CN112940714B - 一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针及其合成方法和应用 - Google Patents

一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高荧光量子产率的免洗Halo‑tag探针及其合成和应用，该探针基于羰基氮杂环丁烷取代的1,8‑萘酰亚胺染料，其结构式如(1)所示；将羰基氮杂环丁烷共价连接到1,8‑萘酰亚胺的4号位，进一步衍生出Halo‑tag探针，该探针能够保持高的量子产率与光稳定性。该探针能够实现对活细胞内融合有Halo‑tag的目标蛋白特异性标记，达到免洗荧光成像，在荧光检测和荧光成像等领域，特别是单分子检测和超分辨荧光成像等新兴领域具有广泛的应用前景。

Description

一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针及其合成方法和 应用
技术领域
本发明属于蛋白标签领域，具体涉及一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针及其合成和应用。
背景技术
在活细胞条件下对目标蛋白进行标记和成像是了解体内蛋白基本前提，而目前最普遍的技术是将荧光蛋白与目标蛋白融合，从而可以在活细胞或动物中对目标蛋白进行荧光可视化。然而大尺寸的荧光蛋白作为荧光标签可能影响目标蛋白的自然功能，以及其自身作为荧光标记物的用途受到限制。为了克服这些限制并为蛋白质分析提供更实用的化学工具，研究人员积极开发了使用功能性分子探针选择性标记目标蛋白的新方法。其中，Halo-tag作为一种非人源的脱卤素酶的变异体被广大研究工作者所青睐，Halo-tag能够与含有卤代脂肪烃的荧光染料发生特异性反应，使两者之间通过稳定的酯键连接。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针，该探针与Halo-tag蛋白结合后荧光显著增强，能够实现活细胞内的免洗荧光成像。
本发明的另一目的是提供一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，该方法合成操作简单、纯化简单、原料低廉等优点。
本发明涉及的一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针，通过羰基氮杂环丁烷共价连接到1,8-萘酰亚胺的4号位，进一步衍生出该探针，这种设计策略很大程度的提高了该探针的荧光量子产率以及光稳定性，该探针在水中量子产率大于0.40。所述的Halo-tag荧光探针具有如下结构：
Figure BDA0002310784520000021
一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，该荧光探针的合成方法及合成路线，如下：
Figure BDA0002310784520000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-1,8-萘酐和甲胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得淡黄色固体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺；
(2)中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺的合成：
将中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺溶于二甲基亚砜中，并向其中加入氮杂环丁烷-2-羧酸和碳酸钾；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应1-10h。停止加热，冷却至室温，将反应液倒入水中，用稀盐酸中和至pH为4。用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-40:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺；
(3)中间体Halo-OH的合成：
将N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并向其中依次加入二甘醇胺、HoBt、EDC、三乙胺，室温下搅拌1-6小时，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为40-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到中间体Halo-OH。
(4)Halo-tag探针的合成：
将中间体Halo-OH与氢化钠置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针。
步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐：甲胺的质量比为10-3:1；
4-溴-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:50-100g/mL。
步骤(2)中，中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺：氮杂环丁烷的质量比为1:0.3-1；
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺：碳酸钾的质量比为1:1-3；
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与二甲基亚砜的体积比为1:30-100g/mL。
步骤(3)中，中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：二甘醇胺的质量比为1:1-4；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：HoBt的质量比为1:2-4；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：EDC·HCl的质量比为1:3-5；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：三乙胺的质量比为1:3-8；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:3-100g/mL。
步骤(4)中，中间体Halo-OH：氢化钠的质量比为2-4:1；
中间体Halo-OH的质量与1-碘-6-氯己烷的体积比为1:0.5-2g/mL；
中间体Halo-OH的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-150g/mL。
一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针能够特异性识别Halo-tag蛋白，在活细胞等复杂环境中实现对Halo-tag的免洗荧光成像。
一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针在活细胞内对Halo-tag及其融合蛋白成像领域的应用。
一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针在Halo-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
本发明优点和有益效果：
本发明涉及的Halo-tag探针是基于羰基氮杂环丁烷取代的1,8-萘酰亚胺荧光染料而衍生出的，具有非常高荧光量子产率，在水中荧光量子产率大于0.4。此外，该Halo-tag探针拥有合成原料低廉、提纯简单等优点。
该Halo-tag探针能够实现对活细胞内融合有Halo-tag的目标蛋白特异性识别与标记，达到免洗荧光成像，信噪比高，在生物成像领域有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的Halo-Aze的核磁谱图氢谱。
图2为实施例1制备的Halo-Aze的核磁谱图碳谱。
图3为实施例1制备的Halo-Aze探针在水中归一化的荧光激发光谱与荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化强度，荧光染料的浓度为5μM。
图4为实施例1制备的Halo-Aze探针在500W钨灯照射下荧光强发射度的变化图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度。
图5为实施例1制备的探针Halo-Aze在转染的pHALOf-H2B的HeLa细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
Halo-tag探针(Halo-Aze)的合成方法。
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0002310784520000051
在250mL单口瓶中依次加入4-溴-1,8-萘酐1g，甲胺0.135g，无水乙醇80mL，将反应液加热至70℃，搅拌7h。停止反应，冷却至室温后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂，得淡黄色固体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，产率90％；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2羧酸)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0002310784520000061
在50mL双口瓶中依次加入N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺145mg，二甲基亚砜10mL，氮杂环丁烷-2-羧酸100mg，碳酸钾276mg，将反应液缓慢升温至120℃，并在氮气保护下反应3h。停止加热，冷却至室温，将反应液倒入水中，用稀盐酸中和至pH为4。用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-40:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺，产率76％；
中间体Halo-OH的合成：
Figure BDA0002310784520000062
在25ml单口瓶中依次加入N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺77.5mg，干燥的N,N-二甲基甲酰胺5mL，二甘醇胺0.15mL、1-羟基苯并三唑200mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐287mg、三乙胺0.34mL，室温下搅拌4小时，停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为40-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺)-1,8-萘酰亚胺，产率68％。
其核磁谱图氢谱和碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(t,J＝5.7Hz,1H),8.37(d,J＝7.2Hz,1H),8.30(d,J＝8.4Hz,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),7.64–7.56(m,1H),6.45(d,J＝8.5Hz,1H),5.06(dd,J＝9.1,5.7Hz,1H),4.76(q,J＝8.4Hz,1H),4.62(t,J＝5.4Hz,1H),4.39(s,1H),3.51(t,J＝5.7Hz,2H),3.46(dd,J＝8.5,5.5Hz,4H),3.35(s,3H),3.33(s,2H),2.80(dtd,J＝10.6,9.1,5.6Hz,1H),2.39(ddt,J＝11.0,9.1,5.9Hz,1H).
13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.58,164.25,163.45,152.16,132.86,130.95,130.87,129.85,124.40,122.03,120.82,110.12,107.16,72.58,69.26,66.70,60.64,54.90,39.03,26.84,22.41.
Halo-tag探针(Halo-Aze)的合成：
Figure BDA0002310784520000071
在50mL史莱克瓶中依次加入N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺)-1,8-萘酰亚胺30mg和氢化钠9mg，并置换氮气操作2-5次；然后将20μL 1碘-6-氯己烷溶于3mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺加入到反应液中；室温下搅拌3h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到黄色粉末49％。
其核磁谱图氢谱和碳谱如图1和图2所示，数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(m,2H),8.29(d,J＝8.2Hz,1H),8.16(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),6.43(d,J＝8.4Hz,1H),5.14(m,1H),4.73(d,J＝5.7Hz,1H),4.35(d,J＝6.5Hz,1H),3.59(t,J＝6.6Hz,2H),3.45(s,2H),3.40(t,J＝5.7Hz,4H),3.36(m,9H),2.84–2.70(m,1H),2.34(ddt,J＝16.3,10.6,6.1Hz,1H),1.75(m,2H),1.42(d,J＝7.0Hz,2H),1.31(s,4H).
13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.53,164.28,163.45,152.22,132.86,130.97,130.11,124.46,122.08,120.88,110.17,107.23,70.62,70.00,69.85,69.29,66.73,54.93,45.77,38.97,32.46,29.46,26.83,26.55,25.34,22.39.
经检测，其结构如上式Halo-Aze所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取10μL Halo-Aze母液加入4mL水中，配制成5μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。Halo-Aze在水中荧光激发与发射光谱图如图3所示：
Halo-Aze在水光荧光发射波长在536nm左右，激发波长在445nm，在水中的荧光量子产率大于0.4。
实施例2
Halo-tag探针(Halo-Aze)的合成方法。
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0002310784520000081
在250mL单口瓶中依次加入4-溴-1,8-萘酐1g，甲胺100mg，无水乙醇50mL，将反应液加热至40℃，搅拌1h。停止反应，冷却至室温后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂，得淡黄色固体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，产率30％；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0002310784520000091
在50mL双口瓶中依次加入N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺150mg，二甲基亚砜4.5mL，氮杂环丁烷-2-羧酸50mg，碳酸钾150mg，将反应液缓慢升温至50℃，并在氮气保护下反应1h。停止加热，冷却至室温，将反应液倒入水中，用稀盐酸中和至pH为4。用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-40:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺，产率15％；
中间体Halo-OH的合成：
Figure BDA0002310784520000092
在25ml单口瓶中依次加入N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺150mg，干燥的N,N-二甲基甲酰胺15mL，二甘醇胺0.15mL、1-羟基苯并三唑300mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐450mg、三乙胺0.45mL，室温下搅拌1小时，停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为40-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺)-1,8-萘酰亚胺，产率20％。
Halo-tag探针Halo-Aze的合成：
Figure BDA0002310784520000101
在50mL史莱克瓶中依次加入N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺)-1,8-萘酰亚胺100mg和氢化钠50mg，并置换氮气操作2-5次；然后将25μL 1碘-6-氯己烷溶于8mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺加入到反应液中；室温下搅拌1h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到黄色粉末产率35％。
经检测，其结构如上式Halo-Aze所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取10μL Halo-Aze母液加入4mL水中，配制成5μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。Halo-Aze在水中荧光激发与发射光谱图如图3所示：
Halo-Aze在水光发射波长在536nm左右，激发波长在445nm，在水中的荧光量子产率大于0.4。
实施例3
Halo-tag探针(Halo-Aze)的合成方法。
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0002310784520000111
在250mL单口瓶中依次加入4-溴-1,8-萘酐900mg，甲胺300mg，无水乙醇90mL，将反应液加热至90℃，搅拌10h。停止反应，冷却至室温后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂，得淡黄色固体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺75％；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0002310784520000112
在50mL双口瓶中依次加入N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺150mg，二甲基亚砜15mL，氮杂环丁烷-2-羧酸150mg，碳酸钾450mg，将反应液缓慢升温至140℃，并在氮气保护下反应6h。停止加热，冷却至室温，将反应液倒入水中，用稀盐酸中和至pH为4。用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-40:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺，产率70％；
中间体Halo-OH的合成：
Figure BDA0002310784520000113
在25ml单口瓶中依次加入N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺100mg，干燥的N,N-二甲基甲酰胺10mL，二甘醇胺0.4mL、1-羟基苯并三唑400mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐500mg、三乙胺0.8mL，室温下搅拌6小时，停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为40-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺)-1,8-萘酰亚胺，产率52％。
Halo-tag探针(Halo-Aze)的合成：
Figure BDA0002310784520000121
在50mL史莱克瓶中依次加入N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺)-1,8-萘酰亚胺100mg和氢化钠50mg，并置换氮气操作2-5次；然后将100μL 1碘-6-氯己烷溶于15mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺加入到反应液中；室温下搅拌5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到黄色粉末，产率41％。
经检测，其结构如上式Halo-Aze所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取10μL Halo-Aze母液加入4mL水中，配制成5μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。Halo-Aze在水中荧光激发与发射光谱图如图3所示：
Halo-Aze在水光发射波长在536nm左右，激发波长在445nm，在水中的荧光量子产率大于0.4。
实施例4
Halo-Aze在500W钨灯照射下荧光发射的强度的变化测试。取10μL Halo-Aze母液加入4mL去离子水中，而后加入螺纹比色皿中，正面放置于钨灯50cm处，分别采取0，1，3，5，7小时为时间节点进行荧光发射光谱测试。
Halo-Aze在500W钨灯照射下荧光发射强度的变化图如图4所示：Halo-Aze荧光强度在光照7h后仍然能够保持很高强度(99％)，这说明Halo-Aze光稳定性极高，有望用于超分辨荧光成像。
实施例5
探针Halo-Aze在转染细胞中的荧光共聚焦成像实验。取0.5μLHalo-Aze母液溶于1mL培养液中，而后置于37℃下孵育30分钟后进行荧光成像。激发波长为488nm，采集为500-550nm。
探针Halo-Aze在转染细胞中荧光共聚焦如图5所示：
通过Halo-H2B诱导Hela细胞表达融合有Halo-tag的H2B。探针能够对融合有Halo-tag的H2B进行特异性标记，达到对细胞核免洗成像，细胞核轮廓清晰，信噪比较高。

Claims (7)

1.一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针，其特征在于，基于羰基氮杂环丁烷取代的1,8-萘酰亚胺荧光染料，衍生出的Halo-tag探针的结构如下所示：
Figure FDA0003790294290000011
2.根据权利要求1所述的一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于，包含步骤如下：
(1)中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-1,8-萘酐和甲胺溶于无水乙醇中，将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂，得淡黄色固体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺；
(2)中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2羧酸)-1,8-萘酰亚胺的合成：
将步骤(1)得到的中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺溶于二甲基亚砜中，并向其中加入氮杂环丁烷-2-羧酸和碳酸钾；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h，停止加热，冷却至室温，将反应液倒入水中，用稀盐酸中和至pH为4；用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-40:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺；
(3)中间体Halo-OH的合成：
将步骤(2)得到的N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并向其中依次加入二甘醇胺、1-羟基苯并三唑(HoBt)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、三乙胺，室温下搅拌1-6小时，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为40-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到中间体Halo-OH；
(4)Halo-tag探针(Halo-Aze)的合成：
将步骤(3)得到的中间体Halo-OH与氢化钠置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐：甲胺的质量比为10-3:1；
4-溴-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:50-100g/mL。
4.根据权利要求2所述的一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中，中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺：氮杂环丁烷-2-羧酸的质量比为1:0.3-1；
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺：碳酸钾的质量比为1:1-3；
中间体N-甲基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与二甲基亚砜的体积比为1:30-100g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(3)中，中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：二甘醇胺的质量比为1:1-4；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：HoBt的质量比为1:2-4；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：EDC·HCl的质量比为1:3-5；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺：三乙胺的质量比为1:3-8；
中间体N-甲基-4-(氮杂环丁烷-2-羧酸)-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:3-100g/mL。
6.根据权利要求2所述的一种高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(4)中，中间体Halo-OH：氢化钠的质量比为2-4:1；
中间体Halo-OH的质量与1-碘-6-氯己烷的体积比为1:0.5-2g/mL；
中间体Halo-OH的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-150g/mL。
7.一种如权利要求1所述的高荧光量子产率的免洗Halo-tag探针在Halo-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
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