CN103834382B - 一种近红外荧光分子探针及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种近红外荧光分子探针，其结构式如下。本发明还提供了一种上述近红外荧光分子探针的制备方法。本发明还提供了上述的近红外荧光分子探针在MCF-7细胞中成像的应用。本发明提供的近红外荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为检测生物成像的近红外荧光探针。
Description
技术领域
本发明属于生化检测领域，特别涉及一种新的近红外荧光分子探针，还涉及该分子探针的制备方法及其细胞成像中的应用。
背景技术
随着生物成像相关技术的发展,医学影像学已成为医学应用和生命科学交叉的关键科学。当前,医学影像技术呈现多极化发展的趋势,主要包括:磁共振成像、计算机X射线断层摄影术、单光子发射计算机断层摄影术、正电子发射断层摄影术、超声成像术等[邓大伟,刘飞,曹洁等.中国激光,2010,37(11)2735-2742.]。尽管这些技术有着许多优点,但是也有很多不足,如操作复杂、空间时间分辨率不高、设备比较昂贵等。因此,如何进行无创伤的诊断并让它在一定程度上替代常规解剖成像仍旧是研究热点之一[李钻芳,黄祖芳,陈荣等.中国激光,2009,36(3):765-768.]。
近红外光系指位于近红外光区(>700nm)的电磁波。由于在此区间内生物活体组织中的水、血红蛋白及脂质等对光波吸收很少,近红外光在生物组织中穿透深度大,可以在深层组织产生光信号,而对组织本身几乎无影响。
近年来近红外荧光成像技术快速发展。目前,该技术已广泛应用于心血管疾病成像、细胞凋亡成像、肿瘤受体成像、微量生物活性物质检测、近红外荧光免疫分析等生物医学工程领域[Y.Q.Gu,Z.Y.Qian,Y.L.Song.EncyclopaediaofHeathcareInformationSystem,IGIGlobal,2008.D.Maxwell,Q.Chang,X.Zhang.Bioconjug.Chem.,2009,20(4):702-709.],以其无损、实时、安全等在位监测等优势受到了科研工作者的青睐。
当前,近红外荧光成像发展的方向主要包括新的特异性靶向探针的合成，以及新的生物相容性好的近红外荧光染料的制备,并将其应用于各种不同疾病的实验性研究中[QianHuimin,ChenHaiyan,WangMin.Pharma.Bio.,2006,13(4):306-309.J.Zhang,Y.Q.Gu.Nanotechnology,2009,20(32):325102-325109.]。在各种研究中,近红外荧光探针已被大量地开发出来,种类众多,主要包括有机荧光染料、无机和生物纳米粒子等[D.W.Deng,W.H.Zhang,X.Y.Chen.Eur.J.Inorg.Chem.,2009,2009(23):3440-3446.]。在当前有机近红外荧光染料相关的研究中，多次甲基菁类杂环化合物是一类重要的且使用广泛的近红外荧光染料。其中最具有代表性的就是吲哚菁绿(IndocyanineGreen，ICG)，是一种全合成的三羧花青系诊断试剂，1955年由美国柯达实验室研发，1956年Fox等首先将其应用于肝功能及循环功能检查，1970年以后广泛应用于眼科血管造影[张承芬,陈有信.中华眼底病杂志,1988,14(2):66-67.]。菁染料（包括ICG衍生物、IRDye系列及Cy系列）是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，其琥珀酰亚胺酯是最常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。菁染料Cy3和Cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物；另外,Cy5,Cy5.5和Cy7的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料，特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。然而，由于菁染料尤其是不对称菁染料的合成副反应多,副产物极性相近,产物的分离提纯相当困难。菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大,分离提纯越加困难。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种灵敏度高、结果准确、可用于细胞成像的近红外荧光分子探针。
本发明的第二目的在于提供上述荧光分子探针的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述荧光分子探针的应用。
技术方案：本发明提供的一种近红外荧光分子探针，其结构式如下：
本发明还提供了一种上述近红外荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）在氩气或氮气保护下，化合物5和化合物4反应，制得化合物3；
（2）在氩气或氮气保护下，化合物3与化合物2反应，即得；
其中，化合物5的结构式为：
其中，化合物4的结构式为：
其中，化合物3的结构式为：
其中，化合物2的结构式为：
反应路线如下：
其中，步骤（1）中，化合物5和化合物4的摩尔比为1：（1-6），反应温度为-5-0℃，反应时间为1～3h，反应溶剂为THF或者DMSO。
其中，步骤（1）中，化合物3和化合物2的摩尔比为2:1，反应温度为20-30℃，反应时间8-12h。
其中，步骤（2）中，还可加入催化剂无水乙酸钠，催化剂的物质的量与化合物3的物质的量相同。
其中，步骤（2）中，反应后还需纯化工艺，具体为：减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经柱层析，即得。
其中，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，优选乙醚、甲基叔丁基醚或正己醚，醚类溶剂加入量可根据需要选择，优选地为减压浓缩后的反应液的体积的3-5倍。
其中，色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比4:1～8:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或为体积比3:1～6:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。
本发明还提供了上述的近红外荧光分子探针在细胞成像中的应用。
本发明还提供了上述的近红外荧光分子探针在MCF-7细胞中成像的应用。
有益效果：本发明提供的近红外荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为检测生物成像的近红外荧光探针。该荧光分子探针在分析化学、生命科学、环境科学等领域具有较强的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明的近红外荧光分子探针的IR图。
图2是本发明的近红外荧光分子探针的1HNMR图。
图3是本发明的近红外荧光分子探针的MS图。
图4是本发明的近红外荧光分子探针的吸收光谱图。
图5是本发明的近红外荧光分子探针的发射光谱图。
图6为本发明的近红外荧光分子探针在活的MCF-7细胞内成像图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL无水四氢呋喃（THF）搅拌溶解，氩气保护下,0℃滴加0.30mmol化合物4，0℃搅拌2h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.11g白色粉末状固体。收率：61.11%。Mp=247-248℃。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氩气保护下加入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，30℃反应10h，反应结束。将反应液倒入100mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比4:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得55mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。收率：13.97%。
其红外谱图见图1，氢谱谱图见图2，质谱谱图见图3。
IR（KBr,cm-1）3422（w,-OH），2931（w,-CH3），1699（w,C=O），1612（w,C=N），1513（w,C=C），1385,1357（S=O）。
1H-NMR（300MHz，DMSO-d6）δ(ppm)=8.26-8.30（d,J=12Hz,2H），8.14（s,2H），8.01-8.04（m,2H），7.50-7.53（d,J=9.00Hz,2H），6.36-6.41（d,J=15.00Hz,2H），3.71（s,6H），2.70-2.74（d,J=12.00Hz,4H），1.87（m,2H），1.70（s,12H）。
TOF-MSm/z：574.2[M+H]+。
其吸收光谱见图4，其发射光谱见图5。
实施例2
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL无水四氢呋喃（THF）搅拌溶解，氩气保护下,0℃中滴加0.60mmol化合物4，0℃搅拌3h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.10g白色粉末状固体。。Mp=247-248℃。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氩气保护下加入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，20℃反应10h，反应结束。将反应液倒入100mL乙醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比8:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得53mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。
实施例3
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL无水四氢呋喃（THF）搅拌溶解，氩气保护下,0℃滴加0.90mmol化合物4，0℃搅拌2h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.105g白色粉末状固体。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氩气保护下加入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，30℃反应12h，反应结束。将反应液倒入100mL乙醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比3:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物，得53.5mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。
实施例4
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL无水四氢呋喃（THF）搅拌溶解，氩气保护下,0℃滴加1.20mmol化合物4，0℃搅拌3h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.098g白色粉末状固体。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氩气保护下加入入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，20℃反应8h，反应结束。将反应液倒入100mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比6:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物，得51.3mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。
实施例5
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL无水四氢呋喃（THF）搅拌溶解，氩气保护下,-5℃滴加1.50mmol化合物4，0℃搅拌3h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.10g白色粉末状固体。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氩气保护下加入入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，30℃反应10h，反应结束。将反应液倒入100mL乙醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比4:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物，得54.3mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。
实施例6
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL无水四氢呋喃（THF）搅拌溶解，氩气保护下,-3℃滴加1.50mmol化合物4，-3℃搅拌3h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.10g白色粉末状固体。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氩气保护下加入入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，25℃反应10h，反应结束。将反应液倒入5倍体积的甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比6:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得54.9mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。
实施例7
将0.25mmol化合物5加入到100mL反应瓶中，加入50mL二甲基亚砜（DMSO）搅拌溶解，氮气保护下,0℃中滴加0.25mmol化合物4，0℃搅拌1h，反应结束。产物从体系中析出，过滤，干燥，得0.10g白色粉末状固体。
取0.54mmol化合物3加入到50mL的反应瓶中，加入20mL乙酸酐搅拌溶解，氮气保护下加入入0.27mmol化合物2及0.54mmol无水乙酸钠，20℃反应10h，反应结束。将反应液倒入3倍体积的正己醚中，析出绿色固体，200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比5:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得53.1mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。
实施例8
应用本发明近红外荧光分子探针在活的MCF-7细胞内成像，检测该探针是否能在生物体中成像。
37℃在MCF-7细胞中加入本发明近红外荧光分子探针（10μM）孵育30min，然后用PBS缓冲溶液（0.1M，pH7.4）冲洗3遍。在激发波长为789nm下观察探针在MCF-7细胞中的荧光分布情况。从图6a中我们可以看到本发明近红外荧光分子探针可以透过细胞膜,在细胞内部现出较强的荧光。在明场图片中（图6b）证实了MCF-7细胞是具有活性的。
实验结果证实，在MCF-7细胞中加入本发明近红外荧光分子探针后显现出的近红外荧光，这也说明了该探针能够使细胞产生近红外荧光成像,且荧光强度较强。
Claims (4)
1.一种近红外荧光分子探针的制备方法，所述近红外荧光分子探针，其结构式如下：
其特征在于：包括以下步骤：
(1)在氩气或氮气保护下，化合物5和化合物4反应，制得化合物3；化合物5和化合物4的摩尔比为1∶(1-6)，反应温度为-5-0℃，反应时间为1～3h，反应溶剂为THF或者DMSO；
(2)在氩气或氮气保护下，化合物3与化合物2反应，即得；化合物3和化合物2的摩尔比为2∶1，反应温度为20-30℃，反应时间8-12h；
其中，化合物5的结构式为：
其中，化合物4的结构式为：
其中，化合物3的结构式为：
其中，化合物2的结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，反应后还需纯化工艺，具体为：减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经柱层析，即得。
3.根据权利要求2所述的一种近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于：所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物。
4.根据权利要求2所述的一种近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于：色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比4∶1～8∶1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或为体积比3∶1～6∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。
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