CN104098606B - 一种磷光离子型铱配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磷光离子型铱配合物及其制备方法和应用，属于有机光电功能材料技术领域，具体涉及一类磷光离子型铱配合物的制备方法及其在氨基酸检测、细胞标记和成像领域中的应用。该磷光离子型铱配合物由环金属配体、金属中心和含有醛基的邻菲罗啉辅助配体组成，结构通式如下所示，该材料合成步骤简单、条件温和，在氨基酸检测、细胞标记和成像中具有非常好的应用前景。

Description

一种磷光离子型铱配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机光电材料技术领域，具体涉及一类磷光离子型铱配合物的制备方法及其在氨基酸检测、细胞标记和成像领域中的应用。

背景技术

氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位，人体生命活动中具有重要生理作用。氨基酸在人体内通过代谢可以发挥下列一些作用：合成组织蛋白质；变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质；转变为碳水化合物和脂肪；氧化成二氧化碳和水及尿素，产生能量。如果人体缺乏任何一种氨基酸，就可导致生理功能异常，影响抗体代谢的正常进行，严重时会导致疾病。因此，氨基酸在人体中的存在，不仅提供了合成蛋白质的重要原料，而且对于促进生长，进行正常代谢、维持生命提供了物质基础。

半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)是两种都含有巯基(-SH)的非必需氨基酸，在许多生理过程中发挥重要作用，例如，缓解有毒物或有毒药物(酚、苯、萘、氰根离子)的中毒程度；预防和治疗放射线照射造成的损伤。半胱氨酸(Cys)主要分布在肝、脾、肾中外，还大量积聚在人体表面包括皮肤、粘膜、消化器表面等，在异物侵入时可强化生物体自身的防卫能力，并对生物体的防御机构进行调整。此外，Cys还可维持巯基酶的活性，改善炎症和过敏的皮肤症状，具有防止生物体衰老的功能。Cys缺乏会导致多种综合症，包括儿童生长缓慢、皮肤病变、头发脱色、肝损伤和水肿等。

正常人体每日产生15-20μmol/L高半胱氨酸，大部分在细胞内分解代谢，仅有1.5μmol/L或更少被释放到血液中。正常空腹血浆高半胱氨酸水平为5-15μmol/L，若检查结果显示高半胱氨酸水平高于15.0μmol/L，则可诊断为高半胱氨酸血症。高半胱氨酸(Hcy)在体内的过多积累会诱发多种心血管疾病，如冠状动脉硬化性心脏病，外周血管疾病，脑血管疾病及静脉血栓形成等。此外与炎性肠道疾病、骨质疏松症和帕金森症等有一定的关联。

目前，检测半胱氨酸/高半胱氨酸的方法已经有很多的研究，Stabler等首先报道气相色谱-质谱联用测定血浆中高半胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的含量，此法操作十分复杂，耗时长，仪器设备要求高，普及很困难；高效液相色谱法(HPLC)由于其分离的高效率和检测方式灵敏而更常用一些。HPLC根据所用的色谱柱(反相柱或离子交换柱)、衍生方式(柱前或柱后衍生)、检测方式(紫外或荧光)的不同又分为多种测定方法；Shipchandler等报道了全自动的荧光偏振免疫测定(FPIA)是通过竞争性免疫反应来测定血浆中高半胱氨酸的含量；以及高效毛细管电泳法分析、同位素检测、免疫学法等。其中，利用光物理性质进行分析检测是是较为简单直观的方法。Jing Liu组合成了一种基于香豆素-半花青素的荧光探针，该探针分子具有三个识别位点，可以配合检测Cys/GSH，根据作用产物的发光颜色不同可以实现多色成像(J.Am.Chem.Soc.2014,136,574-577)。但是上述技术荧光探针存在如下技术问题：(1)吸收波长与发射波长的间隔相对较小，可能会导致自蚀。(2)发光的寿命相对较短，不易区分背景荧光。

相对于荧光分子，磷光过渡金属配合物具有大的Stokes位移、可见光激发、良好的光稳定性、长的发射寿命、高的量子效率和发射波长易调节等优势。大的斯托克斯位移可以很容易区分激发和发射，长的发射寿命可使用时间分辨技术与背景荧光信号相区分以提高检测的信噪比和灵敏度等。因此，开发具有选择性的、可用于生物体检测的磷光探针具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种磷光发射的铱配合物，给出它们的制备方法，并提出这类配合物在Cys/Hcy检测、细胞成像以及生物标记中的应用。

本发明所采用的技术方案如下：

为了解决上述其中一个技术问题提出的技术方案是：一种磷光离子型铱配合物，由环金属配体、金属中心和含有醛基的邻菲罗啉辅助配体组成的铱配合物具有如下结构通式：

其中，C^N配体为下列结构中一种：

本发明为解决上述另一个技术问题提出的技术方案是：该磷光离子型铱配合物制备方法的合成路线如下：

步骤一.1,10-邻菲罗啉与溴化钾在浓硫酸/浓硝酸(2:1，v:v)的混合液中80℃密闭反应3小时，碳酸氢钠水溶液中和反应液成中性，萃取混合液收集有机相，浓缩得到邻菲罗啉的二酮衍生物。

步骤二.在乙酸铵的催化下，邻菲罗啉的二酮衍生物与对苯二甲醛在冰醋酸溶液中95℃密闭反应6小时，反应停止后滴加氨水溶液中和反应液成中性，过滤并干燥生成的沉淀，得到含醛基的N^N配体。

步骤三.在氮气保护下，将铱二氯桥与含醛基的N^N配体在二氯甲烷/甲醇(2:1，v:v)混合液中40℃密闭反应4小时，冷却至室温后加入六氟磷酸钾继续反应1小时，分离提纯，得到含有醛基(-CHO)的铱配合物。

本发明为解决上述另一个技术问题提出的技术方案是：该磷光离子型铱配合物可应用于细胞成像和生物标记。

本发明的有益效果是：

(1)本发明合成的磷光离子型铱配合物在N^N配体上引入活性醛基官能团，合成简单，反应条件温和，具有一定的水溶性。

(2)本发明合成的磷光离子型铱配合物用作Cys/Hcy磷光探针，在Cys/Hcy存在下磷光发射显著增强，为turn-on型磷光探针，检测效果显著。

(3)本发明合成的离子型铱配合物磷光探针材料对Cys/Hcy具有较高的选择性，并且响应速度快。

(4)本探针材料具有低生物毒性，且容易进入细胞胞浆中，使得这类探针可用于细胞内Cys/Hcy检测，这对深入研究Cys/Hcy在生物体体内的生理作用具有重要意义。

附图说明：

图1为实施例1中磷光探针的DMSO/H₂O混合溶液的紫外-可见吸收光谱对Cys的响应性。

图2为实施例1中磷光探针的DMSO/H₂O混合溶液的磷光发射光谱对Cys的响应性。

图3为实施例1中磷光探针的DMSO/H₂O混合溶液的紫外-可见吸收光谱对Hcy的响应性。

图4为实施例1中磷光探针的DMSO/H₂O混合溶液的磷光发射光谱对Hcy的响应性。

图5为实施例1中磷光探针对Cys/Hcy的选择性示意图。

图6为实施例1中磷光探针对Cys/Hcy的细胞成像示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明创造作进一步的详细说明。

实施例1

1.功能N^N配体的制备：

化合物1：1,10-邻菲咯啉二酮衍生物的制备

在圆底烧瓶中加入5g1,10-邻菲罗啉水合物与25g溴化钾在100mL浓硫酸和50mL浓硝酸(2:1，v:v)的混合液中80℃密闭反应3小时，冷却后用碳酸氢钠水溶液中和反应液成中性，萃取混合液收集有机相，浓缩得到1,10-邻菲罗啉的二酮衍生物。产率：80％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,298K):δ(ppm)＝7.63-7.67(m,2H),8.35-8.39(dd,J＝8.0Hz,2H),8.95-8.98(dd,J＝8.0Hz,2H).

化合物2：含醛基(-CHO)的N^N配体的制备

在乙酸铵的催化下，180mg邻菲罗啉的二酮衍生物与126.4mg对苯二甲醛在6mL冰醋酸溶液中95℃密闭反应6小时，反应停止后冷却至室温，滴加氨水溶液中和反应液成中性，过滤并干燥生成的沉淀，得到含醛基的N^N配体。产率：90％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,298K):δ(ppm)＝7.81-7.85(dd,J＝8.0Hz,2H),8.11(d,J＝8.4Hz,2H),8.46-8.51(m,3H),8.90-8.93(dd,J＝8.0Hz,2H),9.02-9.04(dd,J＝4.0Hz,2H),10.0(s,1H).

2.功能C^N配体的制备：

采用Suzuki法合成相应的C^N配体，制备方法：在氮气保护下，将溴代物(1mmol)与硼酸化合物(1mmol)以四(三苯基磷)钯为催化剂在甲苯/乙醇/K₂CO₃饱和溶液(1:2:1，v:v)中回流反应过夜，萃取收集有机相，柱层析，溴代物与硼酸化合物如下所示，

3.当C^N为时，铱二氯桥的制备

称取2-(2′-噻吩基)喹啉(2.5mmol)与IrCl₃·3H₂O(1mmol)混合投入三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中，升温至110℃，磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将体系冷却至室温，过滤沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固体产物即为铱二氯桥，可直接投入下一步反应。

4.含醛基(-CHO)的铱配合物的制备

称取C^N环金属配体铱二氯桥(1mmol)、含醛基(-CHO)的N^N配体(2.3mmol)加入至三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中，将温度升至50℃，搅拌回流。反应5小时后，加入0.72mmol的六氟磷酸钾固体，继续搅拌反应过夜。反应结束后浓缩提纯，最后用二氯甲烷和正己烷重结晶，得到固体产物即为含醛基(-CHO)铱配合物。产率：60％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝6.24(d,J＝4.8Hz,2H),6.87(s,4H),7.19(s,1H),7.72(d,J＝4.4Hz,2H),7.78(d,J＝8.0Hz,2H),8.39-8.05(m,13H),9.09(d,J＝8.0Hz,2H),10.11(s,1H)；MS(MALDI-TOF):m/e理论值973.13，实验值937.07.

将不同当量的Cys/Hcy溶液加入本实施例中的配合物溶液中，进行紫外-可见吸收光谱测试。图1给出了加入半胱氨酸后本实施例中的配合物的紫外-可见吸收光谱，从图中可以看出，随着半胱氨酸的浓度增加，配合物在293.5nm、374.1nm、471.2nm处的吸收值有着较明显的增强此外，光谱在332.7nm处出现等吸收点；图3也给出了加入高半胱氨酸后配合物的紫外-可见吸收光谱，与加入半胱氨酸的谱图变化有些不同。随着高半胱氨酸的浓度增加，374.1nm的吸收值有着更为明显的增强，293.5nm、471.2nm两处的吸收值比加入半胱氨酸增强的趋势相对较弱，并且等吸收点出现在339.9nm处。

将不同当量的Cys/Hcy溶液加入本实施例中的配合物溶液中，进行磷光发射光谱测试。图2给出了本实施例中的配合物对半胱氨酸的滴定光谱，从图中可以看出，随着半胱氨酸的浓度增加，配合物在593.5nm处的磷光发射有着较明显的增强，在488.7nm处的磷光发射存在不明显的减弱，可以根据488.7nm、593.5nm两处的谱峰强度的改变实现比率法检测。图4也给出了本实施例中的配合物对高半胱氨酸的滴定光谱，与加入半胱氨酸的谱图变化基本一致，只是加入高半胱氨酸后配合物的磷光发射光谱改变的范围较加入半胱氨酸略微增大。

将过量的各种氨基酸的溶液加入本实施例中的配合物溶液中，室温搅拌使其充分反应后进行测试。图5给出了本实施例中的配合物对各种氨基酸的选择性实验，从图中可以看到本实施例中的配合物对Cys/Hcy的响应信号明显增强，说明本实施例中的配合物对Cys/Hcy具有较好的选择性。

将KB细胞用本实施例中的配合物溶液在37℃条件下孵育30分钟后进行共聚焦成像，收集488nm、593nm两个通道的谱图，如图6所示，未添加抑制剂的实验组可以观察到细胞内较明显的发光。将KB细胞先用200μM N-乙基马来酰亚胺(可以与巯基发生反应，将Cys/Hcy的反应底物饱和)预处理，再用本实施例中的配合物溶液在37℃条件下孵育30分钟后进行共聚焦成像，可以看到细胞内488nm通道的图像的发射改变不大，593nm通道的图像的发射明显减弱。实验结果说明本实施例中的配合物探针具有较好的细胞成像能力和较好的选择性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由本发明权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种磷光离子型铱配合物，其特征在于由环金属配体、金属中心和含有醛基的邻菲罗啉辅助配体组成的铱配合物具有如下结构式：

其中，C^N配体为：

2.一种如权利要求1所述的磷光离子型铱配合物的制备方法，其特征在于该制备方法的合成路线如下：

步骤一.1，10-邻菲罗啉与溴化钾在浓硫酸/浓硝酸2:1，v:v的混合液中80℃密闭反应3小时，碳酸氢钠水溶液中和反应液成中性，萃取混合液收集有机相，浓缩得到邻菲罗啉的二酮衍生物；

步骤二.在乙酸铵的催化下，邻菲罗啉的二酮衍生物与对苯二甲醛在冰醋酸溶液中95℃密闭反应6小时，反应停止后滴加氨水溶液中和反应液成中性，过滤并干燥生成的沉淀，得到含醛基的N^N配体；

步骤三.称取C^N配体与IrCl₃·3H₂O混合投入三颈瓶中，在双排管上抽真空-保氮气-抽真空，循环往复三次，最后采用氮气保护整个反应体系，将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中，升温至110℃，磁力搅拌反应24小时，反应结束后，将体系冷却至室温，过滤沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固体产物即为铱二氯桥，可直接投入下一步反应；

步骤四.在氮气保护下，将铱二氯桥与含醛基的N^N配体在二氯甲烷/甲醇2:1，v:v混合液中40℃密闭反应4小时，冷却至室温后加入六氟磷酸钾继续反应1小时，分离提纯，得到含有醛基(-CHO)的铱配合物。

3.一种如权利要求1所述的磷光离子型铱配合物的应用，其特征在于该磷光离子型铱配合物可应用于非疾病的诊断和治疗目的的半胱氨酸和高半胱氨酸检测。

4.一种如权利要求1所述的磷光离子型铱配合物的应用，其特征在于该磷光离子型铱配合物应用于非疾病的诊断和治疗目的的细胞标记和生物成像。