CN111337460B - 一种高稳定性Halo-tag探针及其合成和生物应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高稳定性Halo‑tag探针及其合成和生物应用，该探针为以萘酰亚胺为荧光团，氯代脂肪烃为识别基团设计合成的一种高稳定性的免洗Halo‑tag探针，该探针结构(1)所示，其中，4,5‑位环己二胺的引入增加了染料分子的对称性的同时限制了分子内扭转，使该Halo‑tag探针能够保持高的量子产率与稳定性，在水中量子产率达到0.80以上，荧光半峰宽只有40nm。此外，该类探针能够对活细胞内Halo‑tag特异性标记，实现免洗荧光成像，在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有很好的应用前景。

Description

一种高稳定性Halo-tag探针及其合成和生物应用
技术领域
本发明属于荧光标记领域，具体涉及一种高稳定性Halo-tag探针及其合成和生物应用。
背景技术
Halo-tag是目前应用最为广泛的标签蛋白之一，是来源于紫红红球菌中脱卤素酶的变异体，其能够与卤代脂肪烃类衍生物形成稳定的酯键。因此，携带有氯代脂肪烃的有机小分子荧光染料可以与Halo-tag发生特异性结合，达到对Halo-tag的稳定荧光标记。此外，由于Halo-tag并不是人源的酶经突变而来，故其在真核细胞内的特异性更高，细胞内非特异性标记几率很低，这也使其备受研究工作者的青睐，被用作融合蛋白来实时跟踪目标蛋白。
目前，Halo-tag探针通常由识别基团及荧光染料构成，其中识别基团均选择氯代己烷类衍生物，而荧光染料主要为荧光素类及罗丹明类染料。因此，荧光标记、成像等效果也主要就决定于荧光染料性能。荧光素类染料通常是含有氧负离子形式，容易被氧化，光稳定性差；罗丹明类染料则相反，为正离子盐形式，很容易在细胞内线粒体聚集造成荧光背景增高，信噪比降低。基于中性的荧光染料的Halo-tag探针仍然较少，且此类探针光稳定仍然存在问题，怎样提升此类探针稳定性、亮度仍然面临巨大困难。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高稳定性Halo-tag探针，该探针能够实现活细胞内的免洗荧光成像。
本发明的另一目的是提供一种高稳定性Halo-tag探针的制备方法，该方法步骤简单、容易提纯、原料低廉等优点。
本发明一种高稳定性Halo-tag探针，通过在萘酰亚胺分子4,5-位引入环己二胺实现了荧光稳定性、亮度的大幅度提升，该探针分子在水中量子产率最高可达0.80，稳定性高于罗丹明、荧光素类染料。
一种高稳定性Halo-tag探针，该类Halo-tag荧光探针具有如下结：
Figure BDA0001910314320000021
一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，此系列荧光探针合成路线，如下：
Figure BDA0001910314320000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，二甘醇胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝800:1-100:1为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(OAN-NBr)。(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺(OAN-DAC)的合成：
将OAN-NBr，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺。将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1-30:1为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体OAN-DAC。(3)Halo-tag探针(Halo-DAC)的合成
将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与NaH置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次。将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中。室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1-100:1为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针Halo-DAC。
步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与二甘醇胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与无水乙醇的质量与体积比为1:40-120g/mL。
步骤(2)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:3-9；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与乙二醇甲醚质量与体积比为1:200-600g/mL。
步骤(3)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与氢化钠(NaH)的质量比为1:0.36-1.08；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与1-碘-6-氯己烷的质量与体积比为1:1-3g/mL；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为1:100-300g/mL。
上述一种高稳定性Halo-tag探针对Halo-tag蛋白具有高度选择性，能够在活细胞等复杂环境中对Halo-tag进行特异性识别。
一种高稳定性Halo-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像的应用。
一种高稳定性Halo-tag探针用于Halo-tag蛋白的识别与检测。
一种高稳定性Halo-tag探针在单分子检测中的应用。
一种高稳定性Halo-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。
本发明具有以下特征：
该Halo-tag探针拥有合成原料低廉、易分离等优点。
该Halo-tag探针分子在水中荧光量子产率均大于0.80，亮度高，光稳定性好于荧光素、罗丹明类染料。
该Halo-tag探针能够对活细胞内Halo-tag蛋白进行特异性识别，实现免洗荧光成像。此外，探针可用于SIM等超分辨荧光成像。
附图说明
图1实施例1制备的Halo-DAC的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的Halo-DAC的高分辨质谱。
图3实施例1制备的探针Halo-DAC在水中归一化的荧光激发光谱与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化强度，荧光染料的浓度为10μM。
图4实施例1制备的探针Halo-DAC在500W钨灯照射下495nm处荧光强度随时间变化图，选取商业罗丹明123、荧光素作为参比染料，横坐标为时间，纵坐标为归一化荧光强度。
图5实施例1制备的探针Halo-DAC在转染的pSNAPf-H2B的Hela细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图6实施例1制备的探针Halo-DAC在在转染的Hela细胞SIM超分辨荧光成像图，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成
Figure BDA0001910314320000051
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.00g,6.24mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(1.97g，18.7mmol)。70℃下2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-0:1，V/V)分离得米白色固体996mg，产率39％。实施例1制备的中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)其核磁谱图数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3/DMSO-d6)δ8.70(d,J＝7.8Hz,1H),8.50(d,J＝7.9Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.13(d,J＝7.8Hz,1H),4.37(t,J＝5.9Hz,2H),4.21(s,1H),3.78(t,J＝5.9Hz,2H),3.58(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3/DMSO)δ167.48,166.76,155.77,140.86,137.11,136.25,135.21,130.44,128.84,128.34,127.29,125.60,77.28,72.13,65.73.
其高分辨质谱具体数据如下：理论值C16H14BrN2O6[M+H]+409.0035,实际值409.0031.
中间体N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)的合成
Figure BDA0001910314320000061
将OAN-NBr(100mg，0.24mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺300mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体34mg，产率35％。实施例1制备的中间体N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)其核磁谱图具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,21H),7.54(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.59(t,J＝4.7Hz,1H),4.15(t,J＝6.8Hz,2H),3.56(t,J＝6.8Hz,2H),3.46(s,4H),3.15(d,J＝9.4Hz,2H),2.20(d,J＝12.0Hz,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.43–1.22(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO d6)δ163.43,154.65,134.84,133.40,110.63,107.62,106.40,72.53,67.69,60.66,59.48,46.17,32.07,23.63.
其高分辨质谱具体数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实际值396.1919.
Halo-DAC的合成
Figure BDA0001910314320000071
将OAN-DAC(50mg，0.13mmol)与NaH(18mg，0.76mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将50μL 1-碘-6-氯己烷溶于5mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体36mg，产率56％。实施例1制备的Halo-DAC其核磁谱图如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(d,J＝8.3Hz,2H),6.52(d,J＝8.3Hz,2H),5.00(s,2H),4.39(t,J＝6.2Hz,2H),3.81(t,J＝6.2Hz,2H),3.70(s,2H),3.58(d,J＝4.4Hz,2H),3.41(dd,J＝11.1,6.3Hz,2H),3.21(d,J＝7.7Hz,2H),2.13(d,J＝11.4Hz,2H),1.86(d,J＝7.5Hz,2H),1.79–1.64(m,2H),1.56–1.27(m,10H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.33,152.36,133.81,114.40,110.73,110.57,107.77,71.20,70.18,70.12,68.15,59.46,45.18,38.69,33.58,32.67,32.56,29.51,26.75,25.41,23.61.
其高分辨质谱如图2所示，高分辨质谱具体数据如下：高分辨质谱理论值C28H37ClN3O4[M+H]+514.2473,理论值514.2477.
将该类染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱变化及细胞内荧光成像。
Halo-DAC在水中荧光激发与发射光谱测试。每次取20μL Halo-DAC母液加入4mL水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。
探针Halo-DAC终浓度为2μM在不同溶剂中荧光谱图如图3所示，图3中Halo-DAC在水光发射波长在490nm左右，激发波长在480nm，荧光半峰宽只有40nm。
实施例2
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成
Figure BDA0001910314320000081
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.00g,6.24mmol)溶于240mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(5.91g，56.1mmol)。70℃下2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-0:1，V/V)分离得米白色固体900mg，产率36％。
中间体N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)的合成
Figure BDA0001910314320000091
将OAN-NBr(100mg，0.24mmol)溶于60mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺900mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体68mg，产率70％。
Halo-DAC的合成
Figure BDA0001910314320000092
将OAN-DAC(50mg，0.13mmol)与NaH(54mg，2.28mmol)置于25mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将150μL 1-碘-6-氯己烷溶于15mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体30mg，产率47％。
经检测，其结构如上式Halo-DAC所示，其荧光性能如下：
Halo-DAC在水光发射波长在490nm左右，激发波长在480nm，荧光半峰宽只有40nm。
实施例3
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成
Figure BDA0001910314320000101
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.12mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(1.97g，18.7mmol)。70℃下2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-0:1，V/V)分离得米白色固体500mg，产率40％。
中间体N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)的合成
Figure BDA0001910314320000111
将OAN-NBr(50mg，0.12mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺300mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体17mg，产率35％。
Halo-DAC的合成
Figure BDA0001910314320000112
将OAN-DAC(25mg，0.065mmol)与NaH(18mg，0.76mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将50μL 1-碘-6-氯己烷溶于5mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体15mg，产率47％。
经检测，其结构如上式Halo-DAC所示，其荧光性能如下：
Halo-DAC在水光发射波长在490nm左右，激发波长在480nm，荧光半峰宽只有40nm。
实施例4
Halo-DAC在500W钨灯照射下荧光强度随时间变化测试。取20μL Halo-DAC及商业染料母液加入4mL PBS(磷酸缓冲液，pH 7.4)中，而后加入4mL螺纹比色皿中，正面放置于钨灯50cm处，分别采取0,1,,2,3,4,6,8,10h为时间节点进行荧光光谱测试，并选取各自染料荧光发射峰值对时间进行曲线图。
探针Halo-DAC终浓度为2μM在PBS光照后的荧光强度如图4所示，Halo-DAC在光照10h后仍然能够保持较高强度(97％)，而商业罗丹明123、荧光素等荧光强度均大幅降低(85％；46％)，这说明Halo-DAC光稳定性由于基于这两种染料的探针，有望用于超分辨荧光成像。
实施例5
探针Halo-DAC在转染细胞中荧光共聚焦成像及超分辨成像。取0.5μL Halo-DAC母液溶于1mL培养液中，而后置于37℃下孵育30分钟后进行荧光成像。激发波长为488nm，采集为500-550nm。
探针AN-BG终浓度为1μM的细胞培养液孵育表达融合有Halo-tag的H2B的Hela细胞10分钟后荧光成像图如图5所示，探针能够对融合有Halo-tag的H2B进行特异性标记，达到对细胞核免洗成像，细胞核轮廓清晰，信噪比较高。100倍物镜下细胞核内荧光强度达到细胞质内的6倍。
探针AN-BG终浓度为1μM的细胞培养液孵育表达融合有Halo-tag的H2B的Hela细胞10分钟后荧光成像图如图6所示，探针Halo-DAC通道染色效果图(采集500-550nm)，探针能够对融合有Halo-tag的H2B进行特异性标记，染料稳定性的提升使其能够应用于SIM成像，达到更高的分辨率。

Claims (9)

1.一种高稳定性Halo-tag探针，其特征在于该探针以4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，氯己烷为结合位点，其结构如下：
Figure FDA0003103207460000011
2.一种如权利要求1所述的高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，二甘醇胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为＝100～800:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为30～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)Halo-tag探针的合成将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与NaH置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针。
3.如权利要求2所述的一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征在于：步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与二甘醇胺的质量比为1:1-3；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与无水乙醇的质量与体积比为1:40-120g/mL。
4.如权利要求2所述的一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:3-9；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺与乙二醇甲醚质量与体积比为1:200-600g/mL。
5.如权利要求2所述的一种高稳定性Halo-tag探针的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与氢化钠(NaH)的质量比为1:0.36-1.08；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与1-碘-6-氯己烷的质量与体积比为1:1-3g/mL；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为1:100-300g/mL。
6.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像的应用。
7.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针用于Halo-tag蛋白的识别与检测。
8.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针在单分子检测中的应用。
9.如权利要求1所述的一种高稳定性Halo-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。
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