CN111334078B - 一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 - Google Patents

一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法。该荧光染料为基于萘酰亚胺，通过对供电基团的调节设计合成的一系列匹配405nm激光的高亮度、高稳定性的荧光染料。该系列染料含有两类DF 405荧光染料，第一类为4‑位单取代萘酰亚胺类染料；第二类为4,5‑位双取代萘酰亚胺类染料。其中，第一类染料荧光斯托克斯位移大(>80nm)，水中荧光量子产率大于0.80，且由于衍生、功能化。第二类染料半峰宽小于50nm，水荧光量子产率大于0.6。此外，此系列染料光稳定得到大幅提升，对pH(3‑11)、黏度、温度等微环境变化极不敏感，能够在生物体内复杂环境中提供可靠的荧光信号更，在生物成像、检测等领域有较好应用前景。

Description

一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法
技术领域
本发明属荧光染料领域，具体涉及一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法。
背景技术
由于有机小分子荧光染料的荧光发射光谱广泛、尺寸小、易改造等特点，其已经成为光学显微成像及光学检测的重要工具。然而，光学显微成像技术的革新也对有机小分子荧光染料的荧光亮度、稳定性提出了更高的要求；单分子检测的精准性也很大程度决定于染料分子的信号的真实性。因此，荧光染料的改进及荧光性能的提升迫在眉睫。
Alexa 405与太平洋蓝是405nm激发下应用最为广泛的荧光染料。其中，Alexa 405是8-羟基-1,3,6-芘三磺酸三钠衍生物，太平洋蓝是7-羟基香豆素类衍生物。但是，由于芘激基缔合物的形成导致Alexa 405对极性等微环境存在较强敏感性，导致荧光信号的准确性降低。7-羟基香豆素类化合物强荧光态为氧负离子，这导致这类化合物稳定性较差，同时pH对荧光影响明显，弱酸性条件下即出现荧光淬灭。因此，405nm的荧光染料仍然极为匮乏，缺乏适用于对荧光稳定性要求更高、荧光信号要求更为准确的超分辨成像以及单分子检测等领域的荧光染料。
发明内容
本发明的目的是提供一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法。
一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，该系列染料荧光量子产率在水溶达到0.80以上，对pH等微环境均不敏感。
一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，该方法具有操作简单、提纯容易、原料价廉等优点。
本发明提供一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，以萘酰亚胺为荧光团，通过对供电基团的调节设计合成了两类DF 405荧光染料，第一类为4-位单取代萘酰亚胺类染料；第二类为4,5-位双取代萘酰亚胺类染料。第一类染料荧光斯托克斯位移大(>80nm)，水中荧光量子产率>0.80，且由于衍生、功能化。第二类染料半峰宽<50nm，水荧光量子产率>0.6。
一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，该系列荧光染料具有如下结构：
Figure BDA0001910641110000021
其中，n为1,2,3,4等整数，m为0,1,2；R1,R2分别为H,C1-C4烷基。
一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法第一类荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910641110000031
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于四氢呋喃中，并在0℃下向该反应液中滴加氯取代烷基酰氯；滴加完毕后将混合液转移至室温反应6-10h。减压除去溶剂后，去离子水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼并用甲醇洗涤，真空干燥得N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物；
(2)染料N-丁基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物，溶于乙腈中，并向其中加入碳酸钾。将反应液缓慢升温至50-90℃，并持续反应1-3h。减压除去溶剂，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比为200～800:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-丁基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物。
步骤(1)中，N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与四氢呋喃的体积比为2-25:1mg/mL；
氯取代烷基酰氯与四氢呋喃体积比为1:10-80、
氯取代烷基酰氯与去离子水体积比为1:5-50、
氯取代烷基酰氯与甲醇的体积比为1:10-20。
步骤(2)中，N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物与碳酸钾质量比1:1-4；碳酸钾的质量与乙腈的体积比为10-20:1mg/mL。
一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，第二类荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910641110000041
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、丁胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-12h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚＝或体积比为50～200：1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)染料N-丁基-4,5-二烷氧基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将多元醇溶于干燥的四氢呋喃中，鼓吹氮气下加入Na块，0.5-1h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺并加热至60-90℃,2-10h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:1～4的二氯甲烷和石油醚＝为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体N-丁基-4,5-二烷氧基-1,8-萘酰亚胺。
步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、丁胺的质量比为2-4:1；丁胺的质量与乙醇的体积比为10-20:1mg/mL。
步骤(2)中，多元醇、钠块的质量比为2-1:1；多元醇、N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量比为2:1-12；多元醇的质量与四氢呋喃的体积比为1-10:1mg/mL。
上述一系列405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料荧光量子产率高，且对多种微环境均表现出不敏感性。
一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料在荧光标记、荧光成像领域中的应用。
本发明具有以下特点：
本发明涉及的染料拥有合成原料低价、方法简单且便于功能化、修饰等优点。
本发明涉及的染料在不同有机溶剂中吸收波长在405nm左右，水中荧光量子产率高。第一类为4-位环酰胺基取代萘酰亚胺类染料，荧光斯托克斯位移大(>80nm)，水中荧光量子产率>0.80；第二类为4,5-位双烷氧基取代萘酰亚胺类染料，半峰宽<50nm，水荧光量子产率>0.6。
本发明涉及的染料能够对为环境中pH等微环境保持不敏感性，保持高的荧光亮度，能够应用于荧光成像及荧光检测领域中。
附图说明
图1实施例1制备的PAm的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的PAm的核磁谱图碳谱。
图3实施例2制备的BAm的核磁谱图氢谱。
图4实施例2制备的BAm的核磁谱图碳谱。
图5实施例4制备的OEOAN的核磁谱图氢谱。
图6实施例4制备的OEOAN的核磁谱图碳谱。
图7实施例1制备的PAm在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图8实施例1制备的PAm在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图9实施例1制备的PAm在不同pH下的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；插图为470nm下荧光强度随pH变化曲线图。
图10实施例4制备的OEOAN在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图11实施例4制备的OEOAN在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图12实施例4制备的OEOAN在不同pH下的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；插图为470nm下荧光强度随pH变化曲线图。
图13实施例1制备的PAm在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
实施例1
中间体N-丁基-4-(3-氯)丙酰胺基-1,8萘酰亚胺(ClPAm)的合成：
Figure BDA0001910641110000061
将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺(200mg,0.75mmol)溶于100mL四氢呋喃中，在0℃下向该反应液中滴加1.25mL 3-氯丙酰氯。滴加完毕后将混合液转移至室温反应6h。减压除去溶剂后，60mL水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼，用25mL甲醇洗涤滤饼，真空干燥得N-丁基-4-(3-氯)丙酰胺基-1,8-萘酰亚胺180mg，产率67％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ8.91(s,1H),8.59(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.54(d,J＝8.1Hz,1H),8.52–8.48(m,1H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),4.15–4.10(m,2H),3.98(t,J＝6.3Hz,2H),3.08(t,J＝6.3Hz,2H),1.69(dt,J＝7.7,6.6Hz,2H),1.44(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
染料N-丁基-4-环丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(PAm)的合成：
Figure BDA0001910641110000071
将N-丁基-4-(3-氯)丙酰胺基-1,8萘酰亚胺(100mg,0.28mmol)，溶于10mL乙腈中，并向其中加入碳酸钾100mg。反应液缓慢升温至50℃，并在此温度持续反应3h。减压除去溶剂，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1(体积比)为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-丁基-4-环丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(PAm)60mg，产率67％。实施例1制备的PAm的核磁谱图氢谱与碳谱如图1、图2所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(dd,J＝8.6,1.0Hz,1H),8.65(dd,J＝7.3,1.0Hz,1H),8.57(d,J＝8.1Hz,1H),7.77(dd,J＝8.6,7.3Hz,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),4.24–4.10(m,2H),4.06(t,J＝4.8Hz,2H),3.32(t,J＝4.8Hz,2H),1.78–1.64(m,2H),1.45(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.32,164.21,163.64,140.75,131.88,131.72,131.22,129.46,126.35,123.86,122.80,119.38,116.14,41.06,40.27,36.20,30.21,20.40,13.85.
经检测，其结构如上式PAm所示。
将PAm溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及吸收光谱。
PAm在氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水等溶剂中的荧光发射光谱与紫外吸收光谱测试。每次取20μL PAm母液，分别加入4mL氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行荧光光谱与紫外吸收光谱的测试。
PAm在氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的归一化的荧光谱图如图7所示：荧光染料浓度为10μM，PAm在氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的荧光发射波长在475nm左右，水中荧光量子产率达到0.83；PAm在氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的归一化的紫外吸收谱图如图8所示：荧光探针浓度为10μM。由于环丁酰胺与萘酰亚胺平面达到更好的共轭导致吸收的大幅红移，这使得PAm在氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的紫外吸收波长在405nm仍然有很强的吸收，便于激发得到高亮度荧光。
实施例2
中间体N-丁基-4-(4-氯)丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(ClBAm)的合成：
Figure BDA0001910641110000091
将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺(400mg,1.49mmol)溶于16mL四氢呋喃中，在0℃下向该反应液中滴加1.6mL 4-氯丁酰氯。滴加完毕后将混合液转移至室温反应10h。减压除去溶剂后，8mL水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼，用16mL甲醇洗涤滤饼，真空干燥得N-丁基-4-(4-氯)丁酰胺基-1,8-萘酰亚胺340mg，产率61％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(d,J＝7.2Hz,1H),8.61(d,J＝8.2Hz,1H),8.42(d,J＝6.8Hz,1H),8.20(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(s,1H),7.84–7.75(m,1H),4.28–4.11(m,2H),3.81–3.67(m,2H),2.80(t,J＝6.6Hz,2H),2.31(dt,J＝13.0,6.5Hz,2H),1.72(dt,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.45(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).
N-丁基-4-环戊酰胺基-1,8萘酰亚胺(BAm)的合成：
Figure BDA0001910641110000092
将N-丁基-4-(4-氯)丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(60mg,0.17mmol)，溶于12mL乙腈中，并向其中加入碳酸钾240mg。反应液缓慢升温至90℃，并在此温度持续反应1h。减压除去溶剂，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-丁基-4-环戊酰胺基-1,8萘酰亚胺(BAm)45mg，产率80％。实施例2制备的BAm的核磁谱图氢谱与碳谱如图3、图4所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),8.60(d,J＝2.7Hz,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.76(t,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),4.26–4.10(m,2H),3.99(t,J＝6.9Hz,2H),2.75(t,J＝8.0Hz,2H),2.47–2.32(m,2H),1.71(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.44(dq,J＝14.7,7.3Hz,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.23,163.98,163.57,141.85,131.67,131.22,129.93,129.25,127.82,127.13,124.15,123.23,121.99,51.67,40.26,31.58,30.18,20.36,19.45,13.85.
经检测，其结构如上式BAm所示，该染料可用于405nm激光激发。
实施例3
N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成：
Figure BDA0001910641110000101
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.0g,3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加正丁胺(250mg，3.43mmol)。40℃下12h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.5Hz,2H),1.68(m,2H),1.40(m,J＝7.8Hz,2H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
DOAN的合成：
Figure BDA0001910641110000111
将乙二醇(20mg，0.33mmol)溶于10mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(20mg，0.89mmol)，0.5h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(120mg，0.31mmol)并加热至80℃,10h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：石油醚＝1:2为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体DOAN 12mg，产率12％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(d,J＝8.3Hz,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),4.31(s,4H),4.06–3.96(m,2H),1.60(td,J＝13.2,6.2Hz,2H),1.34(td,J＝14.2,7.3Hz,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式BAm所示，该染料在405nm处有较强吸收可用于405nm激发的荧光染料。
实施例4
OEOAN的合成：
N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成：
Figure BDA0001910641110000121
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(500mg,1.56mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加正丁胺(250mg，3.43mmol)。90℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体193mg，产率33％。
OEOAN的合成：
Figure BDA0001910641110000122
将乙二醇(100mg，1.67mmol)溶于10mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(77mg，3.34mmol)，1h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)并加热至60℃持续反应3h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体OEOAN 40mg，产率81％。实施例4制备的OEOAN的核磁谱图氢谱与碳谱如图5、图6所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.22(d,J＝8.5Hz,2H),5.21(t,J＝5.7Hz,2H),4.23(s,4H),4.06–3.96(m,2H),3.91(d,J＝4.0Hz,4H),1.60(td,J＝13.5,6.3Hz,2H),1.34(td,J＝14.4,7.2Hz,2H),0.93(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.69,162.86,134.26,131.88,114.04,114.01,107.88,71.42,60.20,30.21,20.31,14.21.
经检测，其结构如上式OEOAN所示。
将OEOAN溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及吸收光谱。
OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水等溶剂中的荧光发射光谱与紫外吸收光谱测试。每次取20μL OEOAN母液，分别加入4mL乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行荧光光谱与紫外吸收光谱测试。
OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的归一化的荧光谱图如图10所示：荧光染料浓度为10μM。OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的荧光发射波长在420-450nm，荧光波长基本不随溶剂极性变化，半峰宽<50nm，避免了荧光成像及检测中不同极性环境对荧光信号的干扰。OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的归一化的紫外吸收谱图如图11所示：荧光探针浓度为10μM。OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的紫外吸收波长在405nm有很强的吸收，便于激发得到高亮度荧光。此外，该染料受极性变化影响较小。
实施例5
DOEOAN的合成：
Figure BDA0001910641110000141
将二甘醇(50mg，0.47mmol)溶于5mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(50mg，2.18mmol)，0.5h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)并加热至60℃持续反应2h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1为洗脱剂，减压除去溶剂得淡黄色半固体DOEOAN 14mg，产率23％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.21(d,J＝8.6Hz,2H),5.46(t,J＝5.8Hz,2H),4.25(s,4H),4.06–3.94(m,2H),3.92-3.65(m,12H),1.61(td,J＝13.0,6.2Hz,2H),1.36(td,J＝142,7.1Hz,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式DOEOAN所示，该染料在405nm处有较强吸收可用于405nm激发的荧光染料。
实施例6
DMOAN的合成：
Figure BDA0001910641110000151
将1,2-二甲基乙二醇(30mg，0.33mmol)溶于30mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(15mg，0.87mmol)，0.5h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(126mg，0.33mmol)并加热至90℃,8h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：石油醚＝1:2为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体DMOAN 9mg，产率8％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.41(d,J＝8.2Hz,2H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),4.47(m,2H),4.01–3.92(m,2H),2.47(d,J＝8.7Hz,6H),1.61(td,J＝13.1,6.4Hz,2H),1.33(td,J＝14.2,7.8Hz,2H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式DMOAN所示，该染料在405nm处有较强吸收可用于405nm激发的荧光染料。
将该系列染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其不同pH下荧光光谱变化及细胞内荧光成像。
实施例7
PAm与OEOAN在不同pH下的水溶液中荧光发射光谱测试。每次取20μLPAm或OEOAN母液，加入4mL不同pH(3,4,5)测试液中，10min后进行荧光发射光谱的测试。pH＝5-9通过20mM磷酸盐缓冲液调节pH。
PAm在不同pH下的水溶液中荧光发射光谱谱图如图9所示：PAm浓度为10μM，PAm在不同pH下荧光发射光谱未出现明显的变化，插图中不同pH条件下475nm处荧光强度没有变化。这说明PAm染料在很宽的pH下均能保持荧光的稳定性，以提供可靠的荧光信号。
OEOAN在不同pH下的水溶液中荧光发射光谱谱图如图12所示：OEOAN浓度为10μM，OEOAN在不同pH下荧光发射光谱未出现明显的变化，插图中不同pH条件下430nm处荧光强度没有变化。这说明OEOAN染料在很宽的pH下均能保持荧光的稳定性，以提供可靠的荧光信号。
实施例8
PAm在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像实验。取0.5μL母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育10分钟后进行荧光共聚焦。激发波长405nm；荧光采集：440-490nm。
PAm在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像图如图13所示：PAm能够对活细胞进行快速染色，进行共聚焦荧光成像，能有效避开激发光的干扰。

Claims (5)

1.一种405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：该染料均以萘酰亚胺为荧光母体，通过4-位与5-位供电基团的改变将激发波长调节至380-410nm之间，用于405nm的激光进行激发、成像，其结构如下：
Figure RE-FDA0003229023120000011
其中n为1,2,3,4。
2.一种如权利要求1所述的405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征在于荧光染料的合成方法包含步骤如下：
(1)中间体N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于四氢呋喃中，并在0℃下向该反应液中滴加氯取代烷基酰氯；滴加完毕后将混合液转移至室温反应6-10h；减压除去溶剂后，去离子水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼并用甲醇洗涤，真空干燥得N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物；
(2)染料N-丁基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物，溶于乙腈中，并向其中加入碳酸钾；将反应液缓慢升温至50-90℃，并持续反应1-3h， 减压除去溶剂，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比为200～800:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-丁基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物。
3.根据权利要求2所述的405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中，N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与四氢呋喃的体积比为2-25:1mg/mL；
氯取代烷基酰氯与四氢呋喃体积比为1:10-80，
氯取代烷基酰氯与去离子水体积比为1:5-50，
氯取代烷基酰氯与甲醇的体积比为1:10-20。
4.根据权利要求2所述的405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-丁基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物与碳酸钾质量比1:1-4；碳酸钾的质量与乙腈的体积比为10-20:1mg/mL。
5.一种如权利要求1所述的405nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料在制备荧光标记、荧光成像的制剂中的应用。
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