CN102924524B - 一种具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其合成方法，其中锰配合物双光子吸收材料的结构式如下：

Description

一种具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其合成方法

一、技术领域

本发明涉及一种双光子吸收材料及其制备方法，具体地说是一种具有低毒性的活体组织细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其合成方法。

二、背景技术

荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。1962年，Shimomura和Johnson等人首先从水螅水母类动物Aequorea Victoria中分离、纯化出荧光物质。2008年，三位科学家因发现和改进绿色荧光蛋白而获得诺贝尔化学奖，更加激发了人们对于各种荧光技术的研究兴趣。

随着双光子吸收材料的发现，双光子荧光技术在应用方面有了重大突破。由于双光子技术使用的是长波激发(近红外)，具有激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小等特点，在医疗诊断和荧光显微成像技术中有着诱人的应用前景。2004年，O’Halloran(J.Am.Chem.Soc.,2004,126,712-713)等报道了以Zn(Ⅱ)离子为中心的配合物双光子荧光显微技术，发展了一类用于荧光比率成像的苯并呋喃基锌探针分子，实现了纳摩尔量级的单细胞内锌离子分布双光子荧光成像的灵敏检测，成功解决了单光子诱导荧光对活体组织细胞存在辐射损伤的缺点，从而引起了人们对配合物双光子显影材料的制备和生物学研究的兴趣。近期申请人报道了硫原子端基配位、三联吡啶衍生物作为辅助配基的Zn(Ⅱ)配合物(J.Am.Chem.Soc.,2009,131,5208-5213)，表现出较好的双光子行为，具有双光子激发的荧光特性和良好的生物亲和性，且毒性低，可用于活体细胞显影。

申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：

1、www.google.com网检索结果：（2012/08/10）

2、中国期刊网检索结果：

检索方式一：

篇名-锰配合物双光子吸收材料：无相关文献。

篇名-具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其制备方法：无相关文献。

检索方式二：

全文-锰配合物双光子吸收材料：无相关文献。

全文-具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其制备方法：无相关文献。

三、发明内容

本发明旨在提供一种具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其合成方法，所要解决的技术问题是遴选合适的中心离子和配体，使其具有细胞显影功能，并且穿透性强、光损伤小、低毒，可用于活体细胞检测，荧光寿命较长。

本发明具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料，简写为[L-Mn-L][PF₆]₂，结构式如下：

本发明具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料的合成方法按以下步骤操作：

a、向反应器中加入N,N′-二甲基甲酰胺（DMF），搅拌下加入三苯胺，冰浴下搅拌混合均匀后滴加三氯氧磷，反应液呈黄色，滴完后升温40-50°C反应50-60min，反应液呈红色，反应结束后向反应液中倒入冰水，用氢氧化钠调pH=8-9，生成黄色沉淀，过滤并洗涤后用乙醇和水重结晶，得到淡黄色针状晶体即为中间体Ⅰ—三苯胺单醛；三苯胺与三氯氧磷的物质的量之比为1：8-10；

b、向反应器中加入中间体Ⅰ和无水THF，搅拌溶解，量取2-乙酰基吡啶和叔丁醇钾（t-BuOk）于THF中混匀并逐滴滴加到反应器中，室温搅拌反应4-6h，溶液变粉红色，回流搅拌20-40min后分批加入NH₄Ac(过量)，回流反应10-12h，反应结束后蒸出溶剂，用CH₂Cl₂溶解，搅拌过程中滴加HCl溶液(10wt%)，得到土黄色固体，抽滤烘干得到中间体Ⅱ—三苯胺三联吡啶；中间体Ⅰ、2-乙酰基吡啶和t-BuOk的物质的量之比为1：2-2.3：3-3.5；

c、向反应器中加入DMF，在冰浴以及搅拌的条件下滴加三氯氧磷，20-40min后形成白色的冰冻盐，然后加入中间体Ⅱ的氯仿溶液，回流反应4-6h，反应结束后除去氯仿，余下的反应液倒入冰水中，用氢氧化钠调pH=8-9，过滤并干燥后得到淡黄色固体即为中间体Ⅲ—三苯胺三联吡啶单醛；中间体Ⅱ与三氯氧磷的物质的量之比为1：4-5；

d、向反应器中加入DMF，在冰浴以及搅拌的条件下滴加三氯氧磷，20-40min后形成白色的冰冻盐，然后加入中间体Ⅲ的氯仿溶液，回流反应10-12h，反应结束后除去氯仿，余下的反应液倒入冰水中，用氢氧化钠调pH=8-9，过滤并干燥后得到黄色固体即为中间体Ⅳ—三苯胺三联吡啶双醛；中间体Ⅲ与三氯氧磷的物质的量之比为1：12-14；

e、向反应器中加入中间体Ⅳ和丙酮，搅拌溶解，然后滴加高锰酸钾和碳酸钾溶于蒸馏水后得到的混合溶液，反应液呈紫红色，常温搅拌反应10-12h，紫红色消失，反应结束后过滤，留取滤液的下层清液，旋蒸除去溶剂后用盐酸调pH=1-3，常温搅拌1-3h，过滤并干燥后得到黄色固体即为中间体Ⅴ—三苯胺三联吡啶双酸；中间体Ⅳ、高锰酸钾和碳酸钾的物质的量之比为1：4-5：1-1.2；

f、向反应器中加入中间体Ⅴ和甲醇，搅拌溶解后加入由甲醇和质量浓度98%的浓硫酸溶液按体积比40：1的比例构成的混合溶液，回流反应10-12h，反应完全后旋蒸除去溶剂，剩余物倒入冰水中，用碳酸钾调pH=8-9，色谱柱分离后得到淡黄色固体即为配体L—三苯胺三联吡啶双酸双酯；甲醇既是反应物又是溶剂，大大过量，浓硫酸与甲醇的体积比为1:80-90；

g、配体L放入反应器中，加入二氯甲烷，搅拌溶解后加入六氟磷酸锰的甲醇溶液，回流反应4-6h，反应结束后冷却至室温，过滤，依次用蒸馏水和甲醇洗涤3-5次，红外灯下烘干得到黄色固体即为目标产物锰配合物双光子吸收材料；六氟磷酸锰与配体L的物质的量之比为1：1.5-2。

中心离子和配体的性质对设计功能性配合物至关重要。二价锰离子能带间隙小且具有单电子，具有多种激发态和多种配位模式，能与吡啶、卤素、细胞中的碱基和羧基等配体配位，实现荧光增强，且有较长的荧光寿命，是良好的富光材料，能很好地实现配体到锰离子以及配体间的电荷和能量转移；吡啶配体能稳定d⁵结构的二价锰离子，形成的配合物稳定性好，能满足化学材料基本要求；研究表明：具有D-A共轭结构的吡啶配体与二价锰离子形成配合物后，在一定波长范围内具有较大的双光子吸收截面，可用作双光子荧光传感器，适用于活体组织细胞显影。与其它配合物相比，锰配合物在生命科学和功能材料研究领域有着更为明确的应用前景。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明首次合成了一种具有细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料，具有大的双光子吸收截面（可达368.83GM），激发能量低、波长长、穿透性强、光损伤小、低毒等特点，因此，对细胞无损伤，可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值。

2、本发明锰配合物中二价锰离子与配体能很好匹配，实现了配体到锰离子以及配体间的电荷和能量转移，使得荧光增强，且在不同溶剂中都具有较长的荧光寿命（可达19.27ns）。

3、发明人测试了该锰配合物的双光子细胞成像，结果表明，该锰配合物具有很好的细胞透过性，且主要作用于细胞质部分，有效的进行单、双光子显影，可以用来定性探测肝癌细胞，这一研究结果的发现，对生命科学研究领域具有重大意义。。

4、本发明以三苯胺和乙酰基吡啶作原料，原料易得，成本低，且合成步骤简单，最终产物锰配合物产率达95%。

四、附图说明

图1是本发明锰配合物[L-Mn-L][PF₆]₂和配体L在DMF中的双光子吸收截面。从图中可以看出锰配合物具有比配体更大的双光子吸收截面，具备更高的应用价值。

图2是本发明锰配合物[L-Mn-L][PF₆]₂对肝癌（7402）细胞的荧光成像研究结果，其中(a)明场作用图，（b）单光子作用图，(c)双光子作用图，(d)叠加图。从图中可以看出该配合物能够穿过细胞膜，进入细胞，均匀着色细胞质，有效的进行单、双光子显影，可以用来定性探测肝癌细胞。

五、具体实施方式

1、中间体Ⅰ—三苯胺单醛的制备：

在250mL圆底烧瓶中加入6.00g(0.08mol)精制的DMF，搅拌过程中加入9.80g(0.04mol)三苯胺，冰浴下搅拌10min，然后用恒温滴液漏斗缓慢滴加62.00g(0.40mol)三氯氧磷，至溶液呈现黄色，控制滴加速度，约1h滴完，升温至50°C，反应60min，反应得红色溶液，薄层色谱跟踪，反应完全后，倒入300mL冰水，用氢氧化钠调节至pH=8，得到大量黄色沉淀，抽滤，水洗三次，用乙醇和水重结晶，得到淡黄色针状晶体三苯胺单醛，产率88.5%。¹HNMR:(CDCl₃,400MHz):9.83(s,1H),7.71-7.68(m,2H),7.39-7.34(m,4H),7.20-7.17(m,6H),7.06-7.02(d,2H)。

2、中间体Ⅱ—三苯胺三联吡啶的制备：

在250mL圆底烧瓶中加入4.40g(16mmol)三苯胺单醛，再加入100mL无水THF，使其溶解，量取4.40g(35.8mmol)2-乙酰基吡啶和6.40g(56mmol)t-BuOk于50mL THF中混匀并逐滴滴加到上述溶液中，室温搅拌反应2h溶液变粉红色，回流搅拌20min后分批加入48gNH₄Ac(过量)回流反应12h，蒸出溶剂，用CH₂Cl₂溶解倒入250mL烧杯中，搅拌过程中滴加30mL的HCl溶液(10wt%)，得到土黄色固体，抽滤烘干后，色谱柱分离(体积比：石油醚：乙酸乙酯=10:1)，得到中间体Ⅱ—三苯胺三联吡啶，产率40.1%。¹HNMR(CD₃COCD₃,400MHz):8.73-8.63(m,6H),8.02-7.99(t,2H),7.84,7.82(d,2H),7.51-7.48(t,2H),7.36-7.32(t,4H),7.112-7.092(d,8H)。

3、中间体Ⅲ—三苯胺三联吡啶单醛的制备：

在250mL的烧瓶中加入1.00g干燥DMF，冰浴，搅拌，缓慢滴加2.00g三氯氧磷，20min后形成白色的冰冻盐，称取1.50g三苯胺三联吡啶溶于50mL的氯仿中，然后加入到上述的冰冻盐中，回流反应12h，反应结束后除去氯仿，将剩余物倒入大量冰水中，用氢氧化钠调节至pH=8，过滤分离后，得到淡黄色固体即为中间体Ⅲ—三苯胺三联吡啶单醛，产率62.5%。¹HNMR(CDCl₃,400MHz):9.83(s,1H),8.72(m,6H),8.01(m,4H),7.80(d,2H),7.52(m,4H),7.29(m,5H),7.05(m,2H)。

4、中间体Ⅳ—三苯胺三联吡啶双醛的制备：

在250mL的烧瓶中加入1.00g干燥DMF，冰浴，搅拌，缓慢滴加2.00g三氯氧磷，20min后形成白色的冰冻盐，称取1.50g三苯胺三联吡啶单醛溶于50mL氯仿中，然后加入到上述的冰冻盐中，回流反应24h，薄层色谱跟踪，反应结束后除去氯仿，将剩余物倒入大量冰水中，用氢氧化钠调节至pH=8，抽滤得黄色固体即为中间体Ⅳ—三苯胺三联吡啶双醛，产率73.3%。¹HNMR(DMSO-d₆,400MHz):9.92(s,2H),8.76(t,4H),8.69(d,2H),8.04(d,4H),7.90(d,4H),7.53(t,2H),7.38(d,2H),7.28(d,4H)。

5、中间体Ⅴ—三苯胺三联吡啶双酸的制备：

在500mL圆底烧瓶中加入2.01g三苯胺三联吡啶双醛，加入200mL丙酮使其全部溶解，称取2.52g高锰酸钾和0.56g碳酸钾溶于30mL蒸馏水中并缓慢滴加到上述溶液中，溶液呈紫红色，薄层色谱跟踪反应，反应12h后紫红消失，停止反应，抽滤，取下层清液并旋出部分溶剂丙酮，加入盐酸并调节至pH=1，常温搅拌1h抽滤，得黄色固体即为中间体Ⅴ—三苯胺三联吡啶双酸，产率70.8%。¹HNMR(DMSO-d₆,400MHz):8.81(t,6H),8.18(t,2H),8.03(d,2H),7.92(d,4H),7.65(t,2H),7.33(d,2H),7.18(d,4H)。

6、配体L—三苯胺三联吡啶双酸双酯的制备：

在250mL圆底烧瓶中加入0.68g三苯胺三联吡啶双酸，量取100mL甲醇使其溶解，再加入80mL甲醇和浓硫酸的混合溶液（体积比甲醇：浓硫酸=40:1，浓硫酸的质量浓度为98%），回流反应12h，薄层色谱跟踪，反应完全后旋出溶剂甲醇，将剩余液体倒入到大量冰水中，以碳酸钾调节至pH=8，色谱柱分离(按照体积比石油醚:乙酸乙酯=5:1)，得到淡黄色固体即为配体L—三苯胺三联吡啶双酸双酯，产率75.84%。¹HNMR:(CD₃COCD₃,400MHz):8.85(s,2H),8.77(d,4H),8.01(q,8H),7.50(t,2H),7.42(d,2H),7.27(d,4H),3.89(s,6H)。

7、锰配合物的合成

称取配体L三苯胺三联吡啶双酸双酯0.47g放入100mL圆底烧瓶中，用5mL二氯甲烷溶解，再用烧杯称取新制的六氟磷酸锰0.14g，用甲醇溶解后加入上述溶液中，溶液立即变色，有橙黄色固体析出，回流反应4h后冷却至室温，抽滤，依次用蒸馏水、甲醇洗涤两次，收集固体，红外灯下烘干，得到黄色固体，即为锰的三苯胺三联吡啶功能配合物，产率95%。¹HNMR(CDCl₃,400MHz):9.630(s,4H),9.042-9.022(d,4H),8.499-8.478(d,4H),8.055-8.016(t,12H),7.545-7.506(d,4H),7.345-7.258(d,12H),7.210-7.149(t,4H),3.854(s,12H)。MS(ESI),m/z:620.25。

8、用于活体细胞显影的过程

采用人体肝癌（7402）细胞，DMEM培养基培养24小时，染色前用PBS洗涤三次以除去培养基。在培养小皿中加入200μL的PBS后加入35μL的[L-Mn-L][PF₆]₂无水DMSO溶液（1×10^-3mol/L）。避光孵育30分钟后，用移液枪吸出溶液。PBS溶液洗涤三次后进行双光子荧光显微与成像（激发波长730nm，发射波长490-550nm）。

Claims (2)

1.一种具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料，其特征在于其结构式如下：

2.一种权利要求1所述的具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料的合成方法，包括中间体的制备、目标产物的合成以及分离、洗涤、纯化和干燥各单元过程，其特征在于按以下步骤操作：

a、向反应器中加入DMF，搅拌下加入三苯胺，冰浴下搅拌滴加三氯氧磷，滴完后升温至40-50℃反应50-60min，得到中间体Ⅰ；三苯胺与三氯氧磷的物质的量之比为1:8-10；所述中间体Ⅰ的结构式为：

b、向反应器中加入中间体Ⅰ和无水THF，搅拌溶解，量取2-乙酰基吡啶和t-BuOK于THF中混匀并滴加到反应器中，室温搅拌反应4-6h，然后加入NH₄Ac，回流反应10-12h，得到中间体Ⅱ；中间体Ⅰ、2-乙酰基吡啶和t-BuOK的物质的量之比为1：2-2.3：3-3.5；所述中间体Ⅱ的结构式为：

c、向反应器中加入DMF，在冰浴以及搅拌的条件下滴加三氯氧磷，形成白色的冰冻盐后加入中间体Ⅱ的氯仿溶液，回流反应4-6h，得到中间体Ⅲ；中间体Ⅱ与三氯氧磷的物质的量之比为1：4-5；所述中间体Ⅲ的结构式为：

d、向反应器中加入DMF，在冰浴以及搅拌的条件下滴加三氯氧磷，形成白色的冰冻盐后加入中间体Ⅲ的氯仿溶液，回流反应10-12h，得到中间体Ⅳ；中间体Ⅲ与三氯氧磷的物质的量之比为1：12-14；所述中间体Ⅳ的结构式为：

e、向反应器中加入中间体Ⅳ和丙酮，然后向反应器中滴加高锰酸钾和碳酸钾溶于蒸馏水后得到的混合溶液，常温搅拌反应10-12h，得到中间体Ⅴ；中间体Ⅳ、高锰酸钾和碳酸钾的物质的量之比为1：4-5：1-1.2；所述中间体Ⅴ的结构式为：

f、向反应器中加入中间体Ⅴ和甲醇，搅拌溶解后加入甲醇和浓硫酸的混合溶液，回流反应10-12h，得到配体L；所述配体L的结构式为：

g、配体L放入反应器中，加入二氯甲烷，搅拌溶解后加入六氟磷酸锰的甲醇溶液，回流反应4-6h，得到目标产物锰配合物双光子吸收材料；六氟磷酸锰与配体L物质的量比为1：1.5-2。