CN111333652A - 一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用。该荧光探针化学结构特征如下：荧光团母体是萘酰亚胺类染料，萘酰亚胺发色团母体连接取代基R，具体结构如式(1)所示。该小分子荧光探针在嘌呤基团的淬灭作用下荧光微弱，其能够专一性的识别SNAP标签蛋白并与其共价结合，结合后因嘌呤基团离去而荧光恢复。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而标记目标蛋白。由于标记前后荧光强度显著增强，标记后不需要清洗的步骤即可以直接应用，该探针可以在体外免洗标记，也可以免洗标记活细胞内的任一蛋白质，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。

Description

一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
蛋白质的定点标记对于活细胞内蛋白质的定位与追踪具有重要的意义。通过小分子荧光探针标记蛋白来研究活细胞中蛋白质的位置、功能、以及蛋白-蛋白间通讯。目前常用的蛋白标及技术包括荧光蛋白融合法，单位点非天然氨基酸法，以及蛋白标签方法。荧光蛋白标记法存在蛋白尺寸较大、荧光相对稳定性差、且缺少近红外波段等缺点。非天然氨基酸的筛选过程复杂，耗时长，而且需要tRNA合成酶与改造的目标蛋白共表达，繁琐的改造与表达过程限制了非天然氨基酸技术的应用。相比之下，蛋白标签技术首先将标签蛋白与目标蛋白的融合表达，随后带有底物基团的荧光小分子通过与标签蛋白的专一性作用实现标记，该方法操作简单，可以选择任一荧光团作为母体，不但显示出荧光探针优越的光物理特性，而且对标记的位置与时间精准控制，被广泛的应用于目标蛋白的标记。目前常用的蛋白标签包括Halo，PYP，SNAP，BL等，其中SNAP标签是较常用的一个蛋白标签，他通过与O6-烷基鸟嘌呤衍生物的专一、共价连接而实现标记。各式的荧光小分子被设计出来用于快速、不可逆的蛋白标记，并且应用于药物监控、蛋白-蛋白相互作用、超分辨显微成像等。
尽管如此，目前大多数用于SNAP标签蛋白的小分子探针在标记过程中需要清洗掉未反应的小分子后再成像观察。这一清洗过程时间冗长，不利于目标蛋白的实时观察与追踪，通常情况下，多数非特异性结合的小分子清洗不彻底导致信噪比高，影响观测。因此，与SNAP蛋白反应前后有荧光变化的小分子探针的设计就显得尤为重要。目前已经有一些免洗的SNAP荧光探针被设计出来，包括DRBG-488，CBG-549-QSY7等，但其结构复杂，合成过程繁琐。最近报道的BGSBD探针尽管结构简单，但是该荧光团的荧光性能较差，应用受限。
发明内容
本发明的目的是提供一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针及其合成方法和应用该免洗标记特定蛋白质的荧光探针能够快速、专一、免洗的标记目标蛋白的小分子荧光探针，该探针可应用于体外检测或者活细胞内目标蛋白的生物成像。
本发明所述的一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针，该探针分子结构式如下：
Figure BDA0001910599420000021
其中：R为：(CH2)nCH3,(n＝0-4),苄基、吡啶亚甲基等。
一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，合成路线如下：
Figure BDA0001910599420000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200:1-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺，叔丁醇钾，2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺。室温反应2-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100:1-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP蛋白的荧光探针。
步骤(1)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺与脂肪伯胺的质量比为1:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为50-100:1mg/mL；
脂肪伯胺包括N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺、N,N-二丙基乙二胺、N,N-二丁基乙二胺、N,N-二苄基乙二胺、N,N-二吡啶亚甲基乙二胺等；
步骤(2)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾质量比为1:1-3:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为20-60:1mg/mL。
一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，用于体外目标蛋白的免洗标记，或者细胞内特定蛋白的免洗标记。
所述的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，所述的标记过程如下：(1)通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达；(2)该荧光探针通过与SNAP标签蛋白专一性共价连接实现对目标蛋白的标记。
所述的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的的标记过程，其特征在于：荧光探针标记目标蛋白后不需要清洗，直接进行光谱检测或者荧光成像。
本发明的优点和有益效果为：
该小分子荧光探针在嘌呤基团的淬灭作用下荧光微弱，其专一性的识别SNAP标签蛋白并与其共价结合后，因嘌呤基团离去而荧光恢复。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而标记目标蛋白。由于标记前后荧光强度显著增强，标记后不需要清洗的步骤即可以直接应用，
附图说明
图1实施例1制备的荧光探针BGAN-1核磁谱图氢谱；
图2实施例1制备的荧光探针BGAN-1核磁谱图碳谱；
图3为实施例3中描述的由实施例1制备的荧光探针BGAN-1(终浓度为2μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中与SNAP标签蛋白(4μM)作用前后的荧光光谱图。
图4为实施例4中描述的将实施例1制备的荧光探针BGAN-1(终浓度为2μM)加入分别转染了pSNAP-Cox8和pSNAP-H2B质粒的Hela细胞后进行荧光共聚焦成像。
图5为实施例5制备的荧光探针BGAN-2核磁谱图氢谱；
图6为实施例5制备的荧光探针BGAN-2核磁谱图碳谱；
图7为实施例6中描述的由实施例5制备的荧光探针BGAN-2(终浓度为2μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中与SNAP标签蛋白(4μM)作用前后的荧光光谱图。
图8为实施例7中描述的由实施例5制备的荧光探针BGAN-2(终浓度为2μM)加入分别转染了pSNAP-vector和pGFP-Tubulin质粒的Hela细胞后进行流式细胞仪检测的细胞数量图谱。
图9为实施例8中描述的将实施例5制备的荧光探针BGAN-2(终浓度为2μM)加入分别转染了pSNAP-Cox8和pSNAP-H2B质粒的Hela细胞后进行荧光共聚焦成像。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，中间体BA-1的合成：
Figure BDA0001910599420000051
将BA-Br(500mg,1.26mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二甲基乙二胺(250mg,2.84mmol)。反应液被缓慢加热至100℃,并在氮气保护下反应10h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝60：1,V/V)得黄色粉末305mg，产率60％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝7.9Hz,1H),8.44(d,J＝7.0Hz,1H),8.28(d,J＝8.3Hz,1H),7.69(s,2H),7.28(d,J＝7.4Hz,2H),7.23(d,J＝7.2Hz,2H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H),5.20(s,2H),5.11(s,1H),4.43(s,2H),3.48(d,J＝5.0Hz,2H),2.60(s,2H),2.24(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.24,163.36,151.15,141.67,136.78,134.97,131.37,129.97,129.15,127.81,126.90,124.84,122.23,120.58,107.94,104.41,63.13,57.36,45.76,42.74,41.39.
用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，BGAN-1的合成：
Figure BDA0001910599420000061
将BA-1(50mg,0.13mmol)、PuCl(50mg,0.20mmol)、t-BuOK(25mg,0.22mmol)置于10mL史莱克瓶中，并用氮气置换3次后加入2.5mL干燥的DMF。室温搅拌10h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝15：1,V/V)得黄色粉末24mg，产率36％。实施例1制备的BGAN-1的核磁谱图氢谱与碳谱分别如图1、2，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),8.68(d,J＝4.3Hz,1H),8.44(s,1H),8.28(d,J＝4.8Hz,1H),7.81(s,1H),7.70(d,J＝15.3Hz,2H),7.43(s,2H),7.36(s,2H),6.79(d,J＝5.7Hz,1H),6.25(s,2H),5.43(s,21H),5.22(s,2H),3.48(s,2H),2.61(s,2H),2.25(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.27,163.36,160.07,151.19,138.29,135.87,135.00,131.41,129.99,129.23,129.00,128.03,124.82,122.19,120.59,107.89,104.40,66.98,57.32,45.72,42.76,41.35.
经检测，其结构如上式BGAN-1所示，其在水中的吸收波长为470nm，荧光发射波长为550nm，能够用于488nm激光激发。
实施例2
实施例1制备的荧光探针BGAN-1与SNAP标签蛋白体外反应情况
将BGAN-1溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，将1μL BGAN-1母液分别加入到含或者不含4μM SNAP标签蛋白的20mM，pH＝7.4的1mL HEPES溶液中，，以440nm激发波长激发，用荧光分光光度计检测荧光得到图3。
图3中只有BGAN-1探针存在时(2μM)显示微弱的荧光，而加入含SNAP标签蛋白的溶液中时，发射峰的波长有微弱的蓝移，且荧光显著增强。
实施例3
实施例1制备的荧光探针BGAN-1的活细胞成像
将BGAN-1溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液备用。
将Hela细胞(增殖表皮癌细胞)分别铺在2个培养皿中，皿中含有10％胎牛血清的DMED高糖培养基1mL，在37℃和5％二氧化碳条件下培养48小时，用PBS缓冲液轻柔洗涤细胞2次后更换新鲜不含有血清的培养液。然后向其分别加入含pSNAP-COX8和pSNAP-H2B质粒(NEB)的Lipo 2000(Invitrogen)转染工作液，然后置于培养箱中进行培养，4小时后，更换为含有血清的新鲜培养基。
转染24小时后分别向其中加入1μM的探针母液，孵育15分钟后，直接用共聚焦显微镜在488nm激发得共聚焦成像图如图4-(a),(b)所示：证明了探针的免洗标记。随后向转染了pSNAP-COX8的培养皿中加入MitoTracker Deep Red线粒体商业染料，向转染了pSNAP-H2B质粒的培养皿中加入Hoechst 33342细胞核商业染料，共同孵育10分钟，用PBS缓冲液洗涤细胞2次后用共聚焦显微镜分别在640nm和405nm激发得到图4-(c),(d)，叠加后得图4-(e),(f)，重合度很好证明了BGAN-1探针能够专一，快速，免洗的标记线粒体和细胞核的蛋白质。
实施例4
用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，中间体BA-2的合成：
Figure BDA0001910599420000081
将BA-Br(300mg,0.76mmol)溶于6mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二吡啶亚甲基乙二胺(DDPA)(600mg,2.48mmol)。反应液被缓慢加热至130℃,并在氮气保护下反应20h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝40：1,V/V)得黄色粉末165mg，产率40％。
用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，BGAN-2的合成：
Figure BDA0001910599420000082
将BA-2(60mg,0.11mmol)、PuCl(180mg,0.70mmol)、t-BuOK(120mg,1.07mmol)置于10mL史莱克瓶中，并用氮气置换4次后加入1mL干燥的DMF。室温搅拌2h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1,V/V)得黄色粉末26mg，产率35％。
经检测，其结构如上式BGAN-2所示，其性能如下：其在水中的吸收波长为472nm，荧光发射波长为552nm。
实施例5
用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，中间体BA-2的合成：
Figure BDA0001910599420000091
将BA-Br(300mg,0.76mmol)溶于6mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二吡啶亚甲基乙二胺(DDPA)(600mg,2.48mmol)。反应液被缓慢加热至140℃,并在氮气保护下反应24h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝40：1,V/V)得黄色粉末182mg，产率44％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(d,J＝8.3Hz,1H),8.60(d,J＝7.2Hz,1H),8.55(d,J＝4.4Hz,2H),8.40(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(s,1H),7.65(t,J＝7.8Hz,1H),7.54(ddd,J＝7.5,4.4,1.7Hz,4H),7.35(d,J＝7.8Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(dd,J＝6.8,5.3Hz,2H),6.51(d,J＝8.5Hz,1H),5.36(s,2H),4.64(s,2H),3.97(s,4H),3.37(d,J＝3.6Hz,2H),3.09–2.97(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.91,164.20,158.76,150.59,149.18,139.94,137.51,136.68,135.10,131.27,130.14,129.05,127.81,127.06,124.30,123.34,122.76,122.38,120.79,108.91,104.00,65.14,59.68,51.05,43.03,40.94.
用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，BGAN-2的合成：
Figure BDA0001910599420000101
将BA-2(60mg,0.11mmol)、PuCl(180mg,0.70mmol)、t-BuOK(120mg,1.07mmol)置于10mL史莱克瓶中，并用氮气置换4次后加入1mL干燥的DMF。室温搅拌2h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1,V/V)得黄色粉末19mg，产率26％。实施例4制备的BGAN-2的核磁谱图氢谱与碳谱分别如图5、6，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.41(s,1H),8.70(d,J＝8.4Hz,1H),8.50(d,J＝4.3Hz,2H),8.46(d,J＝7.3Hz,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),7.90(s,1H),7.79(s,1H),7.73(t,J＝7.8Hz,1H),7.65(t,J＝7.0Hz,2H),7.50(d,J＝7.7Hz,2H),7.43(d,J＝7.7Hz,2H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),7.24–7.16(m,2H),6.67(d,J＝8.7Hz,1H),6.27(s,2H),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.90(s,4H),3.54(d,J＝5.2Hz,2H),2.85(t,J＝6.1Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.28,163.36,160.08,159.54,151.11,149.27,138.29,136.97,135.88,134.87,131.40,129.99,129.00,128.93,128.03,124.92,123.32,122.67,122.25,120.63,107.82,104.50,66.95,60.02,51.43,42.77,41.04.
经检测，其结构如上式BGAN-2所示，其性能如下：其在水中的吸收波长为472nm，荧光发射波长为552nm。
实施例6
实施例5制备的荧光探针BGAN-2与SNAP标签蛋白体外反应情况
将BGAN-2溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，将1μL BGAN-2母液分别加入到含或者不含4μM SNAP标签蛋白的20mM，pH＝7.4的1mL HEPES溶液中，，以440nm激发波长激发，用荧光分光光度计检测荧光得到图7。
BGAN-2(终浓度为2μM)在HEPES缓冲溶液(20mM，pH＝7.4)中与SNAP标签蛋白(4μM)作用前后的荧光光谱图如图7所示：只有BGAN-1探针存在时(2μM)显示微弱的荧光，而加入含SNAP标签蛋白的溶液中时，发射峰的波长有微弱的蓝移，且荧光显著增强。
实施例7
实施例5制备的荧光探针BGAN-2作用活细胞的流式细胞仪检测
将BGAN-2溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液备用。
将Hela细胞(增殖表皮癌细胞)接种到6孔培养板中的4个孔，每孔加入2mL含有10％胎牛血清的DMED高糖培养基，在37℃和5％二氧化碳条件下培养至细胞密度约为40％，用PBS缓冲液轻柔洗涤细胞2次后更换新鲜不含有血清的培养液。然后向其中两个孔分别加入含pSNAP-vector(NEB)和pEGFP-Tubulin-6质粒的Lipo 2000(Invitrogen)转染工作液，然后置于培养箱中进行培养，4小时后，更换为含有血清的新鲜培养基。转染24小时后，分别向未转染质粒的一个孔以及转染了pSNAP-vector质粒的孔中分别加入2μM的探针母液，孵育15分钟，直接将四个孔中的细胞消化下来，用流式细胞仪在488nm激发下检测，检测的细胞总数均为5000个，经分析处理得到图8.
将BGAN-2对Hela细胞染色后进行流式细胞仪检测的细胞数量图谱如图8所示：未做任何处理的Hela细胞通过流式细胞仪的检测数量为100个，未转染且加入BGAN-2探针的Hela细胞数约为200个，而转染了pSNAP-vector质粒且加入探针的细胞数为1000个，转染了pEGFP-Tubulin-6质粒的细胞数为1300左右，证明了BGAN-2探针能够在活细胞内专一，快速的标记SNAP标签蛋白。
实施例8
实施例5制备的荧光探针BGAN-2的活细胞成像
将BGAN-2溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液备用。
将Hela细胞(增殖表皮癌细胞)分别铺在2个培养皿中，皿中含有10％胎牛血清的DMED高糖培养基1mL，在37℃和5％二氧化碳条件下培养48小时，用PBS缓冲液轻柔洗涤细胞2次后更换新鲜不含有血清的培养液。然后向其分别加入含pSNAP-COX8和pSNAP-H2B质粒(NEB)的Lipo 2000(Invitrogen)转染工作液，然后置于培养箱中进行培养，4小时后，更换为含有血清的新鲜培养基。
转染24小时后分别向其中加入1μM的探针母液，孵育15分钟后，直接用共聚焦显微镜在488nm激发得到共聚焦成像图如图9-(a),(b)所示：证明了探针的免洗标记。随后向转染了pSNAP-COX8的培养皿中加入MitoTracker Red线粒体商业染料，向转染了pSNAP-H2B质粒的培养皿中加入Hoechst 33342细胞核商业染料，共同孵育10分钟，用PBS缓冲液洗涤细胞2次后用共聚焦显微镜分别在549nm和405nm激发得到图9-(c),(d)，叠加后得图9-(e),(f)，重合度很好证明了BGAN-2探针能够专一，快速，免洗的标记线粒体和细胞核的蛋白质。

Claims (7)

1.一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：
Figure FDA0001910599410000011
其中R为：(CH2)nCH3,(n＝0-4),苄基或吡啶亚甲基。
2.根据权利要求1所述免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺，将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为30～200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺，叔丁醇钾，2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应2-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为10～100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP蛋白的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺与脂肪伯胺的质量比为1:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为50-100:1mg/mL；
所述脂肪伯胺包括N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺、N,N-二丙基乙二胺、N,N-二丁基乙二胺、N,N-二苄基乙二胺或N,N-二吡啶亚甲基乙二胺。
4.根据权利要求2所述的一种免洗标记特定蛋白质的荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾质量比为1:1-3:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为20-60:1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，其特征在于，该免洗标记特定蛋白质的荧光探针用于体外目标蛋白的免洗标记，或者细胞内特定蛋白的免洗标记。
6.根据权利要求5所述的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，其特征在于：所述的免洗标记过程如下：(1)通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达；(2)该荧光探针通过与SNAP标签蛋白专一性共价连接实现对目标蛋白的标记。
7.根据权利要求5所述的的免洗标记特定蛋白质的荧光探针的应用，其特征在于：免洗标记特定蛋白质的荧光探针的的标记过程中，荧光探针标记目标蛋白后不需要清洗，直接进行光谱检测或者荧光成像。
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