CN103059832B - 一类近红外荧光探针化合物及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

一类近红外荧光探针化合物，式中：X为C(CH₃)₂、O、S或Se；R₁和R₂独立选自为C_1-18烷基或苄基，R₃和R₄为H、SO₃R₆、CO₂R₇或NCS；R₅为饱和或不饱和、直链或支链的C_1-18烷基、羟基C_1-18烷基、巯基C_1-18烷基、氨基C_1-18烷基、酰基、苯基、萘基或苄基，Y^-为负离子。本发明的七甲川菁类探针化合物I能够用于选择性检测环境中的ppb级浓度的钯离子及零价钯，同时提供增强型的荧光信号，并且能够用于生物成像和复杂环境中的含钯分析。本发明中检测零价钯时用的还原剂是PEG系列，跟传统的还原剂PPh₃相比，PEG系列具有更好的生物相容性，更低的生物毒性。

Description

一类近红外荧光探针化合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及精细化工领域中一类新的近红外荧光探针、制备方法及其应用，特别是涉及一类单电荷含氮菁类荧光染料及其制备方法。该类化合物适用于精细化工领域中钯离子的检测。

背景技术

荧光分子探针是一类转换器，可以选择性地将分析对象的信息(如酸度、浓度、化学或生物活性等)转化为分析仪器易测量的荧光信号，从而实现被测物的分析检测。荧光分子探针通常由以下三个部分组成：(1)识别目标的接受体部分(receptor)，即键合基团或识别基团，它的功能是结合客体并将结合信息传递给荧光团，使其所处的化学环境或本身的性质发生改变；(2)荧光团部分(fluorophore)，即信号基团，它的功能是吸收光能，发出荧光信号且它的发射强度与识别基团的结合状态有关，可以直接把识别基团与被分析物结合所引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号；(3)连接体部分，也称间隔基团(spacer)，它的功能是负责连接荧光团和接受体，使识别信息有效地转化为荧光强度的变化，实现对待测物的定性定量检测。

常见的荧光分子探针的基本设计机理有光诱导电子转移(photoinduced electrontransfer，PET)，分子内电荷转移(intromolecular charge transfer，ICT)，激基缔合物(excimer)，荧光共振能量转移(fluorescence energy transfer，FRET)等。

为满足日新月异的生物分析应用对荧光染料的需求，研究开发出更多的具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的关键和核心。目前使用比较多的罗丹明类、荧光素类、BODIPY类和菁类等荧光染料，其中有些品种已经商品化了。但这些商品化的染料大部分光谱都处在紫外可见区，而生物样品自身在这个区域有很强的吸收，荧光检测时会显现出一定强度的自发荧光，造成强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。近红外荧光染料由于能避开这个问题近年来受到了广泛的重视。在荧光技术从培养皿研究阶段发展到动物模型研究阶段过程中起最关键作用的就是近红外荧光染料和以它们为基础设计的分子探针。其中七甲川菁染料作为最主要的近红外荧光团更成为研究和应用的焦点。钯是一种稀有过渡金属，广泛用于各种材料，如牙冠，催化转化器，燃料电池和珠宝中。钯催化反应，如Buchwald-Hartwig、Heck、Sonogashira、Suzuki-Miyaura反应，在复杂分子的合成过程中起到极其重要的作用。钯在社会生产活动中应用范围非常广泛，对于痕量钯的定量检测近年来引起研究人员越来越广泛的关注，因为痕量钯的检测识别直接关系到钯残留水平的评估及钯污染问题的控制，对于自然环境中(水环境及土壤环境)的钯检测问题显得

尤为重要。另外，钯作为催化剂用于催化合成具有复杂结构的有机分子在制药工业中有广泛的应用，因此药物分子中的含钯分析同样具有重要意义。

典型的钯检测分析方法包括原子吸收光谱法(AAS)，等离子发射光谱法(ICP-AES)，固相微萃取高效液相色谱法(SPME-HPLC)，X射线荧光光谱法等。但是，这些方法通常需要大型分析检测仪器，复杂的样品预处理过程，而且需要经过专门训练的人员操作，使得这些检测方法成本很高，难于普及应用。分子探针用于钯检测通常有比色法和荧光淬灭法。作为重金属离子，钯通常对荧光团有较强的荧光淬灭作用，因此需要设计荧光增强型钯探针。

已报道的对钯离子有选择性的荧光增强型探针有以下几例：第一例是硫杂醚类马来腈钯离子荧光探针，通过硫杂原子对钯离子的络合而产生光谱的变化，激发光不在可见光区，并且不能用于检测零价钯。(Thomas Schwarze，Holger Muller，Carsten Dosche，Tillmann Klamroth，Wulfhard Mickler，Alexandra Kelling，Hans-Gerd Lohmannsroben，Peter Saalfrank，andHans-Jurgen Holdt.Angew.Chem.Int.Ed.，2007，46，1671-1674)。第二例是基于荧光素的Tsuji-Trost烯丙基的氧化插入反应型钯荧光探针，其最大的不足之处就是光谱不在近红外区域。(Fengling Song，Amanda L. Garner，and Kazunori Koide，J.Am.Chem.Soc.，2007，129(41)，12354-12355)。第三例是基于烯丙基络合钯离子设计的罗丹明类荧光探针，但也有平衡时间过长的不足之处。(Honglin Li，Jiangli Fan，Jianjun Du，Kexin Guo，Shiguo Sun，Xiaojian Liu andXiaojun Peng，Chem.Commun.，2010，DOI：10.1039/b916915f)。

发明内容

钯在社会生产活动中应用范围非常广泛，对于痕量钯的定量检测近年来引起研究人员越来越广泛的关注，因为痕量钯的检测识别直接关系到钯残留水平的评估及钯污染问题的控制。痕量钯可能通过饮用水或生物链被人体吸收从而对人体健康产生危害。因此，迫切需要一种方便，快捷，能够用于生物成像和复杂环境中含钯分析的近红外荧光分子探针。

开发新的荧光染料，该荧光染料应当具有以下优点：在不存在钯时有一定的荧光，与钯反应后荧光不会被淬灭，且对钯以外的金属无亲和力或亲和力可忽略不计；具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性，能进入活细胞中染色；光谱范围在近红外区，不造成细胞或组织损伤。

本发明使用七甲川菁类荧光染料，通过与钯离子反应，使得整个分子有明显的颜色变化(从绿色到蓝色)和荧光信号的变化，其中颜色变化裸眼可见。该识别反应条件温和，在室温下即可快速完成，具有单一的选择性。此外，该探针分子灵敏度很好，在ppb级浓度钯离子存在下荧光就有明显的变化，并且荧光强度增加与钯离子的浓度呈现良好的线性关系。因此，本发明的七甲川菁类探针化合物能够用于选择性检测环境中的ppb级浓度的钯离子及零价钯，同时提供增强型的荧光信号，并且能够用于生物成像和复杂环境中的含钯分析。

本发明中检测零价钯时用的还原剂是PEG系列，跟传统的还原剂PPh3相比，PEG系列具有更好的生物相容性，更低的生物毒性以及更广泛的应用前景。

本发明的技术方案如下：

进一步特征，上述的一类近红外荧光探针化合物具有如下结构通式I：

其中：X为C(CH₃)₂、O、S或Se。

R₁选自C_1-18烷基或苄基，R₂选自C_1-18烷基或苄基。

R₃为H、SO₃R₆、CO₂R₇或NCS，R₄为H、SO₃R₆、CO₂R₇或NCS。

R₅R₆选自C_1-18烷基或苄基，。

Y^-为负离子。

苄基上可以包含下列取代基：H、C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素或C_1-6卤代烷基。

本发明还提供一种制备所述的化合物I的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将化合物II溶解在甲苯溶剂中，然后向其中加入一定量的RY，在氮气保护下加热回流5-10h，得到粉红色固体，超声使壁上固体进入液体中，抽滤，并用乙醚洗几次，真空干燥。其中R为权利要求1中的R₁或R₂，R’为R₃或R₄，式II化合物与RY化合物的投料摩尔比为1∶1-1∶10；

(2)在冰浴(0-5℃)条件下将三氯氧磷和干燥的二氯甲烷的混合液逐滴加入由干燥的二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(1∶1，V/V)的混合液中，然后再逐滴加入一定量的环己酮。撤下冰浴，将反应液加热到回流，反应3-5h，用冰水浴冷却，然后分批倒入碎冰中。放置过夜，得到红色固体，过滤，固体以冰冻的丙醇分批少量洗涤至黄色。产品于氮气保护下置于冰箱中保存，备用。

(3)依次加入季铵盐III和缩合剂VI，再加入正丁醇∶甲苯(V/V)＝7∶3，氮气保护下加热回流5-10h；旋转蒸发除去正丁醇和甲苯，加入甲醇，超声溶解，溶解后的溶液加入到激烈搅拌中的乙醚，乙醚的使用量为甲醇量的1.5-2倍，析出固体；过滤得到粗产品，干燥后用水重结晶两次，密封避光保存；

(4)染料VI预先在50-60℃下真空干燥8 h，亲核试剂R₅NH₂预先减压蒸馏精制。所用仪器预先在120℃下干燥3 h，在氮气氛下冷却后，加入染料VI和亲核试剂R₅NH₂；氮气氛下加入无水DMF和缚酸剂DIEA。反应混合物在氮气保护下保温40-55℃搅拌2h。反应液倒入快速搅拌的乙醚中，大量蓝色固体沉淀生成。过滤得到染料粗品VII后用柱色谱提纯。

(5)染料VII预先在50-60℃下真空干燥8h，亲核试剂氯甲酸烯丙酯预先减压蒸馏精制。所用仪器预先在120℃下干燥3h，在氮气氛下冷却后，加入染料VII和亲核试剂氯甲酸烯丙酯。氮气氛下加入无水二氯甲烷和缚酸剂DIEA。反应混合物在氮气保护下室温搅拌2h。反应液倒入快速搅拌的乙醚中，大量绿色固体沉淀生成。过滤得到染料粗品VIII后用柱色谱提纯。

附图说明

图1是本发明实施例3的荧光探针化合物VIIIa对钯离子的选择性荧光发射光谱在750nm处的柱状图。从图中可以看到，荧光探针化合物VIIIa对钯具有很高的选择性，钯离子的加入会使荧光在750nm处产生很强的荧光信号，另外其它离子如钠，钾，钙，镁，铜等金属离子对测试没有响应。探针浓度为20μM，其它金属离子的终浓度为10μM。横坐标代表其它金属离子，纵坐标为750 nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

图2是荧光探针化合物VIIIa与不同浓度的钯离子响应后的光谱变化图。从图中可以看到，随着钯离子浓度的增大，750nm处的荧光强度逐渐增加，而815nm处的荧光强度基本不变，呈现很好的线性关系。探针浓度为20μM，钯离子的浓度变化从小到大依次为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

图3是金属阳离子对荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的干扰图。从图中可以看出，不仅一般的金属离子如钠，钾，镁，钙等对检测没有影响，很多重金属离子如汞，银，铬等对测试也没有影响，并且铂族其它离子如铂，钌对测试也没有干扰。探针浓度为20μM，其它金属离子的终浓度为10μM。横坐标代表其它金属离子，纵坐标为750 nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

图4是阴离子对荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的干扰图。从图中可以看出，各种阴离子对测试均没有干扰。探针浓度为20μM，其它阴离子的终浓度为10μM。横坐标代表其它阴离子，纵坐标为750nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

图5是荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的灵敏度光谱图。从图中可以看出荧光探针化合物VIIIa在0-10 ppb的范围内750nm处的荧光强度有明显增强，且荧光强度随钯离子浓度变化呈现很好的线性关系。因此荧光探针化合物VIIIa可用于低浓度钯离子的检测。横坐标为钯离子浓度(ppb)，纵坐标为750 nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。

图6是荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的生物应用图。图6为只用荧光探针化合物VIIIa孵育处理的活细胞MCF-7扫描图片，图7为用荧光探针化合物VIIIa、钯离子和PEG400孵育处理后对MCF-7细胞扫描的图片，其中A图为对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，B图是对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片。如图可观察到只用荧光探针化合物VIIIa孵育处理的图6在635 nm的激发光下基本没有荧光，而用荧光探针化合物VIIIa、钯离子和PEG400孵育后的图7在635 nm的激发光下有明显的荧光，这说明荧光探针化合物VIIIa检测钯离子可在活细胞MCF-7中进行。仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：635nm。

具体实施方式

实施例1  含氯桥环母体Cy7染料VIa的合成路线

(1)中间体2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉的合成

1000mL三口烧瓶中，依次加入150mL冰醋酸，84mL(0.8mol)3-甲基-2-丁酮和0.26mol对肼基苯。混合物加热回流3 h，反应物倒入烧杯中，静置冷却后有粉红色固体析出。过滤，真空干燥，得2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉，产率75％。

(2)中间体N-乙基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉的合成

在100mL圆底烧瓶中，依次加入15.9 g(0.1mol)2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉，23.4g(0.15mol)碘乙烷，甲苯65mL，在氮气保护下加热回流反应5h，得到粉红色固体，超声使壁上固体进入液体中，过滤，用乙醚反复洗几次，真空干燥。

(3)缩合剂2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯的合成

在冰浴(0-5℃)条件下将37mL三氯氧磷和35mL干燥的二氯甲烷的混合液逐滴加入80mL由干燥的二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(1∶1，V/V)的混合液中，然后再逐滴加入10g环己酮。撤下冰浴，将反应液加热到回流，反应3-5h，用冰水浴冷却，然后分批倒入200g碎冰中。放置过夜，得到红色固体，过滤，固体以冰冻的丙醇分批少量洗涤至黄色。产品于氮气保护下置于冰箱中保存，备用。

(4)含氯桥环母体Cy7染料VIa的合成

在250mL圆底烧瓶中依次加入8mmol季铵盐和4mmol缩合剂，再加入正丁醇∶甲苯(V/V＝7∶3)300mL，加上分水器，分水器中加入甲苯溶剂，氮气保护下加热回流5-10h，溶液逐渐由浅红色变成深红色，最后出现大量绿色组分。旋转蒸发除去正丁醇和甲苯，加入甲醇，超声溶解，加入相对于甲醇量1.5-2倍激烈搅拌中的乙醚，立即有大量的固体析出，用砂芯漏斗过滤，乙醚洗涤，粗产品干燥后用水重结晶两次，密封避光保存。

实施例2  染料VIIa的合成及表征

染料VIa预先在50-60℃下真空干燥8h，亲核试剂C₂H₅NH₂预先减压蒸馏精制。所用玻璃仪器预先在120℃下干燥3h，所用的三口圆底烧瓶在氮气氛下冷却后，加入0.12 mmol染料VIa和1.2mmol亲核试剂C₂H₅NH₂。氮气氛下用注射器加入约15mL无水DMF做溶剂和3 mmol缚酸剂DIEA。反应混合物在氮气保护下保温40-55℃搅拌2h。反应液倒入快速搅拌的300mL乙醚中，大量蓝色固体沉淀生成。用砂芯漏斗过滤掉滤液，得到固体用甲醇从漏斗上溶解下来，蒸干甲醇，得到染料粗品VIIa后用柱色谱提纯。1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ 7.73(d，J＝9.8Hz，2H)，7.27(dd，J＝8.8，5.6 Hz，6H)，7.04(t，J＝7.4 Hz，2H)，6.84(d，J＝8.1 Hz，2H)，5.59(d，J＝12.4 Hz，2H)，3.91-3.77(m，4H)，2.49(t，J＝6.3 Hz，4H)，2.07-1.94(m，2H)，1.82(dt，J＝12.86.5 Hz，2H)，1.76-1.62(m，12H)，1.33(t，J＝14.1 Hz，6H)，1.29-1.19(m，2H)，0.98(t，J＝7.3 Hz3H).

实施例3  染料VIIIa的合成及表征

染料VIIa预先在50-60℃下真空干燥8 h，亲核试剂氯甲酸烯丙酯预先减压蒸馏精制。所用玻璃仪器预先在120℃下干燥3h，所用的三口圆底烧瓶在氮气氛下冷却后，加入0.1mmol染料VIIa和1mmol亲核试剂氯甲酸烯丙酯。氮气氛下用注射器加入约10mL无水二氯甲烷做溶剂和2.5mmol缚酸剂DIEA。反应混合物在氮气保护下室温搅拌2h。反应液倒入快速搅拌的乙醚中，大量绿色固体沉淀生成。用砂芯漏斗过滤掉滤液，得到固体用甲醇从漏斗上溶解下来，蒸干甲醇，得到染料粗品VIIIa后用柱色谱提纯。1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ 7.65(d，J＝14.0 Hz，2H)，7.40(t，J＝7.6 Hz，2H)，7.34(d，J＝7.3 Hz，2H)，7.24(t，J＝7.4Hz，2H)，7.19(d，J＝7.9 Hz，2H)，6.25(d，J＝14.0 Hz，2H)，5.83-5.65(m，1H)，5.14(d，J＝17.1 Hz，1H)，5.05(d，J＝10.4 Hz，1H)，4.53(d，J＝4.8 Hz，2H)，4.28(d，J＝6.6 Hz，4H)，3.62-3.50(m，2H)，2.84(d，J＝16.0 Hz，2H)，2.60(s，2H)，2.00(s，6H)，1.78-1.68(m，2H)，1.66(s，6H)，1.58(s，6H)，1.46(t，J＝6.6 Hz，6H)，0.94(t，J＝7.3 Hz，3H).

实施例4  荧光探针化合物VIIIa对钯离子选择性

使用上述合成的化合物VIIIa评价对钯离子的选择性。配置浓度为10mM的化合物VIIIa的DMSO(二甲基亚砜)溶液和0.1M，pH＝7.4的PBS磷酸缓冲液以及60mM的硼氢化钠溶液。分别取1.5mL的PBS磷酸缓冲液和PEG400于小瓶中，然后向其中加入6μL探针溶液，使探针的终浓度为20μM，然后再向其中分别加入配好的各种金属离子，使各种金属离子的终浓度为10μM，最后向各小样中加入5μL的60 mM的硼氢化钠溶液。摇晃均匀后放置于37℃的水浴锅中，1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为790nm，探针发射波长为815nm，探针与钯反应后的产物VIIa激发波长为640nm，发射波长为750nm，测试结果显示于图1中。从图中可以看到，荧光探针化合物VIIIa对钯具有很高的选择性，钯离子的加入会使荧光在750nm处产生很强的荧光信号，另外其它离子如钠，钾，钙，镁，铜等金属离子对测试没有响应。横坐标代表其它金属离子，纵坐标为750nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

实施例5  荧光探针化合物VIIIa与不同浓度的钯离子响应后的光谱变化

配置浓度为10mM的化合物VIIIa的DMSO(二甲基亚砜)溶液和0.1M，pH＝7.4的PBS磷酸缓冲液以及60mM的硼氢化钠溶液。分别取1.5mL的PBS磷酸缓冲液和PEG400于小瓶中，然后向其中加入6μL探针溶液，使探针的终浓度为20μM，向其中加入钯离子的浓度变化从小到大依次为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM。最后向各小样中加入5μL的60 mM的硼氢化钠溶液。摇晃均匀后放置于37℃的水浴锅中，1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为790nm，探针发射波长为815nm，探针与钯反应后的产物VIIa激发波长为640nm，发射波长为750nm，测试结果显示于图2中。从图中可以看到，随着钯离子浓度的增大，750nm处的荧光强度逐渐增加，而815nm处的荧光强度基本不变，呈现很好的线性关系。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

实施例6  金属阳离子对荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的干扰研究

配置浓度为10 mM的化合物VIIIa的DMSO(二甲基亚砜)溶液和0.1M，pH＝7.4的PBS磷酸缓冲液以及60mM的硼氢化钠溶液。分别取1.5mL的PBS磷酸缓冲液和PEG400于小瓶中，然后向其中加入6μL探针溶液，使探针的终浓度为20μM，再向其中加入钯离子，使钯离子终浓度为10μM，然后再向其中分别加入配好的各种金属离子，使各种金属离子的终浓度为10μM，最后向各小样中加入5μL的60mM的硼氢化钠溶液。摇晃均匀后放置于37℃的水浴锅中，1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为790nm，探针发射波长为815nm，探针与钯反应后的产物VIIa激发波长为640nm，发射波长为750nm，测试结果显示于图3中。从图中可以看出，不仅一般的金属离子如钠，钾，镁，钙等对检测没有影响，很多重金属离子如汞，银，铬等对测试也没有影响，并且铂族其它离子如铂，钌对测试也没有干扰，显示了荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的优越性。横坐标代表其它金属阳离子，纵坐标为750nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

实施例7  阴离子对荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的干扰研究

配置浓度为10mM的化合物VIIIa的DMSO(二甲基亚砜)溶液和0.1M，pH＝7.4的PBS磷酸缓冲液以及60mM的硼氢化钠溶液。分别取1.5mL的PBS磷酸缓冲液和PEG400于小瓶中，然后向其中加入6μL探针溶液，使探针的终浓度为20μM，再向其中加入钯离子，使钯离子终浓度为10μM，然后再向其中分别加入配好的各种阴离子，使各种阴离子的终浓度为10μM，最后向各小样中加入5μL的60mM的硼氢化钠溶液。摇晃均匀后放置于37℃的水浴锅中，1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为790nm，探针发射波长为815nm，探针与钯反应后的产物VIIa激发波长为640nm，发射波长为750nm，测试结果显示于图4中。从图中可以看出，各种阴离子对测试均没有干扰。横坐标代表其它阴离子，纵坐标为750nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

实施例8  荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的灵敏度

配置浓度为10mM的化合物VIIIa的DMSO(二甲基亚砜)溶液和0.1M，pH＝7.4的PBS磷酸缓冲液以及60mM的硼氢化钠溶液。分别取1.5mL的PBS磷酸缓冲液和PEG400于小瓶中，然后向其中加入6μL探针溶液，使探针的终浓度为20μM，再向其中加入钯离子，使得钯离子的终浓度依次为0-10ppb，最后向各小样中加入5μL的60mM的硼氢化钠溶液。摇晃均匀后放置于37℃的水浴锅中，1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为790nm，探针发射波长为815nm，探针与钯反应后的产物VIIa激发波长为640nm，发射波长为750nm，测试结果显示于图5中。从图中可以看出荧光探针化合物VIIIa在0-10ppb的范围内750nm处的荧光强度有明显增强，且荧光强度随钯离子浓度变化呈现很好的线性关系。因此荧光探针化合物VIIIa可用于低浓度钯离子的检测。横坐标为钯离子浓度(ppb)，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS 55。

实施例9  荧光探针化合物VIIIa检测钯离子的生物应用

加配有荧光探针化合物VIIIa、浓度为1mM的PBS缓冲液6μL于培养好MCF-7细胞的培养皿中，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，再向其中加入1mL的PEG400和20μL 1mM的氯化钯溶液，摇晃均匀，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中再孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(TCS-SP2，Germany)观察细胞形态。选取代表性区域，635nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图6为只用荧光探针化合物VIIIa孵育处理的活细胞MCF-7扫描图片，图7为用荧光探针化合物VIIIa、钯离子和PEG400孵育处理后对MCF-7细胞扫描的图片，其中A图为对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，B图是对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片。如图可观察到只用荧光探针化合物VIIIa孵育处理的图6在635nm的激发光下基本没有荧光，而用荧光探针化合物VIIIa、钯离子和PEG400孵育后的图7在635nm的激发光下有明显的荧光，这说明荧光探针化合物VIIIa检测钯离子可在活细胞MCF-7中进行。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：635nm。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光探针是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光探针，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一类近红外荧光探针化合物，所述化合物具有如下结构通式Ⅰ：

其中：X为C(CH₃)₂；

R₁选自C_1-18烷基或苄基，R₂选自C_1-18烷基或苄基；

R₃为H或NCS；R₄为H或NCS；

R₅选自C_1-18烷基或苄基；

其中负离子Y^-为卤素离子、ClO4^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-。

2.根据权利要求1所述的一类近红外荧光探针化合物，其特征在于，

所述苄基包含下列取代基：C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素或C_1-6卤代烷基。

3.制备权利要求1或2所述一类近红外荧光探针化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将化合物II溶解在甲苯溶剂中，然后向其中加入RY，在氮气保护下加热回流5-10h，得到粉红色固体，超声使壁上固体进入液体中，抽滤，并用乙醚洗几次，真空干燥；其中R为权利要求1中的R₁或R₂，R′为R₃或R₄，式Ⅱ化合物与RY化合物的投料摩尔比为1:1-1:10；

(2)在0-5℃冰浴条件下将三氯氧磷和干燥的二氯甲烷的混合液逐滴加入由干燥的二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺(1：1，V/V)的混合液中，然后再逐滴加入环已酮；撤下冰浴，将反应液加热到回流，反应3-5h，用冰水浴冷却，然后分批倒入碎冰中；放置过夜，得到红色固体，过滤，固体以冰冻的丙醇分批少量洗涤至黄色；产品于氮气保护下置于冰箱中保存，备用；

(3)依次加入季铵盐Ⅲ和缩合剂Ⅵ，再加入正丁醇：甲苯(V/V)＝7：3，氮气保护下加热回流5-10h；旋转蒸发除去正丁醇和甲苯，加入甲醇，超声溶解，溶解后的溶液加入到激烈搅拌中的乙醚，乙醚的使用量为甲醇量的1.5-2倍，析出固体；过滤得到粗产品，干燥后用水重结晶两次，密封避光保存；

(4)染料Ⅵ预先在50-60℃下真空干燥8h，亲核试剂R₅NH₂预先减压蒸馏精制；所用仪器预先在120℃下干燥3h，在氮气氛下冷却后，加入染料Ⅵ和亲核试剂R₅NH₂；氮气氛下加入无水DMF和缚酸剂DIEA；反应混合物在氮气保护下保温40-55℃搅拌2h；反应液倒入快速搅拌的乙醚中，大量蓝色固体沉淀生成；过滤得到染料粗品Ⅶ后用柱色谱提纯；

(5)染料Ⅶ预先在50-60℃下真空干燥8h，亲核试剂氯甲酸烯丙酯预先减压蒸馏精制；所用仪器预先在120℃下干燥3h，在氮气氛下冷却后，加入母体染料Ⅶ和亲核试剂氯甲酸烯丙酯；氮气氛下加入无水二氯甲烷和缚酸剂DIEA；反应混合物在氮气保护下室温搅拌2h；反应液倒入快速搅拌的乙醚中，大量绿色固体沉淀生成；过滤得到染料粗品Ⅷ后用柱色谱提纯；