三氟化硼乙醚，室温下搅拌反应22h。反应结束后，将以上粗产物用50mL蒸馏水洗涤三次，然后用二氯甲烷萃取，硅胶柱纯化，得到橘红色固体化合物Ⅳ0.3g，产率约为42%。
(d)取0.10g（0.26mmol）化合物Ⅳ加入100mL的三口烧瓶中氮气保护，加入0.04mL（0.31mmol）干燥的三乙胺和10mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降温，加入0.026mL（约0.31mmol）丙烯酰氯。冰浴下搅拌反应4小时。反应停止后，加入少量水淬灭。将以上粗产物经过水洗、萃取、干燥、硅胶柱纯化后，得到0.04克橘红色产物I，产率约为35%。
本发明所述的半胱氨酸荧光探针化合物的应用，可广泛用于测试水体中的半胱氨酸含量。
进一步优选的，所述荧光探针用于在pH=7.4的乙腈和水体积比1:1的溶液中半胱氨酸的快速检测。在50%乙腈的水溶液中最低可探测的半胱氨酸浓度为10-8mol/L。
本发明通过实验验证，所述荧光探针在pH=7.4的乙腈和水体积比1:1的溶液中，用波长360nm的光作为激发波长，可以发现其在525nm处有很强的绿色荧光，一旦加入半胱氨酸，溶液荧光迅速淬灭，加入高半胱氨酸和谷胱甘肽的时候，荧光有少许淬灭，而加入其他氨基酸后溶液的荧光没有明显变化，对半胱氨酸具有很高的选择性。
将本发明的荧光探针化合物加入含有50%乙腈的水溶液中，配成荧光探针化合物浓度为5微摩尔每升的溶液，用HEPES缓冲溶液调节pH=7.4，加入不同浓度的半胱氨酸，用波长360nm的光激发，在波长525nm处的荧光依次减弱。得出工作曲线如图2所示，通过测定待测样品的荧光强度，就可以定量的计算出半胱氨酸的浓度。
本发明所述的半胱氨酸荧光探针化合物不仅可用于水体中半胱氨酸的检测，还可应用于细胞内半胱氨酸的检测和成像。
将HUVEC细胞在37℃条件下于含有20微摩尔每升的本发明探针Ⅰ的细胞培养基中培养30分钟，探针分子迅速的进入细胞内并显示出强荧光，然后用1.2毫摩尔每升的半胱氨酸处理3.5小时，其强荧光迅速淬灭。
与现有的检测技术相比，本发明荧光探针具有以下优点：
1、本发明的荧光探针化合物能够检测微量的半胱氨酸，且具有良好的灵敏度和选择性；
2、本发明的荧光探针化合物合成方法简单、收率高、产物易于保存；
3、本发明的荧光探针化合物具有很好的生物相容性和细胞膜穿透性；
4、与现有的技术CN103755672A相比，本发明的荧光探针的激发发射波长更长，在细胞成像研究时对细胞的损伤更小。
附图说明
图1为本发明荧光探针I的分子结构示意图。
图2为本发明中化合物II的分子结构示意图。
图3为本发明化合物III的分子结构示意图。
图4为本发明化合物IV的分子结构示意图。
图5为本发明实施例1荧光探针在含有50%乙腈的水溶液中(pH=7.4)，与不同氨基酸作用后的荧光强度。
图6为本发明的荧光探针与不同浓度的半胱氨酸的荧光强度工作曲线图。
图7为本发明的荧光探针用于细胞中半胱氨酸的检测及成像，分为左图和右图，左图为图a，右图为图b，图a为HUVEC细胞在本发明荧光探针培养基中的荧光图，图b为HUVEC细胞在本发明荧光探针和半胱氨酸共同作用下的荧光图。
图8本发明的荧光探针的核磁图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。
实施例1、
取6.24g（32mmol）的氰基联苯酚和4.56g（48mmol）的无水MgCl2于三口烧瓶中，氮气保护，再加入16.3mL（122mmol）三乙胺，然后加入80mL无水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32g（440mmol）。加热回流8小时。反应完成后，冷却至室温，然后用少量水进行淬灭，再加入大量的6M盐酸进行酸化，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得到白色固体Ⅱ3.51g，产率约为50%。核磁氢谱：1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:11.11(s,1H),9.99(s,1H),7.73-7.78(m,4H),7.66(dt,J=8.59Hz,2.12,2H),7.12(d,J=8.37Hz,1H)。
实施例2、
取2.00g（8.96mmol）化合物Ⅱ加入150mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50mL干燥的二氯甲烷，室温下搅拌。待溶解后再缓慢地加入12.0mL（174.4mmol）新蒸馏的吡咯，然后再加入0.03mL的三氟乙酸作催化剂，室温搅拌1小时。反应停止后，将粗产物用饱和碳酸钠溶液洗涤一次，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得到1.42g的灰白色固体Ⅲ，产率为46%。核磁氢谱：1HNMR（400MHz，CDCl3）δppm：7.34(d,J=2.27Hz,1H),6.99(d,J=8.32Hz,1H),6.76(m,2H),6.19(dd,J=5.93,3.03Hz,3H),6.05(m,2H),5.62(s,1H),5.45(s,1H),4.12(dd,J=14.48,7.30Hz,1H),2.05(s,1H)。
实施例3、
取0.71g（2.06mmol）化合物Ⅲ加入150mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50mL干燥的二氯甲烷，然后加入0.51g（2.24mmol）DDQ，室温下搅拌反应1.5h。再加入2.9mL（20.61mmol）三乙胺，最后缓慢加入3.9mL（30.86mmol）三氟化硼乙醚，室温下搅拌反应22h。反应结束后，将以上粗产物用50mL蒸馏水水洗三次，然后用二氯甲烷萃取，硅胶柱纯化，得到橘红色固体化合物物Ⅳ0.3g，产率约为42%。核磁氢谱：1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.98(s,2H),7.69(m,5H),7.55(d,J=2.41Hz,1H),7.17(d,J=8.67Hz,1H),6.96(d,J=4.33Hz,2H),6.57(d,J=3.69Hz,2H),5.43(s,1H)。
实施例4、
取0.10g（0.26mmol）化合物Ⅳ加入到100mL的三口烧瓶中氮气保护，加入0.04mL（0.31mmol）干燥的三乙胺和10mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降温，加入0.026mL（约0.31mmol）丙烯酰氯。冰浴下搅拌反应4小时。反应停止后，加入少量水淬灭。将以上粗产物经过水洗、萃取、干燥、硅胶柱纯化后。得到纯的0.04克橘红色化合物，产率约为35%。核磁氢谱：1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.93(s,2H),7.87(dd,J=8.50,2.55Hz,1H),7.77(dd,J=17.24,10.54Hz,2H),7.71(m,3H),7.49(m,1H),6.86(d,J=4.28Hz,2H),6.52(d,J=3.12Hz,2H),6.33(dd,J=17.27,1.11Hz,1H),6.06(d,J=17.2Hz,1H),5.89(dd,J=10.53,1.03Hz,1H)。
实施例5、荧光实验
取实施例1制备的荧光探针化合物，溶解到含有50%乙腈的水溶液中，用HEPES缓冲溶液调节pH=7.4；得荧光探针溶液，备用。
1、取荧光探针溶液，分23组，每组10毫升，其中1组不加氨基酸，22组分别加入含有Cys,Hcy,GSH,Ala,Arg,Asn,Asp,Gln,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val，使得每组溶液中含有探针化合物的浓度为5μΜ，氨基酸浓度为300μM，使得氨基酸与探针化合物的摩尔比为60:1；采用激发波长为360nm，荧光光度计测试其荧光强度，如图5所示，结果显示：本发明探针溶液本身具有很强的荧光，发射波长为525nm，一旦加入半胱氨酸，其荧光迅速淬灭，加入高半胱氨酸和谷胱甘肽荧光少许淬灭，而其他氨基酸加入后溶液的荧光没有变化，对半胱氨酸具有很高的选择性。
2、取荧光探针溶液，分13组，每组10毫升，分别加入不同浓度的半胱氨酸溶液，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为5μM，半胱氨酸的浓度分别为探针化合物浓度的0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60倍。采用激发波长为360nm，荧光光度计测试其荧光强度，如图6所示，结果显示：溶液在525nm处荧光迅速淬灭，其荧光强度与浓度成线性关系。根据测试计算，本探针化合物的最低检测限为3.7×10?8mol/L。
实施例6、细胞成像实验：将HUVEC细胞在37℃条件下于含有20微摩尔每升的本发明探针Ⅰ的细胞培养基中培养30分钟，探针分子迅速的进入细胞内并显示出强荧光，然后用1.2毫摩尔每升的半胱氨酸处理3.5小时，其强荧光迅速淬灭（如图8）。
Claims (9)
1.一种半胱氨酸荧光探针化合物，具有式I所示的结构（如图1）。
2.一种权利要求1所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：
本发明所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将4-氰基联苯酚和无水氯化镁混合溶于乙腈中，再加入适量的三乙胺和多聚甲醛，反应加热回流五小时，得到化合物II（如图2）；
（2）将上步制得化合物II溶于二氯甲烷中，缓慢加入吡咯和少量三氟乙酸催化，室温反应搅拌一小时，得到化合物Ⅲ（如图3）；
（3）将上步制得的化合物III溶于二氯甲烷中，加入适量DDQ并在室温下搅拌1.5小时，之后再加入三乙胺和三氟化硼-乙醚溶液，并在室温下搅拌反应22小时，得到化合物Ⅳ（如图4）；
（4）将上步制得的中间产物Ⅳ溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和丙烯酰氯，在冰浴下反应4小时，得到探针分子化合物I。
3.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）所述氰基联苯酚、无水氯化镁、三乙胺和多聚甲醛的摩尔比为1:1.5:4:15。
4.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（2）所述化合物Ⅱ、三氟乙酸和吡咯的摩尔比为1:0.1:20。
5.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（3）所述化合物Ⅲ、DDQ、三乙胺和三氟化硼-乙醚的摩尔比为1:1.2:10:15。
6.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（4）所述化合物Ⅳ、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:1.2:1.2；
如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）-（4）全程在氮气保护下进行，且步骤（1）反应回流温度为81℃。
7.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(a)取6.24g（32mmol）的氰基联苯酚和4.56g（48mmol）的无水MgCl2于三口烧瓶中，氮气保护，再加入16.3mL（122mmol）三乙胺，然后加入了80mL无水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32g（440mmol），加热回流8小时；反应完成后，冷却至室温，然后用少量水进行淬灭，再加入大量的6M盐酸进行酸化，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得到白色固体化合物Ⅱ3.51g，产率约为50%；
(b)取2.00g（8.96mmol）产物Ⅱ加入150mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50mL干燥的二氯甲烷，室温下搅拌；
待溶解后再缓慢地加入12.0mL（174.4mmol）新蒸馏的吡咯，然后再加入0.03mL的三氟乙酸作催化剂，室温搅拌1小时；反应停止后，将粗产物用饱和的碳酸钠溶液洗涤一次，二氯甲烷萃，硅胶柱分离，得到1.42g的灰白色固体产物Ⅲ，产率为46%；
(c)取0.71g（2.06mmol）产物Ⅲ加入150ml的三口烧瓶中，氮气保护，加入50ml干燥的二氯甲烷，然后加入0.51g（2.24mmol）DDQ，室温下搅拌反应1.5h，再加入2.9mL（20.61mmol）三乙胺，最后缓慢加入3.9mL（30.86mmol）三氟化硼乙醚，室温下搅拌反应22h；反应结束后，将以上粗产物用50mL蒸馏水水洗三次，然后加入二氯甲烷萃取，硅胶柱纯化，得到橘红色固体化合物Ⅳ0.3g，产率约为42%；
(d)取0.10g（0.26mmol）中间产物Ⅳ加入100mL的三口烧瓶中氮气保护，加入0.04mL（0.31mmol）干燥的三乙胺和10mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降温，加入0.026mL（约0.31mmol）丙烯酰氯，冰浴下搅拌反应4小时，反应停止后，加入少量水淬灭。
8.将以上粗产物经过水洗、萃取、干燥、硅胶柱纯化后，得到0.04克橘红色化合物，产率约为35%。
9.权利要求1所述的半胱氨酸荧光探针化合物的应用，可以用于检测水体中的半胱氨酸含量以及细胞成像研究。
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