CN115651006B - 一种具有大斯托克斯位移的过氧化氢比率型近红外荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有大斯托克斯位移的过氧化氢比率型近红外荧光探针及其制备方法与应用。HBTH结构式如式I所示。HBTH本身在537nm较强荧光发射，当HBTH与H2O2共存时，体系在680nm处出现一个新的荧光发射峰。随着H2O2浓度增加，体系在537nm处荧光逐渐减弱，而在680nm处荧光逐渐增强，680nm处荧光发射强度F680nm与537nm处荧光发射强度F537nm的比值F680nm/F537nm与H2O2浓度具有良好的线性关系，形成一个具有大斯托克斯位移(143nm)且比率型检测H2O2的光学性能优良的体系，对H2O2的检测有较好的灵敏度和选择性。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种具有大斯托克斯位移特征的可用于过氧化氢识别的比率型近红外荧光探针HBTH及其制备方法与应用。
背景技术
过氧化氢(H2O2)是生物体内常见的活性氧物种之一，它的存在对细胞信号传导、机体免疫反应等生物体正常生理功能的实现具有重要作用。H2O2主要由线粒体呼吸链中的复合物I-IV和细胞氧化酶(如环氧合酶、NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶等)在细胞中的正常新陈代谢所产生，其在细胞中的过量积累会导致细胞氧化损伤，随后破坏蛋白质的结构使机体功能下降，从而导致阿尔兹海默症、肿瘤、心血管疾病、亨廷顿病和帕金森病等多种人类疾病。因此，H2O2的灵敏、快速检测对于上述疾病的发病机理研究具有重要意义。
H2O2的传统检测方法包括高效液相色谱法、毛细管色谱法、电化学方法以及傅里叶变换红外光谱法等。上述方法虽可实现对H2O2的检测，但往往需要较长的样品前处理时间、繁琐的检测步骤，且不适用于生物样本的检测。与传统方法相比，基于小分子荧光探针的荧光检测技术因具有操作简单、结构容易修饰、抗干扰能力较强、对细胞和组织损伤小等优点而逐渐应用于H2O2的检测中。但是，目前针对H2O2检测的荧光探针存在以下缺点：1)发射波长较短(≤650nm)，导致易受背景荧光干扰；2)斯托克斯位移较小；3)检测时间较长；4)检出限过高。近红外荧光探针因具有组织穿透能力强、可有效避免生物背景荧光干扰等优点，逐渐受到青睐。另外，与传统的单信号“off-on”型H2O2响应的荧光探针相比，比率型荧光探针能够有效消除外部环境(如仪器性能、探针浓度以及溶液极性)变化所带来的影响，提高测定的准确性。因此，开发出具有大斯托克斯位移、且对H2O2灵敏响应的比率型近红外荧光探针显得尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够快速且灵敏检测H2O2的比率型近红外荧光探针分子—HBTH。
本发明所提供的HBTH，其结构式如式I所示：
本发明的另一个目的是提供式I所示的HBTH的制备方法。
本发明所提供的HBTH的制备方法，包括如下步骤(制备流程图见图1)：
本发明所提供的制备HBTH的方法，包括如下步骤：
1)以异佛尔酮为原料合成化合物1(双氰异佛尔酮)；
2)2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛反应生成化合物HBT；
3)化合物HBT与六亚甲基四胺(HMTA)反应生成化合物HBTA；
4)将化合物HBTA和化合物1在无水乙醇中进行反应，得到固体物质HBT-OH；
5)化合物HBT-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯反应，得到式I所示的HBTH。
上述方法步骤1)中，所述以异佛尔酮为原料合成化合物1具体方法为：使异佛尔酮、丙二腈、哌啶和乙酸在氮气保护下进行反应，溶剂为无水乙醇，然后加热回流反应。所述反应中，异佛尔酮和丙二腈的摩尔比为1：1.1。所述反应的温度为90℃，反应时间为6小时。
上述方法步骤2)中，所述2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛在碘单质存在下进行反应，具体为：将2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛溶于甲醇中搅拌0.5小时，然后向体系加入碘单质，搅拌反应3小时。所述反应中，2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛的摩尔比为1：1。所述反应的温度为室温(20～25℃)，反应时间为3.5小时。
上述方法步骤3)中，所述HBT和六亚甲基四胺的反应在三氟乙酸中进行。所述反应中，HBT和六亚甲基四胺的摩尔比为1：3。所述反应的温度为90℃，反应时间为24小时。
上述方法步骤4)中，所述反应具体如下：将化合物HBTA和化合物1溶于无水乙醇，加入哌啶回流反应。所述反应中，化合物HBTA、化合物1、哌啶的摩尔比为1：1：1.5，所述反应的温度为85℃，反应时间为10小时。
上述方法步骤5)中，所述反应具体如下：将化合物HBT-OH和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯加入到含有碳酸钾的乙腈中回流进行反应。所述反应中，HBT-OH、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾的摩尔比为1：3：2。所述反应的温度为85℃，反应时间为1小时。
本发明的再一个目的是提供HBTH的用途。
本发明所提供的HBTH用途选自下述1)-7)中的至少一种：
1)由HBTH制成的荧光探针；
2)HBTH在作为荧光探针或作为检测H2O2的荧光探针中的应用；
3)含有HBTH的化学传感器；
4)HBTH在制备化学传感器或制备检测H2O2的化学传感器中的应用；
5)HBTH在检测H2O2中的应用；
6)上述1)的荧光探针在检测H2O2中的应用；
7)上述3)的化学传感器在检测H2O2中的应用。
所述荧光探针或化学传感器应用的对象可为水体，如实际水样，包括饮用水、自来水等。
本发明发明人通过实验证实：HBTH本身在537nm较强荧光发射，当HBTH与H2O2共存时，体系在680nm处出现一个新的荧光发射峰。随着H2O2浓度的增加，体系在537nm处的荧光逐渐减弱，而在680nm处的荧光逐渐增强，680nm处的荧光发射强度F680nm与537nm处的荧光发射强度F537nm的比值F680nm/F537nm与H2O2的浓度具有良好的线性关系，形成一个具有大斯托克斯位移(143nm)且比率型检测H2O2的光学性能优良的体系，对H2O2的检测有较好的灵敏度和选择性。因此，HBTH适用于H2O2的高选择性和高灵敏度的检测，该检测可以通过荧光光谱方法进行。
当采用荧光光谱法，以HBTH作为检测试剂对H2O2进行检测时，响应时间较快(15分钟)，方法检出限为2.9×10-8M，说明该传感器分子HBTH对H2O2具有很好的响应和灵敏度，优于目前已被报道的H2O2荧光检测方法的灵敏度。同时，HBTH对H2O2的荧光响应具有很好的选择性，常见离子和干扰物种(如GSH、Cys、Hcy、Fe2+、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Br-、SO3 2-、S2O3 2-、SO4 2-、HSO4 -、HCO3 -、NO3 -、NO2 -、1O2、·ON、tBuOOH、·OH和ClO-等)对H2O2的测定几乎没有干扰，因此能排除众多干扰离子和物种对检测结果的干扰，检测特异性高。另外，应用HBTH对H2O2进行检测时，由于检测灵敏度高，只需要微量的样品即可以完成，拓宽了该方法的应用范围。
附图说明
图1为HBTH的制备流程图。
图2为HBT-OH的核磁共振氢谱。
图3为HBT-OH的核磁共振碳谱。
图4为HBT-OH的高分辨质谱。
图5为HBTH的核磁共振氢谱。
图6为HBTH的核磁共振碳谱。
图7为HBTH的高分辨质谱图。
图8为HBTH与H2O2(800μM)反应前后的荧光光谱图(a)；HBTH与H2O2(800μM)共存体系以及HBTH单独存在的体系在不同pH下的荧光强度比(F680nm/F537nm)变化图(b)；不同温度下HBTH与H2O2共存体系的荧光强度比(F680nm/F537nm)变化图(c)；HBTH与不同浓度H2O2共存下的体系响应速度(d)；HBTH与不同浓度H2O2共存体系荧光光谱图(e)；HBTH与不同浓度H2O2共存体系的荧光强度比(F680nm/F537nm)关系图(f)。
图9为HBTH对H2O2检测的选择性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、化学传感器分子HBTH的制备
反应流程如图1所示，具体方法如下：
将丙二腈(660mg,10mmol)溶于20mL乙醇中，然后加入异佛尔酮(1.344mL,9.0mmol)、哌啶(0.8mmol，80μL)和乙酸(0.4mmol,46μL)，在氮气保护下90℃下回流反应6小时。反应完成后，冷却至室温(25℃)，将溶液缓慢倒入30mL蒸馏水中，有灰色固体析出，过滤得到化合物1。
向2-氨基苯硫酚(0.125g,1.0mmol)和5-甲基水杨醛(0.136g,1.0mmol)中加2mL甲醇，将反应物于室温下(25℃)搅拌0.5小时，然后加入碘(0.127g,1.0mmol)，再搅拌3小时后，过滤生成的沉淀，用冷甲醇洗涤三次，得到化合物HBT。
将化合物HBT(0.216g,1.0mmol)和六亚甲基四胺(420mg,3mmol)溶解在10mL三氟乙酸中。将混合物在90℃下加热回流，搅拌反应24小时，然后停止加热并使其冷却至室温(25℃)。将溶液用1mol/L的盐酸中和，过滤产生的沉淀并用水洗涤。利用柱层析法进行提纯，淋洗液为石油醚(沸程60～90℃)/乙酸乙酯(15:1,v/v)，得到化合物HBTA。
将HBTA(0.1345g,0.5mmol)于85℃下溶解于19mL乙醇中，加入化合物1(0.093g,0.5mmol)和哌啶(75μL)回流反应10小时。反应结束后，将反应体系置于4℃的水浴中，抽滤得到橙色固体HBT-OH。
化合物HBT-OH(87.4mg，0.2mmol)、4-溴甲基苯硼酸频那醇酯(178.2mg，0.6mmol)和K2CO3(55.3mg，0.4mmol)加入到无水乙腈(8mL)中加热至85℃回流反应1小时。冷却至室温(25℃)后，通过过滤除去固体，旋转蒸发除去溶剂，利用柱层析法进行提纯，淋洗液为石油醚(沸程60～90℃)/乙酸乙酯(12:1,v/v)，得到化合物HBTH。
HBT-OH的核磁鉴定结果：1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.98(d,J＝8.1Hz,1H)；7.92(d,J＝7.9Hz,1H)；7.56-7.52(m,2H)；7.48(d,J＝7.0Hz,2H)；7.44(t,J＝7.3Hz,1H)；7.15(d,J＝16.3Hz,1H)；6.85(s,1H)；2.60(s,2H)；2.54(s,2H)；2.39(s,3H)；1.09(s,6H).13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝169.5,169.2,154.8,154.7,151.7,132.7,131.5,130.9,130.1,129.9,128.9,127.1,126.0,124.7,123.6,122.3,121.8,117.2,113.8,113.0,78.4,43.2,39.2,32.2,28.2(2C),20.7。核磁氢谱和核磁碳谱分别见图2和图3。仪器型号：BrukerAvance 500MHz spectrometer。HBT-OH的高分辨质谱鉴定结果：m/z 438.1641[C27H24N3O3S]+(calcd.438.1640)，结果见图4。上述结果表明，所得化合物确为目标化合物HBT-OH。
HBTH的核磁鉴定结果：1H NMR(CDCl3,500MHz):δ＝8.29(s,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),7.86(d,J＝7.7Hz,2H),7.56(s,1H),7.36(d,J＝7.6Hz,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,2H),7.42(d,J＝7.6Hz,1H),7.19(d,J＝16.2Hz,1H),6.92(d,J＝16.3Hz,1H),6.77(s,1H),4.97(s,2H),2.53(s,2H),2.48(s,3H),2.03(s,2H),1.36(s,12H),0.95(s,6H).13C NMR(CDCl3,125MHz):δ＝169.3,163.0,154.2,154.0,152.3,139.6,136.2,135.3(2C),135.1,131.7,131.2,130.5,130.3,129.6,127.5,127.0(2C),126.5,125.5,124.1,123.2,121.7,113.5,112.7,84.1(2C),79.1,77.6,43.1,38.8,31.9(2C),28.0(2C),25.0(4C),21.1。核磁氢谱和核磁碳谱分别见图5和图6。仪器型号：BrukerAvance500MHzspectrometer。HBTH的高分辨质谱鉴定结果：MS:m/z654.2966[C40H41BN3O3S]+(calcd.654.2962)。结果见图7。上述结果表明，所得化合物确为目标化合物HBTH。
实施例2、HBTH作为分析试剂对H2O2进行荧光检测
1、HBTH对H2O2进行荧光检测的灵敏度
在5mL塑料EP管中，添加40μL试剂—HBTH的二甲基亚砜(DMSO)溶液(浓度1.0mM)和适量体积的质量分数为3％的H2O2水溶液，然后添加磷酸盐缓冲溶液(PBS)/乙腈的混合溶液(7:3，v/v，PBS10.0mM，pH＝7.4)，使各测试体系中的H2O2浓度分别为0、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700和800μM，HBTH的浓度为10μM。在37℃下保持15分钟后转移体系至1cm石英池中，测定反应体系的荧光光02谱。图8中(a)为HBTH对H2O2(800μM)的荧光响应图。体系的激发波长为430nm，发射波长为537nm和680nm。从图8中(a)中可以看出：HBTH本身在680nm处无荧光发射，当体系中加入H2O2后，体系在680nm处的荧光强度显著升高，而在537nm处的荧光强度明显降低，说明HBTH对H2O2具有良好的比率型荧光响应。图8中(b)为HBTH与H2O2(800μM)共存体系以及HBTH单独存在的体系在不同pH下的荧光强度比值(F680nm/F537nm)变化趋势图。从图8中(b)可以看出：当pH处于4.0～10.0范围时，HBTH单独存在时680nm处几乎无荧光，且其荧光强度比值(F680nm/F537nm)不随着pH的变化而变化。当H2O2存在条件下，体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)在pH＝7.0时最高，且在pH＝7.4时体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)仍较高，说明HBTH适用于生理条件下对H2O2的比率型荧光识别。图8中(c)为HBTH与H2O2(800μM)共存体系在不同温度下的荧光强度比值(F680nm/F537nm)变化图。从图8中(c)可以看出：在三个不同温度下(25℃、37℃和45℃)，HBTH和H2O2(10μM)共存体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)随着时间的延长逐渐升高，且同一时间下，体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)随着温度的升高而增大，说明温度可以促进H2O2与探针HBTH反应。图8中(d)为HBTH与H2O2共存体系的荧光动力学研究结果。不同H2O2浓度下(0μM、100μM、200μM、400μM和800μM)，HBTH与H2O2共存体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)在15分钟达到稳定。上述事实说明，利用HBTH对H2O2的荧光检测的最佳反应时间为15分钟。
图8中(e)和图8中(f)为HBTH与不同浓度H2O2的共存体系在537nm和680nm处荧光强度变化图和HBTH与不同浓度H2O2共存体系荧光强度比值(F680nm/F537nm)与H2O2浓度之间的关系图。如图8中(e)所示，随着H2O2浓度的提高，反应体系在537nm处的荧光强度逐渐降低，而在680nm处的荧光强度逐渐增高。从图8中(f)可以看出：在0～200μM的范围内，H2O2浓度与体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)呈线性关系，线性方程为Y＝0.0081X+0.11779，方法的检出限以3倍的空白信号的标准偏差除以标准曲线的斜率计算为2.9×10-8M。
以上结果表明，分析试剂—HBTH具有优良的性能，能够实现对H2O2的高灵敏度荧光检测。
2、HBTH对H2O2进行荧光检测的特异性
同时取若干个5mL EP管，进行上面类似的操作，只是将加入H2O2变成加入各种常见干扰离子或物质，1～22号对应的样品为：H2O2、GSH、Cys、Hcy、Fe2+、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Br-、SO3 2-、S2O3 2-、SO4 2-、HSO4 -、HCO3 -、NO3 -、NO2 -、1O2、·ON、tBuOOH、·OH、和ClO-(浓度皆为800μM)，测试结果见图9。从图9中可以看出：2～22号样品在加入800μM H2O2前，体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)未产生明显的变化。随后向2～22号体系中加入800μM H2O2，体系的荧光强度比值(F680nm/F537nm)则产生明显升高。上述现象说明：上述干扰离子的存在不会对HBTH作为分析试剂检测H2O2产生明显影响，且作为检测试剂，HBTH对H2O2的荧光检测具有很高的选择性。
3、HBTH与其他H2O2荧光探针的性能对比
将HBTH对H2O2的荧光检测性能与文献中检测H2O2荧光探针的性能进行总结和对比，结果见表1。从表1中可以看出，HBTH对H2O2的荧光检测响应速度较快。重要的是，利用HBTH对H2O2进行检测时，具有较大的斯托克斯位移(143nm)，能够有效降低背景荧光的干扰，从而提高检测灵敏度，该方法的检出限达到2.9×10-8M，优于已报道的H2O2荧光检测方法的灵敏度。
表1 HBTH与文献中H2O2荧光探针的性能对比
参考文献
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[2]Liu X.L.,Yan M.D.,Chen Z.G.,Zhang B.X.,Yao N.C.,Zhao S.,Zhao X.X.,Zhang T.,Hai G.F.A dual-site multifunctional fluorescent probe for selectivedetection of endogenous H2O2and SO2 derivatives based on ICT process and itsbioimaging application.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and BiomolecularSpectroscopy,2023,286,121955.
[3]Xu F.Y.,Tang W.,Kang S.S.,Song J.S.,Duan X.R.A highly sensitiveand photo-stable fluorescent probe for endogenous intracellular H2O2 imagingin live cancer cells.Dyes and Pigments,2018,153,61-66.
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[5]Wu Y.,Li Z.Y.,Shen Y.M.A novel ESIPT phthalimide-based fluorescentprobe for quantitatiove detection of H2O2.ACS Omega,2019,4,16242-16246.
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[8]Ge C.P.,Yang Y.,Tan P.F.,Hu S.,Jin Y.B.,Shang Y.Y.,Yang Y.,Ren F.ANIR fluorescent probe for the in vitro and in vivo selective detection ofhydrogen peroxide.Sensors and Actuators:B Chemical,2022,350,130831.
实施例3、HBTH作为分析试剂对实际水样中的H2O2进行荧光检测
为了验证HBTH作为分析试剂在H2O2荧光检测中的实用性，以HBTH开展饮用水和自来水中H2O2的荧光检测。同时取若干5mL EP管，分别向饮用水和自来水中添加适量体积的H2O2水溶液(质量分数为3％)和HBTH母液(1mM)，使得H2O2的最终浓度分别为50μM、100μM和150μM，HBTH的最终浓度为10μM。在37℃下保持15分钟后转移体系至1cm石英池中，测定反应体系的荧光信号。实际水样中H2O2的含量测定结果见表2。从表2中可以看出：HBTH对H2O2的荧光检测结果与实际样品加标量基本一致，加标回收率在方法学允许范围之内。上述结果证明HBTH可以应用于实际样品中H2O2的荧光检测。
表2 HBTH对实际样品中H2O2的检测(n＝3)
Claims (9)
1.式I所示的化合物HBTH：
式I。
2.权利要求1中所述式I所示化合物HBTH的制备方法，包括如下步骤：
1）以异佛尔酮为原料合成化合物1；
2）2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛反应生成化合物HBT；
3）化合物HBT与六亚甲基四胺反应生成化合物HBTA；
4）将化合物HBTA和化合物1在无水乙醇中进行反应，得到固体物质HBT-OH；
5）将化合物HBT-OH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯反应，得到式I所示的HBTH；
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述以异佛尔酮为原料合成化合物1具体方法为：使异佛尔酮、丙二腈、哌啶和乙酸在氮气保护下进行反应，溶剂为无水乙醇，然后加热回流反应；所述反应中，异佛尔酮和丙二腈的摩尔比为1：1.1；所述反应的温度为90℃，反应时间为6小时；
或，所述步骤2）中，所述2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛在碘单质存在下进行反应，具体为：将2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛溶于甲醇中搅拌0.5小时，然后向体系加入碘单质，搅拌反应3小时；所述反应中，2-氨基苯硫酚和5-甲基水杨醛的摩尔比为1：1；所述反应的温度为室温，反应时间为3.5小时；
或，所述步骤3）中，所述HBT和六亚甲基四胺的反应在三氟乙酸中进行；所述反应中，HBT和六亚甲基四胺的摩尔比为1：3；所述反应的温度为90℃，反应时间为24小时；
或，所述步骤4）中，所述反应具体如下：将化合物HBTA和化合物1溶于无水乙醇，加入哌啶回流反应；所述反应中，化合物HBTA、化合物1、哌啶的摩尔比为1：1：1.5，所述反应的温度为85℃，反应时间为10小时；
或，所述步骤5）中，所述反应具体如下：将化合物HBT-OH和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯加入到含有碳酸钾的乙腈中回流进行反应；所述反应中，HBT-OH、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾的摩尔比为1：3：2；所述反应的温度为85℃，反应时间为1小时。
4.化学传感器，其特征在于：所述化学传感器含有权利要求1所述的化合物HBTH。
5.权利要求1所述的化合物HBTH在检测H2O2中的应用；所述应用为非疾病诊断目的应用。
6.权利要求4所述的化学传感器在检测H2O2中的应用；所述应用为非疾病诊断目的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述化学传感器应用的对象为水体。
8.权利要求1所述的化合物HBTH在下述1）—2）中至少一种中的应用：
1）在作为荧光探针或作为检测H2O2的荧光探针中的应用；所述应用为非疾病诊断目的应用；
2）在制备检测H2O2的化学传感器中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述荧光探针或化学传感器应用的对象为水体。
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