CN102627636B - 萘基取代的罗丹明b噁二唑化合物制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了两种含有萘环的罗丹明噁二唑化合物及其制备方法与用途。此类化合物的噁二唑环一侧由罗丹明B取代，另一侧由萘基取代，当由α-萘基取代时为化合物A，当由β-萘基取代时为化合物B。本发明利用罗丹明B制备为罗丹明B酰肼、之后分别与α-、β-萘甲酸的羧基反应，在三氯氧磷催化下环合得噁二唑杂环。新化合物A、B具有良好的水溶性，表现出强烈的荧光，长期放置其荧光光谱不发生猝灭，具有作为细胞染料的生物染色剂的应用。
Description
本发明是在天津师范大学开发基金（基金号为52XK1102）的资助下进行的。
技术领域
本明发属于化学传感技术应用领域，涉及2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-α-萘基-1,3,4-噁二唑化合物A和2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-β-萘基-1,3,4-噁二唑即化合物B的制备方法，及其作为细胞荧光染料的生物荧光染色剂的用途。
背景技术
近十几年来，有机荧光染料已广泛应用于化学及电化学发光体中的有机荧光源、荧光化学分析、生物及医学的荧光示踪以及军事等方面的荧光源等领域。荧光分子探针在分子生物学、微生物学、生物化学、分析化学、化工和医药工业等领域也有着广泛地应用。同时它的发展与生物技术、环境科学、诊断医学等学科紧密相关。随着化学、物理学和生物技术等相关学科的发展与进步，又诞生了越来越多的与荧光探针相关的技术，这些技术极大的拓展了荧光探针的应用范围和研究深度，使得荧光探针日益成为现代新技术领域强有力研究手段。这些新研究手段的日益多样化也对荧光分子探针的种类提出了更高的要求。基于这个目的，我们围绕罗丹明类化合物，针对其进行了结构上的修饰，以改变它作为染料探针分子在对生物体荧光识别标记方面的不足。
本发明人设计了如下所示的、具有I结构特征的化合物A: 2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-α-萘基-1,3,4-噁二唑化合物，B: 2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-β-萘基-1,3,4-噁二唑。如目标化合物结构式所示，化合物A、B均是未见报道的新化合物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了具有通式I的化合物。
本发明的第二个目的是提供了具有通式I的化合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供了具有I的结构的化合物用于活体细胞荧光染料方面的用途。
为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：
具有结构式I的化合物：
I
其中R为α-萘基或β-萘基。
本发明进一步公开了化合物A的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的摩尔比为1 : 1.5~5。
将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与α-萘甲酸或β-萘甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应，经柱色谱分离，得到目标化合物A，其中罗丹明B酰肼 : α-萘甲酸 : 三氯氧磷的为摩尔比为1 : 1 : 0.5~5。
本发明也公开了化合物B的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的为摩尔比为1 : 1.5~5。
将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与β-萘甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应，经柱色谱分离，得到目标化合物B；其中罗丹明B酰肼 : β-萘甲酸 : 三氯氧磷的摩尔比为1 : 1 : 0.5~5。
本发明更加详细的公开了这两个化合物的制备方法，它是按如下的步骤进行：
化合物A的合成步骤：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将罗丹明B用乙醇溶解，然后将85%的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，抽滤，蒸馏水洗涤产物3次。
（2）目标化合物A的合成
将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与α-萘甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，经体积比为二氯甲烷/甲醇100~20:1, 柱色谱分离，得到目标化合物A。
化合物B的合成步骤：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将罗丹明B用乙醇溶解，然后将85%的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，抽滤，蒸馏水洗涤产物3次。
（2）目标化合物B的合成
将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与β-萘甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，经体积比为二氯甲烷/甲醇100~20:1, 柱色谱分离，得到目标化合物B。
本发明进一步公开了化合物A和B在作为细胞荧光染料方面的应用。
本发明所设计的化合物I的分子结构在于具有如下特征：本发明利用原料罗丹明酰肼中的活性部分内酰胺结构与取代基位置不同的萘甲酸中的羧基反应，同时利用三氯氧磷使其脱水环合，生成一个新的噁二唑杂环。新化合物A、B具有良好的水溶性，并且有对活体细胞进行荧光染色的用途。
本发明公开的萘基罗丹明B荧光染料探针化合物与现有技术相比所具有的积极效果为：
（1）以最简捷的方式，对商品罗丹明B类荧光染料改性，阻断了该类染料普遍存在的因内酯与羧酸互变造成的荧光猝灭现象的发生，化合物A、化合物B具有稳定的荧光光谱，在长时间范围，染料不发生褪色和荧光猝灭现象；
（2）化合物A、化合物B中，增加了氮原子、氧原子，改进了水溶解性；
（3）在原来染料的大π共轭体系中合成了噁二唑杂环，增加了萘环，利于在染色时与客体产生弱相互作用、提高染色与荧光检测效果，并利于荧光或裸眼识别与检测。
附图说明：
图1. 化合物I的结构式；
图2. 化合物A的结构式；
图3. 化合物B的结构式；
图4. 化合物A在水溶液中的荧光光谱（激发波长530 nm）；
图5. 化合物B在水溶液中的荧光光谱（激发波长530 nm）；
图6. 化合物A对活细胞的荧光染色成像（灰度模式）；
图7. 化合物B对固定细胞的荧光染色成像（灰度模式）。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。为简单和清楚的目的，以下论述中对公知的技术方法的描述、溶液的配制过程进行不再赘述。其中罗丹明B、α-萘甲酸和β-萘甲酸均为试剂公司直接购买。其他有机溶剂经无水处理。
实施例1.
化合物A: 2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-α-萘基-1,3,4-噁二唑的合成：
化合物A的合成通过以下主要反应制备：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.63 mL 85%（10.4 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后用1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.22 g，产率：68%。
（2）目标化合物A的合成
将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.76 g α-萘甲酸（4.4 mmol）混合溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流6小时，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇100 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物0.38 g, 收率14.6%。1H NMR: δ(CDCl3, 400 MHz) 1.329(12H, t), 3.644(8H, q), 6.879(2H, s), 6.949 (2H, d, J=9.2Hz), 7.512(2H, d, J=9.6Hz), 7.544(5H, m), 7.912(3H, t), 8.053(1H, d, J=8.0Hz), 8.480(1H, t), 7.859(2H, t,), 9.064(1H, d, J=8.0Hz)。质谱理论值：m/z M+, 593.7, 测定值, 593.5。
实施例2.
2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-β-萘基-1,3,4-噁二唑的合成
化合物B的合成通过以下主要反应制备：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.63 mL 85%（10.4 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后用1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.4 g，产率：72%。
（2）目标化合物B的合成
将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.76 g β-萘甲酸（4.4 mmol）混合溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流6小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇100 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物0.36 g，收率13.7%。 1H NMR: δ(CDCl3, 400 MHz) 1.283(12H, t), 3.628(8H, d, J=6.8Hz), 6.850(2H, s), 6.902 (2H, d, J=9.6Hz), 7.174(2H, d, J=9.6Hz), 7.489(2H, d, J=9.2Hz), 7.582(2H, m), 7.881(6H, q), 8.480(1H, t), 7.859(2H, t,), 9.064(1H, d, J=8.0Hz)。质谱理论值：m/z M+, 593.3, 测定值, 593.5。
实施例3.
化合物2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-α-萘基-1,3,4-噁二唑的合成：
化合物A的合成通过以下主要反应制备：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 ml的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流10小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物5次。得产物4.2 g，产率：89%。
（2）目标化合物A的合成
将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.76 g α-萘甲酸（4.4 mmol）混合溶于5 mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物 0.97 g，收率37.3%。
实施例4.
2-[罗丹明B-9’-(2’’-苯)基]-5-β-萘基-1,3,4-噁二唑的合成
化合物B的合成通过以下步骤：
（1）罗丹明B酰肼的合成
将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物5次。得产物4.0 g，产率：85%。
（2）目标化合物B的合成
将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.76 g β-萘甲酸（4.4 mmol）混合溶于5 mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物 0.90 g，收率34.6%。
实施例5
化合物A的细胞染色及其荧光成像实验：
1. 细胞染色及其染色荧光成像实验材料与方法:
1.1细胞及其培养的方法：
（a）试验的细胞：选用NIH-3T3细胞（小鼠成纤维细胞）；
（b）细胞的培养：DMEM（高糖）培养基；10 % 胎牛血清；
（c）细胞铺板过程（24孔）：取生长状态良好的NIH-3T3细胞，制成5x104 / mL 细胞悬液；24孔板每孔加入1.0 mL 细胞悬液。37 oC，5% CO2条件下培养48小时，分别进行活细胞组、固定后细胞组的细胞染色和荧光成像观察。
1.2 试验用荧光染料样品化合物I溶液配制：
依标准方法，化合物I用1%的醋酸溶液配制成4.0 mg/ml溶液作为试验用样品溶液。
1.3. 细胞荧光染色成像：
（一）活细胞组实验：
（1） 吸取经培养48小时后的各孔培养基；
（2） 加入200μL/孔试验用化合物I样品溶液，在室温下静置15分钟；
（3） 吸取样品溶液，用1%醋酸溶液洗5遍；
（4） 使用荧光倒置显微镜观察、照像，荧光激发光波长570 nm。
（二）固定后细胞组：
（1）吸取经培养48小时后的各孔培养基；
（2）于每孔加入10% 的醋酸溶液0.5 ml进行固定；
（3）在 4 oC条件下静置1小时；
（4）使用PBS溶液洗5遍；
（5）加入200μL/孔试验用化合物I样品溶液，于室温下静置15分钟；
（6）吸取样品溶液，使用1% 醋酸溶液洗5遍；
（7）在荧光倒置显微镜下观察、照像，荧光激发光波长为570 nm。
2. 化合物I的细胞染色与荧光成像实验结果与分析：
2.1 荧光成像试验结果显示样品化合物I具有红色荧光成像效果；参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图6；
2.2 荧光染色结果表明，固定后细胞组荧光染色成像效果优于活细胞组的染色效果，参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图7。
Claims (3)
1.具有结构式I的化合物：
I
其中R为α-萘基或β-萘基。
2.权利要求1所述化合物I的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的摩尔比1 : 1.5~5；
将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与萘甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应，经柱色谱分离，得到目标化合物I，其中罗丹明B酰肼 : 萘甲酸 : 三氯氧磷的摩尔比为1 : 1 : 0.5~5。
3.权利要求1所述结构式I化合物在细胞染料生物染色剂中的应用。
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