CN109776379A - 一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法 - Google Patents

一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法，属于生物荧光分析技术领域。本发明的近红外荧光探针为基于苯甲酰肼结构的近红外花菁素类探针，其结构通式如下所示。利用酰肼基团R3或R4作为与环境pH作用的基团，将苯甲酰肼通过醚键和近红外荧光团(多甲川花菁IR780)相连接的方式构建得到本发明的近红外荧光探针。本发明的近红外荧光探针可用于活细胞内外源性pH及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的生物成像，其合成方法简单易行，有利于在工业上推广生产。

Description

一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近 红外荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物荧光分析技术领域所用的荧光染料，具体涉及一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针及其制备方法。
背景技术
人体是一个十分复杂的微环境系统，对于研究一些生理病理过程，pH是一个十分重要的指标。如肿瘤的pH范围约为6.4-7.2，溶酶体pH值范围约为4.0-6.0等。维持细胞组织的生理pH值或者干扰病理组织的pH值，对于临床治疗具有十分重要的科学意义。
荧光成像技术具有时空分辨率高、灵敏度高、选择性好等优点，其中发射波长在650-900 nm的近红外荧光染料，可有效避开组织的自吸收和自荧光干扰，同时，这个波段的荧光对细胞组织的光损伤小，穿透深度大，因此十分适合用于生物系统的成像研究和生物样品的分析研究。相比于其他的pH值测量方法，近红外荧光检测技术在研究生命体的微环境方面具有明显的优势。
目前报道的许多近红外pH荧光探针主要集中在酸性组织和细胞器的研究，如肿瘤和溶酶体等，尚未见到可应用于碱性组织的近红外pH荧光探针的研究报道。生命体如人类确实存在着碱性组织如慢性伤口等，慢性伤口是一种每年困扰数百万人的疾病，主要源于由疾病如糖尿病等导致的难以愈合的伤口溃疡，慢性伤口的发生机理相当复杂，与病菌的感染及患者的身体状况有着密切联系。对慢性伤口发生、发展的监测，对于揭示其发病机理和提供合理的治疗方案有着重要的意义。据报道，慢性伤口的pH变化范围约为7.15-8.9，且其pH大小还与疾病的发展程度有关。针对当前缺乏可用于慢性伤口环境监测的手段的现实，本发明旨在开发具有合适碱性pKa值的近红外pH荧光探针并用于慢性伤口的监测，该发明有助于揭示慢性伤口的病理研究及推动相关药物的研发。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针。本发明的目的还在于提供所述的近红外荧光探针的制备方法。本发明的近红外荧光探针为基于苯甲酰肼结构的近红外花菁素类探针，利用酰肼基团作为与环境pH作用的基团，将苯甲酰肼通过醚键和近红外荧光团(多甲川花菁IR780) 相连接的方式构建荧光探针。该探针在苯甲酰肼未被质子化时由于PET(photo-induced electron transfer，光诱导电子转移)原理呈现出弱荧光，但是在其质子化时则呈现出强荧光，这两种转变取决于苯甲酰肼的pKa值。同时，本发明通过引入具有不同吸(供)电子能力的基团和改变取代基团的位置的方式构建了具有不同pKa值的近红外小分子探针库，通过筛选获得了一个具有合适pKa值(pKa＝8.01)的探针，其可应用于慢性伤口发展过程中的pH变化的成像研究。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针，其结构通式为：
通式中：X为NH、CONH、NHCO、O、S、SO2、SO2NH或NHSO2；
Y为卤素，F、Cl、Br或I；
R1为(CH2)nR5、(CH2)mOR6或(CHR7CH2O)pR6；
R2为(CH2)nR5或(CH2)mOR6；
R3、R4均为H、Cl、Br、I、NO2、CN、CONHNH2、CONHNH3 +或COOR7；
R1、R2中：n、m、p均为0-18中的整数，R5为H或COOR6，R6为H或C1-18烷基；
R3、R4中：R7为H、C1-18烷基或M，M为金属离子如Na+、K+等。
优选的，通式中：X为O，Y为I，R1为CH2CH2CH3，R2为H或OCH3，R3为H、CONHNH2或CONHNH3 +，R4为H、Br、CONHNH2或CONHNH3 +。
所述的可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针的制备方法，为如下方法中的一种：
包括如下步骤的方法一：以间羟基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过溴化、肼解、上Boc 保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针；
包括如下步骤的方法二：以间羟基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针；
包括如下步骤的方法三：以4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针。
一种改变所述近红外荧光探针pKa值的方法，为在所述近红外荧光探针的苯甲酰肼结构上添加具有不同吸/供电子能力的基团和改变取代基团(R3、R4)的位置来改变近红外荧光探针的pKa值。
所述的可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针在检测pH 变化中的应用：所述的近红外荧光探针可用于活细胞内外源性pH及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的生物成像。
本发明以苯甲酰肼(含取代的苯甲酰肼)为探针与质子的作用部分，以近红外菁类染料 IR-780为荧光报道基团，通过一定的连接基团(如醚键)将这两个部位连接得到可用于响应活细胞内pH变化及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的近红外荧光探针。
上述pH变化的pH范围包括pH 7-10。
本发明对于现有技术具有如下优点和效果：
1、本发明提供了一种化学方法，通过在探针分子上简单添加具有不同吸(供)电子能力的基团和改变取代基团的位置来快速构建起具有不同pKa值的近红外小分子探针库。
2、本发明中所有荧光探针的合成路线均较为简洁，操作和后处理简便，只有最后两步需要柱层析纯化，其他步骤均可通过萃取、重结晶等操作获得产物，总收率较高，有利于工业化生产。
3、本发明的近红外荧光探针的最大发射波长为798nm，能有效避开组织的自吸收和自荧光干扰，背景干扰小。同时，这个波段的荧光对细胞组织的光损伤小，穿透深度较大，因此十分适合用于生物系统的pH变化成像研究。
5、本发明的荧光探针显示了优良的选择性。对生理条件下各种金属阳离子、各种阴离子及多种活性氨基酸都几乎无荧光响应。
6、本发明通过筛选，获得了一个具有合适pKa值(pKa＝8.01)的探针，实现了细胞外源性pH变化的共聚焦荧光成像，并首次把荧光小分子探针应用于糖尿病小鼠身上慢性伤口发展过程中pH变化的生物成像，目前尚无类似报道。
附图说明
图1是探针1(上)、2(中)、3(下)(10μM)的紫外吸收光谱对比图。
图2是探针1(上)、2(中)、3(下(10μM)在激发波长为715nm处的荧光光谱对比图。
图3是探针1(上)、2(中)、3(下)(10μM)在激发波长为715nm处的pKa测定对比图。
图4是探针1(10μM)在激发波长为715nm处的离子选择性测试图。
图5是探针1、2、3分别在5μM、10μM、20μM浓度下的细胞毒性测试图。
图6是探针1(15μM)在不同pH缓冲液下的细胞共聚焦荧光图。
图7是利用探针1(15μM)监测糖尿病小鼠慢性伤口模型的第1、4、7天的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
可用于活细胞外源性pH变化荧光成像的荧光探针1、2、3的合成路线如下反应式所示：
备注：IR-780的结构为
(1)化合物1a的合成
将2g(13.1mmol)3-羟基苯甲酸甲酯置于圆底烧瓶中，溶解于8mL四氯化碳中。然后在0℃的条件下缓慢滴加0.7mL(27.3mmol)溴，50℃条件下继续搅拌过夜。反应结束后将反应液置于0℃条件下冷却降温2h后抽滤，得到的滤饼粗产物用四氯化碳重结晶，得到白色结晶固体(1a)2.1g，收率69％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),7.50(d,J＝8.7Hz,1H),7.15(d,J＝3.0Hz, 1H),6.89(dd,J＝8.7,3.0Hz,1H),3.83(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.49,157.21, 135.21,133.34,120.77,117.94,108.76,52.94.HRMS(ESI)for C8H7BrO3[M+Na]+:calcd 254.9431,found 254.9444.
(2)化合物1b的合成
在氩气条件下，将21.7g(434mmol)浓度为85％的水合肼加入到含有6.7g(29mmol)1a的15mL甲醇溶液中。反应混合物在60℃条件下加热反应5h。反应结束后减压去除多余的水合肼和甲醇，并往剩余物中加入水使产物沉淀析出，抽滤，得到白色固体(1b)5.4g，收率80％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(s,1H),9.49(s,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,1H),6.76(dd,J ＝8.5,2.8Hz,1H),6.73(d,J＝2.8Hz,1H),4.46(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.97, 157.03,138.94,133.99,118.51,116.47,108.04.HRMS(ESI)for C7H7BrN2O2[M+Na]+:calcd 254.9519,found 254.9541.
(3)化合物1c的合成
向含有2g(8.6mmol)1b的15mL甲醇溶液中加入2.4mL(10.4mmol)Boc酸酐，并在35℃搅拌过夜。反应结束后除去多余的甲醇，并加入二氯甲烷，搅拌直至析出白色沉淀，经抽滤干燥即可得到白色固体粉末(1c)2.6g，收率90％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.01(s,1H),9.96(s,1H),9.02(s,1H),7.42(d,J＝8.7Hz, 1H),6.86(d,J＝2.7Hz,1H),6.79(dd,J＝8.7,2.7Hz,1H),1.43(s,9H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ167.19,157.04,155.58,137.91,134.24,119.00,116.74,107.81,79.67,28.57.HRMS (ESI)for C12H15BrN2O4[M+Na]+:calcd 354.9923,found 354.9974.
(4)化合物2c的合成
向含有19g(125mmol)2b(化合物2b的合成见Bioorganic&Medicinal Chemistry,2017, 25,3780-3791)的15mL甲醇溶液中加入34mL(150mmol)Boc酸酐，并在35℃搅拌过夜。反应结束后除去多余的甲醇，并加入二氯甲烷，搅拌直至析出白色沉淀，抽滤，即可得到白色固体粉末(2c)28g，收率89％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.09(s,1H),9.72(s,1H),8.87(s,1H),7.53-6.39(m,4H), 1.43(s,9H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.54,157.81,155.94,134.47,129.91,119.09, 118.25,114.83,79.59,28.57.HRMS(ESI)for C12H16N2O4[M+Na]+:calcd275.0955,found 275.0958.
(5)化合物3c的合成
向含有16g(90mmol)3b(化合物3b的合成见Patent JP2015/117182,2015,A)的15mL 甲醇溶液中加入24mL(100mmol)Boc酸酐，并在35℃搅拌过夜。反应结束后除去多余的甲醇，并加入二氯甲烷，搅拌直至析出白色沉淀，抽滤，即可得到白色固体粉末(化合物3c)23g，收率93％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),9.69(s,1H),8.83(s,1H),7.45(s,1H),7.38(d, J＝8.2Hz,1H),6.83(d,J＝8.2Hz,1H),3.82(s,3H),1.43(s,9H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.11,156.11,150.39,147.63,123.86,121.52,115.38,111.71,79.53,56.08,28.57. HRMS(ESI)for C13H18N2O5[M+Na]+:calcd 305.1050,found 305.1047.
(6)化合物1的合成
在氩气保护下，将2g(3mmol)IR-780加入到含有1.5g(4.5mmol)1c和0.62g(4.5mmol)无水碳酸钾的10mL无水DMF中，反应混合物在40℃搅拌4h，反应结束后用100mL 乙酸乙酯稀释反应液，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤2次有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并减压除去乙酸乙酯。利用柱层析法纯化，以甲醇/二氯甲烷(1:15)为洗脱剂，收集得到粗品1d，为绿色固体。将10mL三氟乙酸加入到含有粗品1d的二氯甲烷溶液中，并在30℃搅拌2h，然后减压除去多余的三氟乙酸和二氯甲烷，并利用柱层析法纯化，以甲醇/二氯甲烷 (1:15)作为洗脱剂，得到化合物1，为绿色固体1.75g，收率60％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,J＝14.1Hz,2H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.34(m,4H), 7.25(d,J＝2.8Hz,1H),7.20(t,2H),7.08-7.01(m,3H),6.01(d,J＝14.2Hz,2H),3.98(t,4H), 2.68(t,4H),2.04(m,2H),1.86(m,4H),1.41(s,12H),1.05(t,6H).13C NMR(101MHz, CDCl3)δ172.37,165.82,163.08,158.48,142.14,141.63,141.15,138.45,134.90,128.53,125.19, 122.45,121.71,117.50,116.24,112.66,110.50,100.15,77.31,49.21,45.87,29.67,27.96,24.28, 20.96,20.75,11.60.HRMS(ESI)for C43H51BrN4O2 2+:calcd 367.1592,found 367.1596.
(7)化合物2的合成
在氩气保护下，将92mg(2.3mmol)60％的氢化钠加入到含有568mg(2.25mmol)2c的2mL无水DMF中，室温搅拌30min后，加入1g IR-780(1.5mmol)并升温至40℃搅拌过夜。反应结束后用100mL乙酸乙酯稀释反应液，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤2次有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并减压除去乙酸乙酯。利用柱层析法纯化，以甲醇/二氯甲烷(1:25) 为洗脱剂，收集得到粗品2d，为绿色固体。将10mL三氟乙酸加入到含有粗品2d的二氯甲烷溶液中，并在30℃搅拌2h，然后减压除去多余的三氟乙酸和二氯甲烷，并利用柱层析法纯化，以甲醇/二氯甲烷(1:15)作为洗脱剂，得到化合物2，为绿色固体0.71g，收率53％。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.97(d,J＝14.2Hz,2H),7.65(s,1H),7.55-7.52(m,2H),7.42-7.34(m,5H),7.31-7.15(m,4H),6.19(d,J＝14.2Hz,2H),4.09(t,J＝7.2Hz,4H),2.77(t,J＝ 5.5Hz,4H),2.07(m,2H),1.84(m,4H),1.34(s,12H),1.03(t,J＝7.4Hz,6H).13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ172.41,167.11,163.17,159.94,142.27,141.60,141.04,130.52,128.39,124.87, 121.97,121.54,120.70,118.02,113.56,110.72,99.85,53.47,48.88,45.10,26.81,23.81,20.96, 20.39,10.26.HRMS(ESI)for C43H52N4O2 2+:calcd 328.2041,found 328.2037.
(8)化合物3的合成
在氩气保护下，将92mg(2.3mmol)60％的氢化钠加入到含有635mg(2.25mmol)3c的2mL无水DMF中，室温搅拌30min后，加入1g IR-780(1.5mmol)并升温至40℃搅拌过夜。反应结束后用100mL乙酸乙酯稀释反应液，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤2次有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并减压除去乙酸乙酯。利用柱层析法纯化，以甲醇/二氯甲烷 (1:25)为洗脱剂，收集得到粗品3d，为绿色固体。将10mL三氟乙酸加入到含有粗品3d 的二氯甲烷溶液中，并在30℃搅拌2h，然后减压除去多余的三氟乙酸和二氯甲烷，并利用柱层析法纯化，以甲醇/二氯甲烷(1:15)作为洗脱剂，得到化合物3，为绿色固体0.74g，收率58％。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.93(d,J＝14.2Hz,2H),7.74(d,J＝1.0Hz,1H),7.48-7.14(m, 9H),6.90(d,J＝8.3Hz,1H),6.19(d,J＝14.2Hz,2H),4.18(s,3H),4.10(t,J＝7.1Hz,4H),2.76 (t,4H),2.06(m,2H),1.84(m,4H),1.37(s,12H),1.03(t,J＝7.4Hz,6H).13C NMR(101MHz, CD3OD)δ172.42,163.70,151.21,148.22,142.29,141.40,141.04,128.40,127.30,124.88,122.02, 121.46,120.36,113.48,111.44,110.74,99.88,55.61,53.48,48.91,45.12,26.76,23.83,21.00, 20.40,10.25.HRMS(ESI)for C44H54N4O3 2+:calcd343.2088,found 343.2089.
实施例2荧光探针1、2、3在不同pH缓冲液中的紫外吸收强度和荧光强度变化
将制备得到的探针1、2、3(10μM)分别置于pH为4.5-10.5的不同缓冲液中(pH 4.5-pH 8.5为磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH 9.0-pH 10.5为碳酸氢盐缓冲液，均含10％DMSO)，并测试三者的紫外吸收光谱和荧光光谱，结果如图1和图2所示，探针1-3的最大吸收波长和最大发射波长均分别为770nm和798nm。探针在酸性条件下由于酰肼基上的氮原子被质子化，光致电子转移作用(PET)被抑制，因此这时候三个探针均达到最大荧光强度。随着pH 增大，由于氮原子的质子化作用消失，因此，探针本身的PET效应恢复，导致探针的荧光强度越来越弱，呈现下降趋势。
实施例3荧光探针1、2、3的pKa值对比情况
通过荧光滴定实验(探针工作浓度为10μM，测试的激发波长为715nm)测得不同pH值下的荧光强度变化，利用Origin拟合出三个探针的非线性曲线，以获得三者的pKa情况。如图 3所示，此三种探针均具有一个较为明显的pH响应突变区间，这对于精细测定pH的微小波动是十分重要的。另外，苯环上没有任何取代基的探针2，其pKa值为8.48；当苯环上添加具有一定吸电子能力的溴原子之后(如探针1)，其pKa值减小至8.01；而在苯环上添加具有一定给电子能力的甲氧基之后(如探针3)，其pKa值增大至8.89，以上说明，通过引入不同的取代基(吸电子或给电子的)可实现对探针pKa值的精细调整，从而可以筛选出适合于检测慢性伤口的荧光探针1。
实施例4荧光探针1的对pH的荧光响应的选择性
探针1(10μM，测试的激发波长为715nm)在不同pH环境下对生理条件下常见的各种阳离子、阴离子以及氨基酸等活性小分子(50μM)的荧光响应情况如图4所示，可以看出加入这些活性小分子后，荧光没有明显的波动，由此可以说明，探针1在不同pH环境下的离子选择性良好。
实施例5荧光探针1-3的细胞毒性
将不同浓度的探针1-3(5、10、20μM)加入到已孵育好的Ewing's Sarcoma细胞A673中，继续孵育24小时，应用MTT法检测细胞的增殖情况。测试结果表明(图5)，三个探针在20μM的浓度下未显示出对细胞增殖的明显影响，说明探针1-3具有较低的细胞毒性。
实施例6细胞共聚焦荧光成像实验
在孵育好的Ewing's Sarcoma细胞A673培养基内加入工作浓度为15μM的探针1，温育1小时后更换培养基，并加入含有15μg/mL尼日利亚菌素的不同pH(4.5-9.5)的富钾缓冲液 (30mM NaCl，120mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgSO4，1mM NaH2PO4，5mM glucose，20mMHEPES，20mM NaOAc)继续温育30分钟，并在激光共聚焦扫描显微镜下观察探针在细胞内的pH响应情况。结果显示(图6)，从pH7.5开始，随着pH增大，细胞内的荧光明显逐渐减弱，这与探针1在实施例2不同pH缓冲液中的荧光测定情况基本一致。上述结果表明探针1可用于外源性pH的细胞成像。
实施例7探针1在糖尿病小鼠模型的慢性伤口发展过程中pH变化的响应情况
伤口感染在慢性伤口中非常普遍，细菌在定殖过程中会产生一系列酶类，如脲酶，使得伤口在愈合过程中碱度增加，并导致伤口愈合延迟，这类情况在糖尿病溃疡伤口中也经常存在。为了模拟慢性创伤发展过程中pH值的变化，本实施例选择了BKS-DB雄性糖尿病小鼠作为研究对象，选取了4只小鼠作为平行实验。由于慢性伤口的pH变化范围约为7.15-8.9，选择了pKa值为8.01的探针1作为研究工具，将每只小鼠背部的毛发剃光，并在小鼠背部制作3个全层皮肤切除的创面(直径6毫米，每个创面之间间隔3-4毫米)。从伤口制作开始，设置了3个时间点(第1、4、7天)以观察伤口的发展情况，在每个时间点，分别对糖尿病小鼠进行麻醉，并在其中一个伤口喷涂上浓度为15μM的探针1生理盐水溶液，作用1小时后，用生理盐水洗去残留在伤口的探针，并利用小动物成像仪观察荧光强度变化。通过实验结果可以发现(图7)，随着时间延长伤口的荧光是逐渐减弱的，说明伤口的pH在增大。这个结果说明了慢性伤口的形成发展确实伴随着伤口环境的碱化过程，该结论和现有的文献报道是相符的，从而证实了探针1可以用于监测慢性创伤发展过程中pH值的变化。

Claims (6)

1.一种可用于响应活细胞内和慢性伤口发展过程中pH变化的近红外荧光探针，其特征在于结构通式为：
通式中：X为NH、CONH、NHCO、O、S、SO2、SO2NH或NHSO2；
Y为卤素；
R1为(CH2)nR5、(CH2)mOR6或(CHR7CH2O)pR6；
R2为(CH2)nR5或(CH2)mOR6；
R3、R4均为H、Cl、Br、I、NO2、CN、CONHNH2、CONHNH3 +或COOR7；
R1、R2中：n、m、p均为0-18中的整数，R5为H或COOR6，R6为H或C1-18烷基；
R3、R4中：R7为H、C1-18烷基或M，M为金属离子；
所述的pH变化的pH范围包括pH 7-10。
2.根据权利要求1所述的近红外荧光探针，其特征在于：X为O，Y为I，R1为CH2CH2CH3，R2为H或OCH3，R3为H、CONHNH2或CONHNH3 +，R4为H、Br、CONHNH2或CONHNH3 +。
3.权利要求1或2所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为如下方法中的一种：
包括如下步骤的方法一：以间羟基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过溴化、肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针；
包括如下步骤的方法二：以间羟基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针；
包括如下步骤的方法三：以4-羟基-3-甲氧基苯甲酸甲酯作为起始原料，通过肼解、上Boc保护基、与近红外染料IR-780反应，最后脱Boc保护基，得到近红外荧光探针。
4.权利要求1或2所述的近红外荧光探针在检测pH变化中的应用，其特征在于：所述的pH变化的pH范围包括pH 7-10。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的近红外荧光探针用于活细胞内外源性pH及糖尿病患者身上慢性伤口发展过程中的内源性pH变化的生物成像。
6.一种改变权利要求1或2所述的近红外荧光探针pKa值的方法，其特征在于：在所述近红外荧光探针的苯甲酰肼结构上添加具有不同吸/供电子能力的基团和改变取代基团的位置。
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