CN108997326B - 一种硫醇荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种硫醇荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种硫醇荧光探针及其制备方法和应用。该探针分子式为C29H20N4O9S2，具有如下所示结构：
Figure DDA0001788052040000011
本发明探针在水溶液中自身荧光非常弱，与硫醇响应后，在551nm处荧光强度显著增强，并且可以通过肉眼观察探针荧光前后的变化。本发明探针检测下限分别为4.21×10‑7mol/L(Cys)，5.17×10‑ 7mol/L(Hcy)，3.76×10‑7mol/L(GSH)，2.22×10‑7mol/L(H2S)。本发明探针合成简单，产率高，实现了水溶液中不同硫醇的特异性和快速检测。

Description

一种硫醇荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种硫醇荧光探针其制备方法和应用，属于活性硫探针的制备技术领域。
背景技术
活性硫物质(RSS)，包括小分子生物硫醇和气体硫化氢，是人体内起着重要生理作用的一类生物活性分子。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是最常见的三种小分子生物硫醇，它们有着截然不同的生物和药理作用，同时相互之间又存在着密切联系。Cys是乙酰辅酶、牛磺酸和GSH的前体，同时还能与铁离子形成硫铁络合物。但异常水平的Cys通常会引起生长缓慢、嗜睡、肝功能损伤、肥胖等疾病。过高浓度的Hcy则可能诱导心血管病和阿尔茨海默氏症，在血浆中Hcy的总浓度还与某些先天性疾病和老年认知障碍有关。GSH是细胞中浓度最大的非蛋白硫醇(1-10mM)，以还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式存在。它参与了众多生理活动，例如氧化还原反应、异物代谢、信号传导与基因调控等，在细胞生长和维持细胞氧化还原平衡上起着关键作用。GSH还是一种抗氧化剂，可以保护巯基蛋白和酶免遭氧化，维持活性。然而，浓度异常的GSH往往与癌症、阿尔茨海默氏症和心血管等疾病有关。因此，发展能区分识别硫醇的荧光探针对研究生命体系中硫醇之间的生理联系和它们的生理功能意义重大，也有助于探索硫醇相关疾病的发生发展机制以及研究治疗相关疾病的药物。
目前，主要通过分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等检测手段来检测硫醇。这些方法一般适用于检测水溶液和食品中的硫醇，并不适于生物环境的硫醇的检测，因为它们的检测灵敏度有限并且对生物样品具有破坏性。近年来，由于小分子有机荧光探针具有高选择性、高灵敏度、操作方便、无创性检测等优点，从而受到了包括生命科学、医学、药理学、分析化学等各个领域等广泛关注。特别是在分析检测生物样品中，荧光探针更能体现其优势。荧光探针能对生物样品中目标分子进行非侵入性成像检测，可以实时观察到荧光探针识别目标分子前后的光学信号变化，并且能将这些信号转换成具体的图片信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速检测硫醇的增强型荧光探针，并进一步提供了该探针的制备方法和应用。
本发明采用以下技术方案：
一种硫醇荧光探针，其分子式为C29H20N4O9S2，具有如下所示结构：
Figure BDA0001788052020000021
本发明所述硫醇荧光探针，对硫醇的响应时间为2分钟左右。所述响应时间为：本发明的硫醇荧光探针作用于含有硫醇的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到稳定所需时间。
本发明所述硫醇荧光探针，能抗Br-，AcO-，NO3 -，PO4 3-，CO3 2-，SO4 2-，K+，Na+，Ca2+，Cu2 +，Al3+，OH-，H2O2，O2 -，BuO-，ONOO-，NO，HCO3 -，HSO4 -和苯并氨酸、丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和组氨酸的干扰。特异性好。
本发明所述硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将溴代萘酸酐2.77g溶解于15ml乙醇中，随后加入1.09g正丁胺，加热至80℃回流，搅拌反应0.5小时，然后除去反应液中的乙醇得到化合物1，化合物1的结构式如下所示：
Figure BDA0001788052020000022
(2)将996.6mg化合物1和587mgN-羟基邻苯二甲酰亚胺、622mg碳酸钾混合后用DMSO溶解，然后在80℃条件下反应6小时，反应完毕后，通过加盐酸调pH至产生沉淀，除去溶剂DMSO得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：
Figure BDA0001788052020000031
(3)将673mg化合物2和350mg乌洛托品混合后用三氟乙酸溶解，然后在90℃条件下反应6小时；反应完毕后，通过加氢氧化钠调pH至产生沉淀，除去溶剂三氟乙酸得到化合物3，化合物3的结构式如下所示：
Figure BDA0001788052020000032
(4)将297mg化合物3和150mg2-氨基苯硫酚、380mg焦二亚硫酸钠混合后用DMF溶解，然后在140℃条件下反应2小时，反应完毕后，除去溶剂DMF得到化合物4，化合物4的结构式如下所示：
Figure BDA0001788052020000033
(5)将100.5mg化合物4和73mg2，4-二硝基苯磺酰氯、28mg三乙胺混合后用DCM溶解，然后在室温条件下搅拌反应6小时，反应结束后，除去溶剂DCM，得到化合物5，化合物5即为本发明所述探针，化合物5的结构式如下所示：
Figure BDA0001788052020000041
优选的，步骤(1)中正丁胺的加入方式为滴加；步骤(1)中采用抽滤方法除去反应液中的乙醇。
优选的，步骤(2)在反应完毕后加盐酸调pH至产生大量沉淀，采用抽滤方法除去反应液中的DMSO。
优选的，步骤(3)在反应完毕后加氢氧化钠调pH至产生大量沉淀，采用抽滤方法除去反应液中的CF3COOH。
优选的，步骤(4)在反应完毕后采用抽滤方法除去反应液中的DMF。
优选的，步骤(5)在反应完毕后用旋转蒸发仪除去二氯甲烷。
优选的，步骤(5)得到所述化合物5后，即本发明所述探针，可以用硅胶层析柱以体积比为3:1的二氯甲烷与石油醚为洗脱剂进一步纯化。
本发明所述探针的合成路线如下：
Figure BDA0001788052020000042
化合物5即为本发明所述探针。
本发明制备的硫醇荧光探针的应用，是用于检测水环境中的硫醇和生物样品的硫醇。
上述应用，具体的，包括：
观察加入硫醇荧光探针前后待测水环境的荧光光谱的变化；荧光激发波长为455nm；
或者，观察加入硫醇荧光探针前后待测生物环境的荧光成像图的变化。
所述生物环境，可以是活细胞。
所述荧光光谱的变化是指：荧光光谱中，在551nm处的荧光峰值的变化；如果551nm处峰值变大，则说明含有硫醇。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。
所述荧光成像图的变化是指：从观察到微弱荧光到观察到绿色色荧光。优选的，采用细胞成像显微镜观察荧光变化。
上述应用，具体的，包括以下步骤：
(1)将探针溶于DMF，制成探针母液；
(2)将探针母液加入到待测液中；
用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，在551nm处的荧光峰值的变化；如果551nm处的荧光峰值变大，则说明含有硫醇；其中，荧光光谱仪激发波长为455nm；
(3)将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为405nm的光源激发，收集绿色通道的荧光；观察到微弱荧光变成较强绿色荧光，则说明含有硫醇。
首先，水溶液中的硫醇可以引起荧光探针的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的硫醇含量，从而定量检测；其检测下限分别为4.21×10-7mol/L(Cys)，5.17×10-7mol/L(Hcy)，3.76×10-7mol/L(GSH)，2.22×10-7mol/L(H2S)。其次，通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针和不同硫醇的活细胞进行荧光成像，观察绿色通道荧光信号的变化以达到检测生物环境中的硫醇的目的。另外，利用本发明的探针，采用荧光光谱仪测试水溶液的硫醇时，在2分钟左右荧光光谱的峰值达到稳定；具备反应时间短的优势，实现了快速检测。
本发明的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本发明实现了水溶液中不同硫醇的特异性和快速检测；(3)本发明实现了活细胞水平中不同硫醇的检测。
附图说明
图1是实施例1中化合物4的1H NMR图谱；
图2是实施例1中化合物4的13C NMR图谱；
图3是实施例1中探针化合物的1H NMR图谱；
图4是实施例1中探针化合物的13C NMR图谱；
图5是实施例2中探针化合物随不同量Cys的加入荧光谱图的变化情况；图中，Cys浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、70、100、150、200、250、300μmol/L的荧光光谱；
图6是实施例2中探针化合物随不同量Hcy的加入荧光谱图的变化情况；图中，Hcy浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、70、100、150、200、250、300μmol/L的荧光光谱；
图7是实施例2中探针化合物随不同量GSH的加入荧光谱图的变化情况；图中，GSH浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、70、100、150、200、250、300μmol/L的荧光光谱；
图8是实施例2中探针化合物随不同量H2S的加入荧光谱图的变化情况；图中，H2S浓度依次为0、5、10、20、30、40、50、70、100、150、200μmol/L的荧光光谱；
图9是实施例4中探针化合物与硫醇随时间变化的荧光强度值变化图；
图10是实施例5中探针化合物对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白；2，Ala；3，Arg；4，Asp；5，Glu；6，His；7，Ser；8，Thr；9，Val；10，Ile；11，Phe；12，Trp；13，Hcy；14，GSH；15，Cys；16，Br-；17，AcO-；18，NO3 -；19，S2-；20，PO4 3-；21，CO3 2-；22，SO4 2-；23，K+；24，Na+；25，Ca2+；26，Cu2+；27，Al3+；28，OH-；29，H2O2；30，O2 -；31，BuO-；32，ONOO-；33，NO；34，HCO3 -；35，HSO4 -。
图11是实施例6中探针化合物与HeLa细胞中硫醇响应的荧光成像图；图中，(A1-3)是加入5μM探针化合物孵育30分钟后的荧光成像，随后加入(F1-3)NEM和(B1-3)Cys，(C1-3)Hcy，(D1-3)GSH或(E1-3)H2S继续培育30分钟后的荧光成像；(A1-F1)，明场成像图；(A2-F2)，绿色通道成像；激发波长为405nm，标尺为25微米。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
实施例1
化合物1的合成：
将2.77g化合物溴代萘酸酐(Nap)1.0mol与1.09g正丁胺1.5mol溶于15mL乙醇中，80℃下回流反应0.5小时。反应完毕后，减压抽滤将溶剂(乙醇)除去得到2.9g淡黄色固体(产率为82％)，即为化合物1。化合物1的合成路线如下所示：
Figure BDA0001788052020000071
化合物2的合成：
将996.6mg化合物1(3.0mmol)、587mg N-羟基邻苯二甲酰亚胺(3.6mmol)和622mg碳酸钾(4.5mmol)溶解于二甲基亚砜中，80℃下回流反应6小时。反应完毕后，通过加盐酸调pH至产生沉淀，抽滤将溶剂(DMSO)除去得到320mg黄色固体(产率为41％)，即为化合物2,。化合物2的合成路线如下所示：
Figure BDA0001788052020000072
化合物3的合成：
将673mg化合物2(1.5mmol)与350mg乌洛托品(HMT)(1.5mmol)溶解于三氟乙酸中，90℃下回流反应6小时。反应完毕后，通过加氢氧化钠调pH至产生沉淀，抽滤将溶剂(CF3COOH)除去，得到255mg黄色固体(产率为39％)，即为化合物3。化合物3的合成路线如下所示：
Figure BDA0001788052020000081
化合物4的合成：
将297mg化合物3(1.0mmol)、150mg 2-氨基苯硫酚(1.2mmol)与380mg焦二亚硫酸钠(2.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，140℃下回流反应2小时。反应完毕后，加水抽滤将溶剂(DMF)除去，得到118mg黄色固体(产率为46％)。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):1.00-1.04(t,J＝7.2Hz,3H),1.46-1.52(q,J＝7.6Hz,2H),1.71-1.79(m,2H),4.17-4.21(t,J＝8Hz,2H),7.45-7.49(t,J＝8Hz,1H),7.53-7.57(t,J＝8.4Hz,1H),7.74-7.78(t,J＝7.6Hz,1H),7.95-8.00(dd,J1＝14Hz,J2＝8.4Hz,2H),8.62-8.64(d,J＝8.4Hz,1H),8.74-8.76(d,J＝8.4Hz,1H),8.78(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm):13.87,20.42,29.70,30.26,40.19,111.49,114.01,120.82,121.84,122.53,123.35,125.96,126.39,127.11,130.05,130.89,132.28,132.83,150.88,160.81,163.37,163.91,168.54。化合物4的合成路线如下所示：
Figure BDA0001788052020000082
探针化合物的合成：
取100.5mg化合物4(0.25mmol)、73mg 2,4-二硝基苯磺酰氯(0.275mmol)与28mg三乙胺(0.275mmol)置于圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷(溶剂)使反应物完全溶解，室温条件下搅拌反应6h，反应完毕。待反应完毕后，通过旋转蒸发仪除去溶剂二氯甲烷。最后以体积比为3:1的二氯甲烷与石油醚为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到71mg黄色固体(产率为68％)。所得淡黄色固体即为探针化合物。1HNMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):1.00-1.04(t,J＝7.2Hz,3H),1.46-1.52(q,J＝7.6Hz,2H),1.74-1.78(m,2H),4.22-4.26(t,J＝7.6Hz,2H),7.38-7.42(t,J＝8.4Hz,1H),7.46-7.50(t,J＝7.6Hz,1H),7.73-7.75(d,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.84(m,3H),8.03-8.07(t,J＝7.6Hz,1H),8.40-8.41(d,J＝2.4Hz,1H),8.76-8.81(dd,J1＝13.6Hz,J2＝7.2Hz,2H),8.91(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm):6.53,15.88,16.34,26.77,106.07,107.74,19.13,109.25,109.92,111.88,112.27,112.97,113.26,113.71,115.58,115.65,115.89,118.07,118.54,119.48,120.72,122.01,133.46,135.64,139.07,147.33,148.66,149.48。化合物5，即本发明所述探针化合物的合成路线如下所示：
Figure BDA0001788052020000091
实施例2
探针化合物与不同当量硫醇反应的荧光光谱变化。
取实施例1制备的探针化合物溶于DMF中，制成浓度为1.0mmol/L探针母液(探针化合物的浓度为1.0mmol/L)；将质量分数为30％的不同硫醇(Cys/Hcy/GSH/H2S)溶液加入蒸馏水，分别配制成浓度为100mmol/L的Cys/Hcy/GSH/H2S母液。从探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，加入不同当量(0-30eq)的Cys/Hcy/GSH/H2S母液(所述当量是指Cys/Hcy/GSH/H2S母液中Cys/Hcy/GSH/H2S的摩尔数相对于探针母液中探针的摩尔数的倍数)，用570μL乙醇和2400μL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％乙醇的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量Cys/Hcy/GSH/H2S反应液的荧光光谱变化(激发波长为455nm)，荧光光谱变化情况如图5,6,7,8所示。由图5,6,7,8可见，随着Cys/Hcy/GSH/H2S加入当量的逐渐增加，探针化合物溶液在551nm处的荧光峰值逐渐增强。当荧光强度达到稳定时，比探针空白液的荧光强度分别增强12.3/8.29/22.8/20.6倍。实验结果说明探针化合物可以通过荧光光谱仪检测水溶液中的硫醇Cys/Hcy/GSH/H2S。
实施例3
探针化合物与不同硫醇响应随时间变化的荧光变化。
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，分别加入60μL浓度为5mmol/L的Cys/Hcy/GSH/H2S母液，再用570μL乙醇和2.4mL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配制成探针浓度为10μmol/L，硫醇浓度为0.3mmol/L，含20％乙醇的测试溶液。用455nm的激发波长，测试其随时间变化的荧光光谱。由图9可见，随着时间增加，551nm处的荧光强度逐渐变大，并且分别在1/2/2/2分钟左右达到稳定值。
实施例4
探针化合物对不同干扰分析物的选择性研究。
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到3mL的离心管当中，分别加入以下不同浓度的分析物：100μmol/L的Ala，Arg，Asp，Glu，His，Ser，Thr，Val，Ile，Phe，Trp，Hcy，GSH，Cys，Br-，AcO-，NO3 -，S2-，PO4 3-，CO3 2-，SO4 2-，K+，Na+，Ca2+，Cu2+，Al3+，OH-，H2O2，O2 -，BuO-，ONOO-，NO，HCO3 -，HSO4 -。用570μL乙醇和2400μL的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％乙醇的测试溶液。反应5分钟后检测测试液的荧光光谱变化。由图10可以发现，相对于空白测试液，加入各种干扰物的测试液荧光强度没有明显变化。然而，加入硫醇的测试液的荧光强度发生了显著变化。实验结果说明探针化合物对硫醇具有良好的选择性。
实施例4
探针化合物与细胞中硫醇的荧光成像。
从实施例2中荧光探针母液中取出10μL加入到育有HeLa细胞的培养皿(含1mL PBS培养基)中，探针浓度为5μmol/L，孵育30分钟，作为控制组；在其中一组控制组样品中分别加入Cys/Hcy/GSH/H2S，继续孵育30分钟，作为实验组。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，使用激发波长为405nm的光源激发，收集绿色通道的荧光，结果如图11所示。在控制组的荧光成像中，几乎观察不到绿色荧光；然而，在实验组中，可以观察到绿色荧光明显增强。实验结果说明探针化合物可以通过共聚焦显微镜检测细胞环境中的硫醇，具有潜在的实际应用价值。
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种硫醇荧光探针，其特征在于，其分子式为C29H20N4 O9S2，具有如下所示结构：
Figure 9939DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种权利要求1所述硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将溴代萘酸酐2.77g溶解于15ml乙醇中，随后加入1.09g正丁胺，加热至80℃回流，搅拌反应0.5小时，反应完毕后，除去反应液中的乙醇得到化合物1，化合物1的结构式如下所示：
Figure 73710DEST_PATH_IMAGE002
；
（2）将996.6mg化合物1和587mgN-羟基邻苯二甲酰亚胺、622mg碳酸钾混合后用DMSO溶解，然后在80℃条件下反应6小时，反应完毕后，通过加盐酸调pH至产生沉淀，除去溶剂DMSO得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：
Figure 538189DEST_PATH_IMAGE003
；
（3）将673mg化合物2和350mg乌洛托品混合后用三氟乙酸溶解，然后在90℃条件下反应6小时，反应完毕后，通过加氢氧化钠调pH至产生沉淀，除去溶剂三氟乙酸得到化合物3，化合物3的结构式如下所示：
Figure 488959DEST_PATH_IMAGE004
；
（4）将297mg化合物3和150mg2-氨基苯硫酚、380mg焦二亚硫酸钠混合后用DMF溶解，然后在140℃条件下反应2小时，反应完毕后除去溶剂DMF，得到化合物4，化合物4的结构式如下所示：
Figure 810219DEST_PATH_IMAGE005
；
（5）将100.5mg化合物4和73mg2，4-二硝基苯磺酰氯、28mg三乙胺混合后用DCM溶解，然后在室温条件下搅拌反应6小时，反应完毕后除去溶剂DCM得到化合物5，化合物5的结构式如下所示：
Figure 95707DEST_PATH_IMAGE006
。
3.一种权利要求1所述的硫醇荧光探针的应用，其特征在于，用于检测水环境中的硫醇和生物样品的硫醇。
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