CN109942508B - 一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方法和应用,涉及生物化学材料领域。本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针具有式I所示结构,该比率型一氧化碳荧光探针具有合成原料易得,合成简单,目标化合物荧光量子产率高,抗光漂白能力强及比率型响应等优点,避免了传统荧光探针不宜在高浓度下检测及单一发射在检测过程中易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点,并且能够用于检测细胞内一氧化碳。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学材料技术领域,具体涉及一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
一氧化碳(CO)是近几十年来经研究证实的重要生物信号传递分子之一,在生物体内它可以与氧气竞争性结合血红蛋白,从而阻碍氧气的正常运输。如果过量摄入外源性的一氧化碳可导致生物机体一氧化碳中毒,因此一氧化碳曾长期被认为仅仅是一种有毒有害的物质。然而,越来越多的研究证实了内源性的一氧化碳在机体内确实具有一定的生理作用,随着人们对一氧化碳在生物体内作用的研究逐渐深入,发现一氧化碳可作为重要的神经传递介质,参与生物体内心血管调节、呼吸调节和体温调节等许多重要生物过程;一氧化碳还具有抗高血压、消炎及保护细胞等作用,因此也是潜在的疾病治疗药物。因此发展用于生物样品中对一氧化碳有高灵敏、快速而又有高选择性的检测技术和方法,具有重要的生物学意义。
目前,对于环境和生物样品中一氧化碳的分析,已经有多种实验方法,如气相色谱法、电化学方法、比色法和红外光吸收光谱法等。然而,鉴于一氧化碳分子化学性质“超级”稳定性,目前基于生物活性分子一氧化碳的荧光分析方法仍然屈指可数。荧光法由于具有操作简单、灵敏度高、检测限低、可用于细胞内或活体成像等优点受到了科学家们的广泛关注。目前文献报道的检测一氧化碳的探针较少,并且,大部分的比率型一氧化碳荧光探针所采用的荧光分子在高浓度时极易发生荧光猝灭,即聚集导致荧光猝灭(aggregationcaused quenching,ACQ)现象。这种现象迫使研究人员在检测过程中只能使用稀溶液,导致检测信噪比低,限制了这些比率型一氧化碳荧光探针的实际应用。同时,基于单一发射波长荧光强度的变化来检测一氧化碳非常容易受到外界因素,如浓度、温度、pH值、仪器灵敏度等干扰。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针具有聚集诱导发光特性,且通过两个不同发射波长的比率变化进行响应,能够有效避免传统荧光探针不宜在高浓度下检测及单一发射在检测过程中易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点,并具有响应快、选择性强、灵敏度高、抗漂白能力强等优点,可以应用于检测一氧化碳。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种比率型一氧化碳荧光探针,具有式I所示结构:
本发明提供了上述技术方案所述比率型一氧化碳荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
将化合物1、烯丙基溴、碱性化合物和第一有机溶剂混合,进行取代反应,得到化合物2;
所述化合物2为R-CHO;
将所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱、有机酸和第二有机溶剂混合,在保护气氛下进行Knoevenagel反应,得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
优选地,所述化合物1、烯丙基溴和碱的摩尔比为1:(1.5~2.5):(2.5~4.0)。
优选地,所述取代反应的温度为60~100℃。
优选地,,所述取代反应完成后,将所得取代产物体系进行后处理,所述后处理包括以下步骤:
将取代产物体系进行固液分离,得到液态混合物;
将所述液态混合物萃取后干燥、浓缩,得到浓缩物;
将所述浓缩物进行柱层析,得到化合物2。
优选地,所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱和有机酸的摩尔比为1:(1.5~2.5):(1.5~3.5):(2.0~5.5)。
优选地,所述Knoevenagel反应的温度为60~150℃。
优选地,所述Knoevenagel反应完成后,还包括将得到的产物体系依次进行萃取、干燥、浓缩和重结晶,得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
本发明提供了上述技术方案所述比率型一氧化碳荧光探针或上述方案所述制备方法制备的比率型一氧化碳荧光探针在检测一氧化碳中的应用。
优选地,所述一氧化碳为细胞内的一氧化碳。
本发明提供了一种具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针,本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针是具有聚集诱导发光特性的化合物,并且可以通过两个不同发射波长的荧光强度的比率变化检测一氧化碳,能够应用于检测细胞内一氧化碳,可以有效避免传统荧光分子在高浓度下荧光猝灭或单一波长荧光强度易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点。实施例结果表明,本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针对溶液中的一氧化碳检测灵敏度高、选择性好,并通过不同发射波长下的荧光强度的比值变化进行比率型响应;同时,本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针在37℃下响应时间仅为15min,且不受pH值的影响,对细胞内一氧化碳成像具有特异性,能够通过比率型响应在活细胞中检测一氧化碳。
本发明还提供了所述比率型一氧化碳荧光探针的制备方法,本发明提供的制备方法步骤简单,容易操作,适宜工业化生产。
附图说明
图1为BTNS-CO在不同浓度的一氧化碳存在条件下孵化不同时间后564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值变化图;
图2为在5μM的BTNS-CO溶液中加入不同浓度一氧化碳孵化后荧光发射光谱的变化图;
图3为BTNS-CO溶液在564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值与一氧化碳浓度的线性曲线图;
图4为BTNS-CO溶液564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值随不同pH值变化图;
图5为BTNS-CO溶液中分别加入不同竞争分子后564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值变化图;
图6为BTNS-CO与HeLa细胞37℃下孵化5min后的激光共聚焦显微成像照片;
图7为细胞中绿色通道荧光强度与红色通道荧光强度的比值随不同CO浓度的变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种比率型一氧化碳荧光探针,具有式I所示结构:
本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针结构中,苯并噻唑腈为聚集诱导发光基团,因而本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针同时具有聚集诱导发光特性,并且探针与一氧化碳反应前后都具有荧光,且荧光发射波长不同,能够通过不同发射波长的荧光强度比值变化实现一氧化碳的比率型响应,可以有效避免传统荧光分子在高浓度下荧光猝灭或单一波长荧光强度易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点,并能够应用于检测细胞内一氧化碳,并且本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针响应时间短,对pH值不敏感。
本发明还提供了上述技术方案所述比率型一氧化碳荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
将化合物1、烯丙基溴、碱性化合物和第一有机溶剂混合,进行取代反应,得到化合物2;
所述化合物2为R-CHO;
将所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱、有机酸和第二有机溶剂混合,在保护气氛下进行Knoevenagel反应,得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
本发明将化合物1、烯丙基溴、碱和第一有机溶剂混合,进行取代反应,得到化合物2。在本发明中,所述碱性化合物优选为碳酸钠、碳酸钾或碳酸铯,更优选为碳酸钾,本发明对于所述第一有机溶剂没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的适用于进行取代反应的有机溶剂即可,具体如乙腈或二甲基甲酰胺。在本发明中,所述化合物1、烯丙基溴和碱的摩尔比优选为1:(1.5~2.5):(2.5~4.0),更优选为1:2.0:3.0。
在本发明中,所述取代反应的温度优选为60~100℃,更优选为80~100℃,最优选为90℃。本发明对于所述取代反应的时间没有特殊的限定,优选通过TCL板对反应进行监控,反应至化合物1完全消失即可。在本发明中,所述取代反应优选在搅拌条件下进行,本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。在本发明中,所述取代反应优选在保护性气氛条件下进行,所述保护性气氛优选为氮气气氛。
取代反应完成后,本发明优选将所得取代产物体系进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
将取代产物体系进行固液分离,得到液态混合物;
将所述液态混合物萃取后干燥、浓缩,得到浓缩物;
将所述浓缩物进行柱层析,得到化合物2。
本发明对所述固液分离的具体方法没有特殊要求,抽滤即可。在本发明中,所述萃取用萃取剂优选为二氯甲烷和饱和食盐水,所述二氯甲烷和饱和食盐水的体积比优选为1:1;所述萃取的次数优选为3次。本发明优选将萃取后所得有机相进行干燥,本发明对所述干燥所采用的干燥剂没有特殊的限定,采用本领域技术熟知的干燥剂即可,具体如无水硫酸钠。本发明优选将所述干燥后所得有机物料进行浓缩,本发明对于所述浓缩没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的浓缩方法即可,在本发明的实施例中,优选通过旋转蒸发将干燥后所得有机物料浓缩至固体。在本发明中,所述柱层析用洗脱剂优选为石油醚和二氯甲烷混合溶剂,所述混合溶剂中石油醚和二氯甲烷的体积比优选为2:1。
得到化合物2后,本发明将所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱、有机酸和第二有机溶剂混合,在保护气氛下进行Knoevenagel反应,得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
在本发明中,所述有机酸优选为乙酸,本发明对于所述有机碱没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的适用于进行Knoevenagel反应的有机碱即可,具体如哌啶或吡啶。
本发明对所述第二有机溶剂没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的适用于进行Knoevenagel反应的有机试剂即可,具体如甲苯或四氢呋喃。在本发明中,化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱、有机酸的摩尔比优选为1:(1.5~2.5):(1.5~3.5):(2.0~5.5),更优选为1:(1.8~2):(2.0~3.2):(2.5~5.2)。
在本发明中,所述Knoevenagel反应的温度优选为60~150℃,更优选为100~150℃,最优选为130℃。本发明对于所述Knoevenagel反应的时间没有特殊的限定,优选通过TCL板对反应进行监控,反应至化合物2完全消失即可。本发明对于提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的保护性气体即可,具体如氮气。
Knoevenagel反应完成后,本发明优选将得到的产物体系依次进行萃取、干燥、浓缩和重结晶,得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
在本发明中,所述萃取所采用的萃取试剂优选为二氯甲烷和饱和食盐水所述二氯甲烷和饱和食盐水的体积比优选为1:1;所述萃取的次数优选为3次。在本发明中,所述干燥的具体步骤为加入无水硫酸钠或无水硫酸镁等干燥剂静置干燥30min。所述浓缩的方式优选为用旋转蒸发仪进行浓缩。
所述重结晶用溶剂优选为二氯甲烷和石油醚的混合液,所述混合液中二氯甲烷和石油醚的体积比优选为15:1;重结晶完成后,本发明优选将重结晶产物干燥,得到式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
本发明还提供了上述技术方案所述比率型一氧化碳荧光探针或上述技术方案所述制备方法制备的比率型一氧化碳荧光探针在检测一氧化碳中的应用;所述一氧化碳优选为细胞内的一氧化碳;所述细胞具体的如人宫颈癌细胞。在本发明的具体实施例中,所述一氧化碳优选由CORM-3(一氧化碳供体,三羰基氯(甘氨酸基)钌(II))提供。
本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针本身在710nm处具有荧光,且荧光较弱,在与一氧化碳作用后,会产生在546nm处具有强荧光的物质,且546nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值和一氧化碳在一定浓度范围内成线性关系,根据具体的荧光强度比值以及线性曲线即可得到一氧化碳的浓度;所述线性曲线为荧光强度比值和一氧化碳浓度的关系曲线,本发明对所述线性曲线的绘制方法没有特殊要求,使用本领域技术人员熟知的方法即可;此外,本发明的荧光探针还具有聚集诱导发光特性,能够有效避免传统荧光分子在高浓度溶液中荧光猝灭的现象。
本发明对所述比率型一氧化碳荧光探针的具体应用方法没有特殊限定,使用本领域技术人员熟知的方法进行应用即可。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
按以下反应流程制备比率型一氧化碳荧光探针:
(1)将4-(二乙氨基)水杨醛(化合物1,193mg,1.0mmol)、烯丙基溴(242mg,2.0mmol)、碳酸钾(415mg,3.0mmol)和乙腈混合,在氮气的保护下90℃回流,用TCL板监控反应进程直至化合物1完全消失;将反应混合液抽滤除掉碳酸钾,向所得产物中加入饱和食盐水,用二氯甲烷萃取三次,所得有机相用无水硫酸钠干燥,旋转蒸发浓缩至固体后用硅胶柱层析法进行纯化,所述柱层析用洗脱剂为二氯甲烷和石油醚的混合溶剂,所述混合溶剂中石油醚和二氯甲烷的体积比优选为2:1,得到微黄油状液体212mg。
经计算化合物2的产率为91%;
对所得油状液体进行表征,具体数据如下:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.09(s,1H),7.59(d,J=8.9Hz,1H),6.16(d,J=10.4Hz,1H),5.94(d,J=2.0Hz,2H),5.35(d,J=18.3Hz,1H),5.21(d,J=10.6Hz,1H),4.52(d,J=5.0Hz,2H),3.32-3.27(m,4H),1.17-1.08(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ186.77,163.21,153.79,132.97,130.18,117.35,114.18,104.41,93.67,77.66,77.34,77.02,68.78,44.74,12.52.
根据上述表征数据可知,所得微黄油状液体为化合物2所示结构。
(2)将化合物2(117mg,0.5mmol)、苯并噻唑-2-乙腈(174mg,1.0mmol)、哌啶(150μL,1.6mmol)、乙酸(150μL,2.6mmol)与25mL甲苯混合,在氮气的保护下130℃回流,用TCL板监控至化合物2消失,向反应混合物中加入饱和食盐水,用二氯甲烷萃取三次,浓缩后,重结晶(溶剂为二氯甲烷和石油醚,体积比为15:1),得到红色固体166mg。
经计算BTNS-CO的产率为85%;
对所得红色固体进行表征,具体数据如下:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),8.43(d,J=9.2Hz,1H),8.01(d,J=8.1Hz,1H),7.83(d,J=7.9Hz,1H),7.49–7.41(m,1H),7.38–7.30(m,1H),6.37(m,1H),6.20–6.03(m,2H),5.50(d,J=18.8Hz,1H),5.37(d,J=11.9Hz,1H),4.67-4.65(m,2H),3.45-3.40(m,4H),1.24-1.21(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.91,160.46,153.99,152.58,141.21,134.42,133.01,130.53,126.32,124.85,122.90,121.26,118.63,117.65,110.04,105.25,96.42,94.36,77.35,77.24,77.03,76.72,69.28,44.90,12.72.
根据上述表征数据可知,所得红色固体为BTNS-CO。
实施例2
对实施例1制备的比率型一氧化碳探针(BTNS-CO)进行性能测试,具体步骤如下:
(1)比率型一氧化碳探针的响应时间测定:在2mL 95%PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL BTNS-CO的DMSO溶液(1mM)和10μL PdCl2的DMSO溶液(1mM),得到5μM的BTNS-CO和PdCl2的混合溶液,然后分别加入2.5μM、5μM、10μM的CORM-3溶液,所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、12min、14min、16min、18min、23min、28min、33min),测定所述混合溶液的564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值随孵化时间的变化情况。
图1为BTNS-CO在不同浓度的一氧化碳存在条件下在95%PBS/DMSO混合溶液中孵化不同时间后564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值变化图,由图1可知,在37℃下孵化15min后,荧光强度基本达到饱和,这说明一氧化碳探针响应较快,仅为15min。
(2)一氧化碳探针的荧光滴定测试:在2mL 95%PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL BTNS-CO的DMSO溶液(1mM)和10μL PdCl2的DMSO溶液(1mM),得到5μM的BTNS-CO和PdCl2的混合溶液,然后分别加入不同浓度的CORM-3溶液(一氧化碳浓度范围为0~80μM),在37℃下孵化15min后,测定加入不同浓度一氧化碳后所得溶液的荧光发射光谱(Ex=465nm),并以564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值为纵坐标、一氧化碳的浓度为横坐标建立BTNS-CO对一氧化碳检测的线性曲线。
图2为在5μM的BTNS-CO溶液中加入不同浓度一氧化碳孵化后荧光发射光谱的变化图;根据图2可以看出,随着一氧化碳浓度的增大,546nm处荧光强度逐渐增强,而710nm处荧光强度变化不太明显。
图3为BTNS-CO溶液在564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值与一氧化碳浓度的线性曲线图,所述线性曲线具体为Y=1.3539X+1.89931,荧光强度对于一氧化碳的浓度的线性响应在1~5μM(R2=99.8%)之间。由图3可以看出,荧光探针BTNS-CO可以在一定浓度范围内对溶液中的CO实现比率型线性响应。
(3)一氧化碳探针对pH的敏感性测定:在2mL 95%PBS/DMSO混合溶液(pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)中加入10μL BTNS-CO的DMSO溶液(1mM)和10μLPdCl2的DMSO溶液(1mM),得到5μM的BTNS-CO和PdCl2的混合溶液,然后加入100μM的CORM-3溶液,所得混合溶液在37℃下孵化15min后,测定所述混合溶液在564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值随PBS缓冲溶液pH值的变化情况。
图4为BTNS-CO在不同pH值的PBS/DMSO混合溶液564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值变化图,由图4可知,探针BTNS-CO本身具有很好的pH稳定性,而探针BTNS-CO对一氧化碳的响应在pH为6.0~11.0范围内具有很好的响应能力。
(4)一氧化碳探针的选择性测试:在2mL 95%PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL BTNS-CO的DMSO溶液(1mM)和10μL PdCl2的DMSO溶液(1mM),得到5μM的BTNS-CO和PdCl2的混合溶液,分别加入100μM的AcO-、ClO-、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、双氧水(H2O2)、H2S、同型半胱氨酸(Hcy)、HNO、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、Br-、Cl-、F-、HCO3 -、NO2 -、·OH、ONOO-、PdCl2、苯丙氨酸(Phe)、ROO·、丝氨酸(Ser)、SO4 2-和CORM-3,所得混合溶液分别在37℃下孵化15min,然后测定混合溶液564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值的变化。
图5为BTNS-CO溶液中分别加入不同竞争分子后564nm处荧光强度与710nm处荧光强度的比值变化图,由图5可知,除CO外的其它生物分子与BTNS-CO反应前后的荧光强度比值均没有明显变化,说明BTNS-CO可以选择性的识别CO。
实施例3
对人宫颈癌细胞(HeLa)内一氧化碳荧光成像情况进行测试,具体步骤如下:
HeLa细胞经过复苏接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养,然后在18mm盖玻片上培养24h,待用。
将培养后的HeLa细胞浸入含5μM BTNS-CO的培养基中,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养15min后,倒出培养基,用新鲜培养基清洗细胞3遍;加入2mLPBS溶液,空白对照组加入5μM PdCl2的DMSO溶液(1mM),实验组加入5μM PdCl2的DMSO溶液(1mM)后,再分别加入10μM、20μM、50μM的CORM-3,在激光共聚焦荧光显微镜下观察,并用485nm作为激发光源,对其进行明场和暗场下拍照。
图6为BTNS-CO与HeLa细胞37℃下孵化5min后的激光共聚焦显微成像照片,由图6可知,BTNS-CO在HeLa细胞中,不管是红光通道还是绿光通道都呈现弱的荧光信号,而在加入了CO的HeLa细胞中,红光通道荧光信号基本不变,而绿光通道的荧光信号明显增强。
图7为细胞中绿色通道荧光强度与红色通道荧光强度的比值随不同CO浓度的变化图,可见BTNS-CO对细胞内一氧化碳的成像呈现浓度依赖关系,说明BTNS-CO可以对细胞内一氧化碳进行比率型荧光成像。
实施例4
对所得产物进行表征,可知得到的比率型一氧化碳荧光探针为
实施例5
对所得产物进行表征,可知得到的比率型一氧化碳荧光探针为
按照实施例2~3的方法对实施例4~5所得比率型一氧化碳荧光探针进行pH敏感性、响应时间、荧光滴定、选择性和人宫颈癌细胞内成像情况进行测试,所得结果和实施例2~3相似。
由以上实施例可知,本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针具有聚集诱导发光特性和比率型响应特性,且响应时间短,对pH不敏感,能够应用于检测细胞内一氧化碳,且能够通过两个不同发射波长的荧光强度比率进行响应和细胞成像,可有效避免单一波长易受温度、pH、浓度及仪器等外界因素的干扰,获得更高的成像分辨率,具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述化合物1、烯丙基溴和碱性化合物的摩尔比为1:(1.5~2.5):(2.5~4.0)。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述取代反应的温度为60~100℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述取代反应完成后,将所得取代产物体系进行后处理,所述后处理包括以下步骤:
将取代产物体系进行固液分离,得到液态混合物;
将所述液态混合物萃取后干燥、浓缩,得到浓缩物;
将所述浓缩物进行柱层析,得到化合物2。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱和有机酸的摩尔比为1:(1.5~2.5):(1.5~3.5):(2.0~5.5)。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述Knoevenagel反应的温度为60~150℃。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述Knoevenagel反应完成后,还包括将得到的产物体系依次进行萃取、干燥、浓缩和重结晶,得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。
9.权利要求1所述比率型一氧化碳荧光探针或权利要求2~8任意一项所述制备方法制备的比率型一氧化碳荧光探针在非诊断或治疗目的的检测一氧化碳中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述一氧化碳为细胞内的一氧化碳。
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