CN109134483B - 一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。该探针分子式为C40H36N7O4 +，具有如下所示结构：
Figure DDA0001799908360000011
探针在水溶液中自身荧光为红色荧光，与少量硫化氢响应后，在535nm处荧光强度升高且在650nm处荧光强度显著增强(荧光强度比值(I551/I485)增强7.5倍)，与大量硫化氢响应后，在535nm处荧光强度升高且在650nm处荧光强度显著减少(荧光强度比值(I551/I485增强5.1倍)，并且可以通过肉眼观察探针荧光前后的变化。探针还可以通过共聚焦荧光显微镜检测活细胞中的硫化氢，并进行荧光成像。探针合成简单，并且产率较高，具有一定的潜在实用价值。

Description

一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种硫化氢荧光探针其制备方法和应用，属于硫化氢探针的制备技术领域。
背景技术
硫化氢是一种无机化合物，正常情况下是一种无色、易燃的酸性气体，浓度低时带恶臭，气味如臭蛋；浓度高时反而没有气味(因为高浓度的硫化氢可以麻痹嗅觉神经)。它能溶于水，是一种弱酸，当它受热时，硫化氢又从水里逸出。硫化氢(H2S)是继一氧化碳和一氧化氮之后，第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。硫化氢是一种急性剧毒，吸入少量高浓度硫化氢可于短时间内致命。低浓度接触仅有呼吸道及眼的局部刺激作用，高浓度时全身作用较明显，表现为中枢神经系统症状和窒息症状。该气体分子在心血管和神经系统中担负着重要的生理病理调节作用。因此，设计并合成特异性好、灵敏度高、并具有良好的生物相容性的荧光探针，能够实时准确地对生物体内的硫化氢浓度进行检测和成像对于疾病的预防、诊断、检测、治疗以及病理生理的深入研究都具有重要的指导意义。
目前，主要通过分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等检测手段来检测硫化氢。这些方法一般适用于检测水溶液和食品中的硫化氢，并不适于生物环境的硫化氢的检测，因为它们的检测灵敏度有限并且对生物样品具有破坏性。近年来，小分子有机荧光探针受到科学界的广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快等特征，并且对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时在线，形象具体地观察到信号变化。所以，发明能快速检测、易观查信号变化的硫化氢荧光探针是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速区分检测低浓度硫化氢和高浓度硫化氢的荧光探针，并进一步提供了该探针的制备方法和应用。
本发明采用以下技术方案：
一种硫化氢荧光探针，其分子式为C40H36N7O4 +，具有如下所示结构：
Figure BDA0001799908340000021
本发明的硫化氢荧光探针，对硫化氢的响应时间为20分钟左右。所述响应时间为：本发明的硫化氢荧光探针作用于含有硫化氢的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到稳定所需时间。
本发明的硫化氢荧光探针，能抗异亮氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，CH3COO-，TBNP，Cys，GSH，Hcy，NO，Al3+，Cu2+，Ca2+，K+，NO3 -，Na+，Zn2+，ONOO-，CO3 2-，OH-，PO4 3-，SCN-，SO4 2-，H2O2的干扰，特异性好。
本发明所述硫化氢荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将溴代萘酸酐1.81mmol溶解于5ml DMF中，随后加入9mmol NaN3，在N2保护下避光90℃加热回流搅拌反应2小时；然后加水抽滤得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：
Figure BDA0001799908340000022
(2)称取1mmol步骤(1)所得化合物2溶于6ml乙醇中，随后加入2mmol bete-氨基丙酸，避光80℃加热回流搅拌反应2h，然后除去反应液中的乙醇得到化合物3，化合物3的结构式如下所示：
Figure BDA0001799908340000031
(3)将1mmol8-羟基久洛尼定-9-甲醛溶于4ml 98％的浓硫酸中，随后加入1mmol对呱嗪苯乙酰，90℃加热回流搅拌反应6小时反应完毕后，加入冰水和高氯酸得到大量沉淀，减压抽滤将溶剂除去得到粗产品；以体积比为40:1的乙酸乙酯与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物4，化合物4的结构式如下所示：
Figure BDA0001799908340000032
(4)称取0.1mmol步骤(2)所得化合物3、0.2mmol步骤(3)所得化合物4、0.2mmolEDCI和0.01mmol HOBT于容器，加入3ml二氯甲烷溶解，然后在避光常温和搅拌条件下反应6小时以上，得到化合物5，化合物5即为本发明所述探针，化合物5的结构式如下所示：
Figure BDA0001799908340000033
上述制备方法中，优选的：
步骤(2)在使用化合物2之前，可以用硅胶层析柱以纯二氯甲烷为洗脱剂进一步纯化；用旋转蒸发仪除去二氯甲烷；
步骤(4)在使用化合物3之前，可以用硅胶层析柱以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化；
步骤(5)中，所得化合物5即本发明所述探针，可以用硅胶层析柱以体积比为30:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化。
本发明所述探针的合成路线如下：
Figure BDA0001799908340000041
化合物5即为本发明所述探针。
本发明所述的硫化氢荧光探针，可应用于检测水环境中的硫化氢和生物样品的硫化氢。
上述应用，具体的，包括：
观察加入硫化氢荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为445nm；
或者，在365nm光源照射下，用肉眼观察加入硫化氢荧光探针前后待测水环境的荧光变化；
或者，观察加入硫化氢荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。
所述生物环境，可以是活细胞，且为离体生物组织细胞。
所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，在535nm和650nm处的荧光峰值的变化；如果535nm处峰值和650nm处峰值变大，则说明含有少量硫化氢；如果535nm处峰值变小且650nm处峰值变大，则说明含有大量硫化氢。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。
所述荧光成像图的变化是指：加少量硫化氢时，从观察到无绿色荧光到观察到有绿色荧光，从观察到有微弱的红色荧光到观察到强的红色荧光。加入大量硫化氢时，从观察到红色荧光到观察到无红色荧光，从观察到微弱的绿色荧光到观察到很强的绿色荧光。
上述应用，具体的，包括以下步骤：
(1)将探针溶于DMF，制成探针母液；
(2)将探针母液加入到待测液中；
用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，在535nm和650nm处的荧光峰值的变化；如果535nm处峰值和650nm处峰值变大，则说明含有少量硫化氢；如果535nm处峰值变小且650nm处峰值变大，则说明含有大量硫化氢。其中，荧光光谱仪激发波长为445nm；
或者，在365nm光源照射下，待测液的荧光由红色荧光变为黄色荧光，则说明含有硫化氢；
将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发，收集500-550nm范围的荧光；观察到绿色荧光，收集673-735nm范围的荧光；观察到红色荧光，则说明含有少量硫化氢。只收集500-550nm范围的荧光；观察到绿色荧光，则说明含有大量硫化氢。
首先，水溶液中的硫化氢可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的硫化氢含量，从而定量检测。其次，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针和硫化氢的活细胞进行荧光成像，观察绿色和红色通道荧光信号的变化以达到比值检测生物环境中的硫化氢的目的。另外，利用本发明的探针，采用荧光光谱仪测试水溶液的硫化氢时，在20分钟左右荧光光谱的峰值达到稳定；具备反应时间短的优势，实现了快速检测。
本发明的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本发明实现了水溶液中硫化氢的特异性和快速检测；(3)本发明实现了活细胞水平中硫化氢的检测。
附图说明
图1是实施例1中探针的1H NMR图谱；
图2是实施例1中探针的13C NMR图谱；
图3是实施例2中探针随不同量硫化氢的加入荧光谱图的变化情况；图中，硫化氢浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μmol/L的荧光光谱；
图4是实施例2中探针随不同量硫化氢的加入荧光谱图的变化情况；图中，硫化氢浓度依次为100、150、200、300、400、500、700、900、1000、1250、1500μmol/L的荧光光谱；
图5是实施例3中探针与20eq硫化氢随时间变化的荧光强度值变化图；
图6是实施例3中探针与300eq硫化氢随时间变化的荧光强度值变化图；
图7是实施例4中探针对20eq不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白；2，异亮氨酸；3，丙氨酸；4，精氨酸；5,天冬氨酸；6，谷氨酸；7,组氨酸；8,苯丙氨酸；9,苏氨酸；10,色氨酸；11,缬氨酸；12,CH3COO-；,13，TBNP；14,Cys；15,GSH；16,Hcy；17,NO；18,Al3+；19,Cu2+；20,Ca2+；21,K+；22,NO3 -；23，Na+；24,Zn2+；25，ONOO-；26,CO3 2-；27,OH-；28,PO4 3-；29,SCN-；30，SO4 2-；31，H2O2；32，H2S；
图8是实施例4中探针对300eq不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白；2，异亮氨酸；3，丙氨酸；4，精氨酸；5,天冬氨酸；6，谷氨酸；7,组氨酸；8,苯丙氨酸；9,苏氨酸；10,色氨酸；11,缬氨酸；12,CH3COO-；,13，TBNP；14,Cys；15,GSH；16,Hcy；17,NO；18,Al3+；19,Cu2+；20,Ca2+；21,K+；22,NO3 -；23，Na+；24,Zn2+；25，ONOO-；26,CO3 2-；27,OH-；28,PO4 3-；29,SCN-；30，SO4 2-；31，H2O2；32，H2S；
图9是探针(5μM)检测HeLa细胞中硫化氢的共聚焦荧光成像图。(A1-4)是加入5μM探针孵育20分钟后的荧光成像，随后加入(B1-4)25，(C1-4)50，D1-4)75，或(E1-4)100μmol/L硫化氢继续培育20分钟后的荧光成像；(A1-E1)，明场和绿色通道、红色通道成像叠加图；(A2-E2)，绿色通道成像；(A3-E3)，红色通道；(A4-E4)，绿色比红色比率成像；激发波长为445nm，标尺为20微米。
图10，探针(5μM)检测HeLa细胞中硫化氢的共聚焦荧光成像图。是加入5μM探针孵育20分钟后的荧光成像，随后加入(A1-4)100，(B1-4)200，(C1-4)400，D1-4)600，或(E1-4)1000μmol/L硫化氢继续培育20分钟后的荧光成像；(A1-E1)，明场和绿色通道、红色通道成像叠加图；(A2-E2)，绿色通道成像；(A3-E3)，红色通道；(A4-E4)，绿色比红色比率成像；激发波长为445nm，标尺为20微米。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
实施例1
化合物2的合成：
将溴代萘酸酐1.81mmol溶解于5mlDMF中，随后加入9mmolNaN3，在N2保护下避光90℃加热回流搅拌反应2小时；然后加水抽滤得到化合物2。以纯二氯甲烷为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到720mg淡黄色固体(产率为70％)，即为化合物2。化合物2的合成路线如下所示：
Figure BDA0001799908340000071
化合物3的合成：
将239mg化合物2(1mmol)溶于6ml乙醇中，随后加入178mmol bete-氨基丙酸(2mmol)，避光80℃加热回流搅反应2h，反应完毕后，减压抽滤将溶剂(乙醇)除去得到粗产品。以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化得到290mg淡黄色固体(产率70％)，即为化合物3。化合物3的合成路线如下所示：
Figure BDA0001799908340000072
化合物4的合成：
将1mmo化合物6，即l8-羟基久洛尼定-9-甲醛溶于浓硫酸中，随后加入1mmol化合物7，即对呱嗪苯乙酰，90℃加热回流搅拌反应6小时反应完毕后，加入冰水和高氯酸得到大量沉淀，减压抽滤将溶剂除去得到粗产品；以体积比为40:1的乙酸乙酯与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化得到320mg紫色固体(产率76％)，即为化合物4，化合物4的合成路线如下所示：
Figure BDA0001799908340000081
探针的合成：
取31mg化合物3(0.1mmol)、65mg化合物4(0.2mmol)、32.5mg EDCI(0.2mmol)和10.5mg HOBT(0.01mmol)置于圆底烧瓶中，加入3mL二氯甲烷(溶剂)使反应物完全溶解，在避光、氮气保护和常温下搅拌反应过夜(6h以上)，反应完毕。待反应完毕后，通过旋转蒸发仪除去溶剂二氯甲烷。最后以体积比为30:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到49mg紫色固体(产率为51％)。所得紫色固体即为探针。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.23(s,4H),1.94-2.01(d,J＝27.6Hz,4H),2.76-2.80(t,J＝7.6Hz,2H),2.84-2.86(t,J＝5.2Hz,2H),2.96-2.99(t,J＝5.6Hz,2H),3.56-3.63(d,J＝28.4Hz,8H),4.24-4.28(t,J＝8.0Hz,2H),7.11-7.14(d,J＝9.2Hz,2H),7.48(s,1H),7.72-7.74(d,J＝8.0Hz,2H),7.78-7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.84-7.88(d,J＝8.0Hz,1H),8.05-8.08(t,J＝8.8Hz,2H),8.37-8.43(dd,J＝14.0Hz,8.4Hz,2H),8.45-8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.51-8.53(d,J＝7.2Hz,1H)；13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.93,17.22,18.57,19.28,19.46,20.30,27.45,31.44,36.74,42.32,44.50,46.12,46.43,50.37,50.86,54.09,104.89,107.17,114.20,116.29,117.19,118.42,122.42,123.86,127.24,127.70,128.61,128.82,130.09,131.98,143.26,146.08,151.72,152.97,154.20,163.07,163.53,165.26,169.35。探针的合成路线如下：
Figure BDA0001799908340000082
实施例2
探针与不同当量硫化氢反应的荧光光谱变化。
取实施例1制备的探针溶于DMF中，制成浓度为1.0mmol/L探针母液(探针的浓度为1.0mmol/L)；称取38.9mgNa2S加入4.98ml蒸馏水中，配制成硫化钠浓度为1 00mmol/L的硫化钠母液。从探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，加入不同当量(0-100eq)的硫化钠母液(所述当量是指硫化钠母液中硫化钠的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数)，用720μLDMF和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含25％DMF的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量硫化氢反应液的荧光光谱变化(激发波长为445nm)，荧光光谱变化情况如图3所示。由图3和图4可见，随着硫化氢加入当量的逐渐增加，探针溶液在530nm处的荧光峰值逐渐增强且在650nm处的荧光峰值也逐渐增强。当荧光强度达到稳定时，比探针空白液的荧光强度比值(I551/I485)增强7.5倍。继续加入硫化氢，探针溶液在530nm处的荧光峰值逐渐增强且在650nm处的荧光峰值也逐渐降低。比探针空白液的荧光强度比值(I551/I485)增强5.1倍。实验结果说明探针可以通过荧光光谱仪检测水溶液中的硫化氢。
实施例3
探针与硫化氢随时间变化的荧光变化。
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，加入60μL浓度为10mmol/L的硫化氢母液，再720μL DMF和2.25mL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH7.4)稀释至3mL，配制成探针浓度为10μmol/L，硫化氢浓度为0.2mmol/L，含25％DMF的测试溶液。用445nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。由图5可见，随着时间增加，535nm处的荧光强度逐渐变大且650nm处的荧光强度逐渐变大，并且在20分钟左右达到稳定值。再次从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，加入90μL浓度为100mmol/L的硫化氢母液，再720μLDMF和2.25mL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配制成探针浓度为10μmol/L，硫化氢浓度为3mmol/L，含25％DMF的测试溶液。由图6可见，随着时间增加，535nm处的荧光强度逐渐变大且650nm处的荧光强度逐渐变小，并且在20分钟左右达到稳定值。
实施例4
探针对不同干扰分析物的选择性研究。
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，分别加入以下不同浓度的分析物：100μmol/L和1500μmol/L的异亮氨酸,丙氨酸,精氨酸,天冬氨酸，谷氨酸,组氨酸,苯丙氨酸,苏氨酸,色氨酸,缬氨酸,CH3COO-,TBNP,Cys,GSH,Hcy,NO,Al3+,Cu2+,Ca2+,K+,NO3-,Na+,Zn2+,ONOO-,CO3 2-,OH-,PO4 3-,SCN-,SO4 2-,H2O2。用720μLDMF和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含25％DMF的测试溶液。反应20分钟后检测测试液的荧光光谱变化。由图7和图8可以发现，相对于空白测试液，加入各种干扰物的测试液荧光强度没有明显变化。然而，加入硫化氢的测试液的荧光强度发生了显著变化。实验结果说明探针对硫化氢具有良好的选择性。
实施例5
探针与细胞中硫化氢的荧光成像。
从实施例2中荧光探针母液中取出10μL加入到育有HeLa细胞的培养皿(含1mL PBS培养基)中，探针浓度为5μmol/L，孵育20分钟，作为控制组；在其中一组控制组样品中分别加入25、50、75、100、200、400、600、1000μmol/L的硫化氢，继续孵育20分钟，作为实验组。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，使用激发波长为405nm的光源激发，收集绿色和红色通道的荧光，结果如图9和图10所示。在控制组的荧光成像中，能观察到强红色荧光而几乎观察不到绿色荧光；然而，在第一组实验组中，可以观察到红光荧光小幅度增强而绿色荧光明显增强。在第二组实验组中，可以观察到红光荧光明显减小而绿色荧光明显增强。实验结果说明探针可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的硫化氢，具有潜在的实际应用价值。
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种硫化氢荧光探针，其特征在于，其分子式为C40H36N7O4 +，具有如下所示结构：
Figure FDA0002730167740000011
2.一种权利要求1所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将溴代萘酸酐1.81mmol溶解于5ml DMF中，随后加入9mmol NaN3，在N2保护下避光90℃加热至回流搅拌反应2小时；然后加水抽滤得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：
Figure FDA0002730167740000012
(2)称取1mmol步骤(1)所得化合物2溶于6ml乙醇中，随后加入2mmol bete-氨基丙酸，避光80℃加热回流搅拌反应2h，然后除去反应液中的乙醇得到化合物3，化合物3的结构式如下所示：
Figure FDA0002730167740000013
(3)将1mmol8-羟基久洛尼定-9-甲醛溶于4ml 98％的浓硫酸中，随后加入1mmol对呱嗪苯乙酰，90℃加热回流搅拌反应6小时，反应完毕后，加入冰水和高氯酸得到大量沉淀，减压抽滤将溶剂除去得到粗产品；以体积比为40:1的乙酸乙酯与甲醇为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化得到化合物4，化合物4的结构式如下所示：
Figure FDA0002730167740000021
(4)称取0.1mmol步骤(2)所得化合物3、0.2mmol步骤(3)所得化合物4、0.2mmol EDCI和0.01mmol HOBT于容器中，加入3ml二氯甲烷溶解，然后在避光常温和搅拌条件下反应6小时以上，得到化合物5，化合物5即为本发明所述探针，化合物5的结构式如下所示：
Figure FDA0002730167740000022
3.根据权利要求2所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)在使用化合物2之前，用硅胶层析柱以纯二氯甲烷为洗脱剂进一步纯化。
4.根据权利要求2所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)在使用化合物3之前，用硅胶层析柱以体积比为20:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化。
5.根据权利要求2所述硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所得探针用硅胶层析柱以体积比为30:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂进一步纯化。
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