CN111333640B - 一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针及其制备和生物应用 - Google Patents

一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针及其制备和生物应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速标记SNAP‑tag的荧光探针及其制备和生物应用。该探针的结构式如(1)所示，通过萘酰亚胺4,5‑位大位阻基团的引入破坏了该探针的整体平面性，从而抑制探针分子在水中的聚集，使SNAP‑tag蛋白的底物分子苄基鸟嘌呤暴露在溶液中，达到与SNAP‑tag的快速反应。该探针与SNAP‑tag在1分钟内即可达到对SNAP‑tag的标记，反应常数达到15000M‑1S‑1，t1/2＝6s。此外，本发明探针在活细胞内能够实现对SNAP‑tag的特异性标记，达到活细胞的免洗荧光成像。

Description

一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针及其制备和生物 应用
技术领域
本发明属于蛋白荧光标记领域，具体涉及一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针及其制备和生物应用。
背景技术
由于尺寸小、易于修饰改造、荧光发射光谱宽泛、可选择性多等优点，在蛋白荧光标记及成像领域有机小分子染料逐步成为了荧光蛋白的代替工具。但是对目标蛋白定位的准确性、标记的稳定性是目前有机小分子荧光染料面临的巨大问题。为此研究工作者基于多种高特异性的酶促反应达到对特定标签蛋白的小分子荧光标记，例如SNAP-tag，CLIP-tag等。其中应用最为广泛的标签蛋白是SNAP-tag蛋白，通过其与与目标蛋白的融合可以通过小分子荧光探针对目标蛋白进行示踪、功能的监测等。
通常用于标记SNAP-tag蛋白的荧光探针含有特异性响应基团(苄基鸟嘌呤)与荧光信号携带者(有机小分子荧光染料)，两者之间的相互协调才能达到探针对SNAP-tag的高响应速度、高灵敏度。目前，用于原位、实时监测目标蛋白的SNAP-tag的免洗探针通常连接有环境敏感型荧光染料，在结合SNAP-tag后荧光得到释放，达到高的荧光增强倍数。然而，其细胞渗透性、与SNAP-tag的结合速率较低，反应常数小于6000M-1S-1，活细胞标记时间通常在1h以上。因此，如何通过有机小分子荧光探针的构建达到活细胞免洗荧光成像的同时保持高的细胞渗透性、反应速率仍然是SNAP-tag探针面临的巨大难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针，该探针与SNAP-tag蛋白反应常数达到15000M-1S-1，荧光增强4倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。
本发明的另一目的是提供一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针的制备方法，该方法步骤简单、易于提纯等优点。
本发明一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针，通过萘酰亚胺4,5-位非平面结构的引入达到对分子间聚集的抑制，从而实现探针对SNAP-tag蛋白的高响应速度t1/2为6s。
一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针，该荧光探针具有如下结构：
Figure BDA0001910366320000021
该荧光探针通过萘酰亚胺4,5-位大位阻基团的引入破坏了该探针的整体平面性，从而抑制探针分子在水中的聚集，使SNAP-tag蛋白的底物分子苄基鸟嘌呤暴露在溶液中，达到与SNAP-tag的快速反应。
该荧光探针与SNAP-tag在1分钟内即可达到对SNAP-tag的标记，反应常数达到15000M-1S-1，t1/2＝6s。
一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针的合成方法，其合成路线，如下：
Figure BDA0001910366320000031
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
所述4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为2:1-8；
所述4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-100g/mL；
(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-(N,N’-二甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二甲基乙二胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N(4-羟甲基)苄基-4,5-(N,N’-二甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺；
所述N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺：N,N’-二甲基乙二胺的质量比为1:1-4；
所述N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-150g/mL；
(3)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-(N,N’-二甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针；
所述N-(4-羟甲基)苄基-4,5-(N,N’-二甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺：叔丁醇钾的质量比为1:1-5；
所述N-(4-羟甲基)苄基-4,5-(N,N’-二甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺：2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-4；
所述N-(4-羟甲基)苄基-4,5-(N,N’-二甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-200g/mL。
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针对SNAP-tag蛋白具有高度选择性，能够在活细胞等复杂环境中对SNAP-tag进行特异性识别。
一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针在细胞、组织及活体内的荧光成像的应用。
一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针在SNAP-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针在单分子检测领域中的应用。
本发明的SNAP-tag探针拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后，荧光逐渐恢复，荧光增强4倍。该SNAP-tag探针分子在结合SNAP-tag蛋白后荧光量子产率均大于0.20，亮度高、光稳定性好。
该SNAP-tag探针能够对活细胞内SNAP-tag蛋白进行特异性识别，实现免洗荧光成像。
附图说明
图1为实施例1制备的SNAP-DMEDA的核磁谱图氢谱。
图2为实施例1制备的探针SNAP-DMEDA在不同溶剂中归一化的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图3为实施例1制备的探针SNAP-DMEDA在不同溶剂中归一化的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图4为实施例1制备的探针SNAP-DMEDA在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。
图5为实施例1制备的探针SNAP-DMEDA在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合的动力学曲线图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。
图6为实施例1制备的探针SNAP-DMEDA在在转染的pSNAPf-Cox8A的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图7为实施例1制备的探针SNAP-DMEDA在在转染的pSNAPf-H2B的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
SNAP-tag探针SNAP-DMEDA的合成方法。
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
Figure BDA0001910366320000061
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g，3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(853mg，6.22mmol)。80℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体480mg，产率35％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(d,J＝8.1Hz,2H),8.50–8.39(m,2H),7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝7.9Hz,2H),5.23(s,2H),5.13(t,J＝5.8Hz,1H),4.45(d,J＝5.5Hz,2H).
中间体BA-DMEDA的合成：
Figure BDA0001910366320000062
将BA-NBr(150mg，0.34mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N’-二甲基乙二胺200mg。将反应液缓慢加热至90℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝90:1，V/V)，得黄色固体88mg，产率65％。其核磁谱图氢谱和碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.25(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(d,J＝8.3Hz,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,2H),6.86(d,J＝8.7Hz,2H),5.18(s,2H),5.11(t,J＝5.7Hz,2H),4.43(d,J＝5.7Hz,2H),3.62(s,4H),3.12(s,6H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.65,155.89,141.53,137.07,132.95,127.72,126.86,116.10,110.62,110.37,63.14,57.85,42.52,41.66.
SNAP-DMEDA的合成：
Figure BDA0001910366320000071
将BA-DMDEA(50mg，0.12mmol)、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤(95mg，0.37mmol)和叔丁醇钾(100mg，0.89mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入5mL干燥DMF。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体27mg，产率40％。其核磁谱图氢谱如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.40(s,1H),8.25(d,J＝8.6Hz,2H),7.79(s,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),6.86(d,J＝8.7Hz,2H),6.27(s,2H),5.42(s,2H),5.22(s,2H),3.63(s,4H),3.12(s,6H).
经检测，其结构如上式SNAP-DMEDA所示，其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取20μL SNAP-DMEDA母液加入4mL乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱与紫外吸收光谱的测试。SNAP-DMEDA在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中荧光发射光谱图如图2所示：
SNAP-DMEDA在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在485nm左右，且随着极性的变化荧光发射波长及荧光峰型均没有明显变化。
SNAP-DMEDA在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中紫外吸收光谱如图3所示：
SNAP-DMEDA在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在450nm左右，且随着极性的变化紫外吸收波长及紫外吸收峰型均没有明显变化。
实施例2
SNAP-tag探针SNAP-DMEDA的合成方法。
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
Figure BDA0001910366320000081
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g，3.11mmol)溶于20mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(500mg，3.65mmol)。40℃下9h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体437mg，产率32％。
中间体BA-DMEDA的合成：
Figure BDA0001910366320000091
将BA-NBr(300mg，0.68mmol)溶于15mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N’-二甲基乙二胺(300mg，3.4mmol)。将反应液缓慢加热至50℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝90:1，V/V)，得黄色固体160mg，产率59％。
SNAP-DMEDA的合成：
Figure BDA0001910366320000092
将BA-DMDEA(50mg，0.12mmol)、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤(50mg，0.195mmol)和叔丁醇钾(50mg，0.445mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入4mL干燥DMF。室温下搅拌6h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体24mg，产率36％。
经检测，其结构如上式SNAP-DMEDA所示，其在不同溶剂中荧光发射波长在480-530nm，激发波长在450nm左右。
实施例3
SNAP-tag探针SNAP-DMEDA的合成方法。
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
Figure BDA0001910366320000101
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g，3.11mmol)溶于100mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(4.0g，29mmol)。90℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体425mg，产率31％。
中间体BA-DMEDA的合成：
Figure BDA0001910366320000111
将BA-NBr(150mg，0.34mmol)溶于22.5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N’-二甲基乙二胺(600mg，6.8mmol)。将反应液缓慢加热至140℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝90:1，V/V)，得黄色固体84mg，产率62％。
SNAP-DMEDA的合成：
Figure BDA0001910366320000112
将BA-DMDEA(50mg，0.12mmol)、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤(200mg，0.78mmol)和叔丁醇钾(500mg，4.45mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入10mL干燥DMF。室温下搅拌10h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体22mg，产率33％。
经检测，其结构如上式SNAP-DMEDA所示，其在不同溶剂中荧光发射波长在480-530nm，激发波长在450nm左右。
实施例4
SNAP-DMEDA在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱测试。取0.5μL SNAP-DMEDA母液溶于1mL PBS中进行荧光光谱测试，而后加入等浓度SNAP-tag蛋白半小时后进行荧光光谱测试。测试温度为37℃。
SNAP-DMEDA在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱如图4所示：SNAP-DMEDA在与SNAP-tag蛋白结合荧光强度增加4倍。由于由水到SNAP-tag蛋白的弱极性环境的变化，荧光发射波长由519nm蓝移到501nm。
实施例5
SNAP-DMEDA在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合的动力学曲线测试。取0.5μL SNAP-DMEDA母液溶于1mL PBS中，而后加入等浓度蛋白后检测500nm处荧光强度，激发波长为450nm。
SNAP-DMEDA在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合的动力学曲线如图5所示：SNAP-DMEDA在加入SNAP-tag后迅速与蛋白发生特异性结合，荧光恢复，荧光强度在1分钟内达到稳定。SNAP-DMEDA与SNAP-tag反应常数大于15000M-1S-1，t1/2＝6s。
实施例7
探针SNAP-DMEDA在转染细胞中荧光共聚焦成像及超分辨成像。取0.5μL SNAP-DMEDA母液溶于1mL培养液中，而后置于37℃下孵育30分钟后进行荧光成像。
探针SNAP-DMEDA在转染细胞中荧光共聚焦成像及超分辨成像图如图6、7所示：
图6中通过pSNAPf-Cox8A诱导HEK293细胞表达融合有SNAP-tag的Cox8A。(a)为1μM探针SNAP-DMEDA通道染色效果图(采集500-550nm)；(b)为商业化染料Mitotracker Red(采集580-654nm)染色效果图；(c)为(a)与(b)叠加图。探针能够分别对融合有SNAP-tag的Cox8A进行特异性标记，从而达到对线粒体免洗成像，线粒体结构清晰，与商业染料能够有很好的共定位效果。
图7中通过pSNAPf-H2B诱导HEK293细胞表达融合有SNAP-tag的H2B。(a)为1μM探针SNAP-DMEDA通道染色效果图(采集500-550nm)；(b)为商业化染料细胞核染料Hochest33342(采集417-477nm)染色效果图。探针能够对融合有SNAP-tag的H2B进行特异性标记，从而达到对细胞核免洗成像，细胞核轮廓清晰，与商业染料能够有很好的共定位效果。

Claims (5)

1.一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构如下所示：
Figure FDA0003542673820000011
2.一种如权利要求1所述的一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针的制备方法，其特征在于该方法包含步骤如下：
(1)中间体
Figure FDA0003542673820000012
的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体
Figure FDA0003542673820000013
所述4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为2:1-8；
所述4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-100g/mL；
(2)中间体
Figure FDA0003542673820000021
的合成：
将
Figure FDA0003542673820000022
溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二甲基乙二胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体
Figure FDA0003542673820000023
所述
Figure FDA0003542673820000031
N,N’-二甲基乙二胺的质量比为1:1-4；
所述
Figure FDA0003542673820000032
的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-150g/mL；
(3)SNAP-tag探针的合成
将
Figure FDA0003542673820000033
叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针；
所述
Figure FDA0003542673820000041
叔丁醇钾的质量比为1:1-5；
所述
Figure FDA0003542673820000042
2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-4；
所述
Figure FDA0003542673820000043
的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-200g/mL。
3.一种如权利要求1所述的一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针在细胞、组织及活体内的荧光成像的应用。
4.一种如权利要求1所述的一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针在SNAP-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
5.一种如权利要求1所述的一种快速特异性标记SNAP-tag的荧光探针在单分子检测领域中的应用。
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