CN108329302A - 一种硫化物特异性响应的半花菁类近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种硫化物特异性响应的半花菁类近红外荧光探针化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种硫化物特异性响应的半花菁类近红外荧光探针化合物(I)，其中R1独立的选自C1‑6的直链烷基；优选的，R1选自C1‑4的直链烷基，更优选甲基、乙基或丙基；n的取值在4‑10范围内，优选数值4、5或6。本发明所述化合物初步的体外表征及细胞实验证明本发明化合物能够通过荧光强度的变化来区分半胱氨酸、谷胱甘肽及高半胱氨酸，可以用于半胱氨酸、谷胱甘肽及高半胱氨酸的区分。

Description

一种硫化物特异性响应的半花菁类近红外荧光探针化合物及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高等有机合成领域，具体涉及与响应识别有关的一类硫化物响应的具有近红外荧光的以半花菁染料为基本骨架的探针化合物，包括探针的合成、表征及特定感应性质的应用。
背景技术
基于有机小分子荧光探针分子量低、灵敏度高、稳定性与细胞渗透性好、可实时检测、不受外界磁场影响等优点，近年来被广泛用于细胞成像以及生物体内的肿瘤或特定酶类的检测。荧光探针就是一种以荧光物质作为指示剂的探针，当被一定波长的光激发会产生特征荧光，通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境发生相应改变，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。荧光分子探针通常由荧光基团、识别基团和连接体三部分组成。荧光基团和识别基团连接在一个共轭体系中，其中荧光基团一般为芳香族稠环化合物，目的是将分子识别转换成不同形式的荧光信号(荧光的有无、强弱、寿命变化、光谱移动等)；识别基团是为了实现选择性识别而合成的探针结构单元，是决定荧光分子探针与被检测分子结合的灵敏度与选择性部分。近红外荧光探针具有很高的需求,因为发射波长在近红外波段范围具有更好的组织渗透性，对生物样本更少的损伤以及更低的背景荧光干扰。
近年来，针对硫化物响应的探针分子有以下几类，一类是芳香叠氮化合物/芳基磺酰叠氮化合物，这类探针的优点是敏感性高、生物相容性好，但是响应速度慢(通常需要1h以上)及光化学稳定性不高等限制了该类探针在生物学上的进一步应用；一类是二硫化酯化合物，这类探针的优点是对硫化物的选择性高，但基于其响应速度慢(通常在0.5以上)的缺点，限制了它在体内实验的应用；一类是Cu(II)复合物类，这类探针的选择性高、响应速度很快，但对硫化物的灵敏度不够，有待进一步的设计改造；一类是醛烯酸甲酯/醛烯酮类，有着很高的敏感性、很好的生物相容性，但是对还原性物质的响应速度很慢。在原有进展的基础上，很多研究者进一步设计合成改造荧光探针，希望能设计出特异性高的，生物相容性好的适用于体内成像的探针。来自梨花女子大学的Yen Leng Pak等人设计出来了基于哌嗪的萘酰亚胺骨架的开关响应型的靶向线粒体内硫化氢的探针，这个探针对硫化氢有着很高的选择性，并且有很低的细胞毒性，可是灵敏度不是很高，这就限制了它在生物成像方面的进一步应用。Subhankar Singha等人设计的基于迈克尔受体系统的双光子荧光探针在体外实现了非常快的响应速度，有着良好的生物相容性，但是存在着选择性不高的问题，所以很难进一步应用到生物体内实验。近期Fanpeng Kong等人研究的基于1,2-二硫-4-5-二醇受体的用于检测硒化氢的荧光探针，这个探针有着很好地荧光增强效果，以及大大缩短的响应时间，但是生物毒性有待改进。通过文献报道我们可以看出一个荧光探针要同时实现高选择性、灵敏性以及快速的响应和很好的生物相容性是极其困难的。
七甲川花菁类化合物是一种亲脂性的有机染料，两端为氮杂环中间为多次亚甲基桥。因其具有稳定性强，摩尔消光系数大，荧光量子产率高等优点，作为近红外荧光探针被广泛应用于动物活体成像。研究表明IR780可以广泛的积聚在肿瘤部位而不需要任何额外的化学结合来实现肿瘤靶向。尽管具有以上几点优良的性质，但水溶性差和有限的耐光性限制了它的使用范围。
发明内容
本发明公开一种硫化物特异性响应的半花菁类近红外荧光探针化合物，本发明所述化合物初步的体外表征及细胞实验证明本发明化合物能够通过荧光强度的变化来区分半胱氨酸、谷胱甘肽及高半胱氨酸，可以用于半胱氨酸、谷胱甘肽及高半胱氨酸的区分。
本发明的化合物(I)结构式如下
其中R1独立的选自C1-6的直链烷基；优选的，R1选自C1-4的直链烷基，更优选甲基、乙基或丙基；n的取值在4-10范围内，优选数值4、5或6。
本发明所述的探针化合物，能够通过荧光强度的变化很好地将半胱氨酸与谷胱甘肽和高半胱氨酸分开，且具有更好的响应灵敏度(0.1μM)及更快的反应时间，在反应10分钟左右就有明显的荧光增强效果。
本发明还公开了化合物(I)的制备方法，优选的制备方法如下：
其中，R1独立的选自C1-6的直链烷基；优选的，R1选自C1-4的直链烷基，更优选甲基、乙基或丙基；n的取值在4-10范围内，优选数值4、5或6。
优选的，化合物1的合成步骤中，采用氮气保护，所采用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，或N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的混合溶剂；当选用混合溶剂时，N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的体积比为1：1-2.5，优选体积比为1：1；所述环己酮与三氯氧磷的摩尔比为1：1-5，优选为1：2.3；反应温度为70～100℃，优选反应温度为80℃。
优选的，化合物2或化合物2’的合成步骤中，采用氮气保护，所采用的溶剂为无水乙腈或甲苯，优选无水乙腈；2,3,3-三甲基-3H-吲哚和R1COOCnH2n+1的物质的量之比为1：1-10；优选物质的量之比为1：6；反应温度为110～130℃，优选反应温度为120℃。
优选的，化合物3的合成步骤中，所采用的溶剂优选正丁醇和甲苯的混合溶剂，正丁醇和甲苯的体积比为7-1：1，优选体积比为7：4；化合物1和化合物2的摩尔比为1：1-5，优选的摩尔比为1：2.5；化合物1和化合物2’的摩尔比为1：1-5，优选的摩尔比为1：2.5；反应温度为110～130℃，优选反应温度为120℃。
优选的，化合物4的合成步骤中，所采用的溶剂为无水乙腈或无水乙腈与无水二氯甲烷的混合溶液，优选无水乙腈；当采用无水乙腈和无水二氯甲烷的混合溶液时，无水乙腈和无水二氯甲烷的体积比为4-1：1，优选为3：1；所采用的碱为碳酸钾或三乙胺，优选碳酸钾；化合物3和1,3-苯二酚的物质的量之比为1：1-4，优选物质的量之比为1：2.5；反应温度为30～80℃，优选反应温度为50℃。
优选的，化合物5的合成步骤中，所采用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺与无水二氯甲烷的混合溶液，优选N,N-二甲基甲酰胺；当采用N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的混合溶液时，N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的体积比为10-5:1，优选为8:1；化合物4和2,4-二硝基氟苯的物质的量之比优选1:1-2，优选物质的量之比为1：1.1；反应温度为30～60℃，优选反应温度为30℃。
本发明还提供一种包含式(I)化合物的组合物或诊断试剂盒。
本发明还提供所述式(I)化合物或所述组合物或诊断试剂盒在硫化物检测中的应用。
下面实验中涉及的化合物代号等同于此处代号所对应的化合物。
本发明中的“直链烷基”表示1-20个碳原子的直链饱和的脂烃基(本申请书中提到的数字范围，例如“1-6”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括6个碳原子)，例如甲基、乙基、丙基、正丁基、戊基等。
本发明基于半花菁染料的基本骨架，发明了具有较好理化性质的小分子荧光探针。该探针相较于现有化合物，具有更高的选择性，能够将半胱氨酸与谷胱甘肽及高半胱氨酸区分开、更好的响应灵敏度(0.1μM)、反应迅速，在反应10分钟左右就有很明显的荧光增强效果。在小白鼠皮下移植肉瘤模型瘤内注射实验中表现出很好的成像能力，可用于对生物体内硫化物进行特异性检测。
附图说明
图1化合物3-5的吸收光谱、荧光光谱；
图2化合物5选择性实验的吸收光谱和荧光光谱；
图3-5化合物5动力学实验的吸收光谱和荧光光谱；
图6化合物5滴定实验的吸收光谱和荧光光谱；
图7化合物5细胞毒性试验；
图8化合物5细胞共聚焦成像实验；
图9肉瘤动物模型活体成像；
图10化合物5质谱表征；
图11化合物5核磁图谱。
具体实施方式
以下实施例用于详细描述本发明的内容，而不是对本发明保护范围的限制。如无特别说明，所用的原料和试剂均为普通市售产品，所采取的方法和操作方式均为本领域常规方式。
实施例1
丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
1.化合物1(E)-2-氯-3-(羟基亚甲基)环己-1-烯-1-甲醛
将40mL N,N-二甲基甲酰胺加入三颈反应瓶中，抽充氮气，冰浴条件下滴加三氯氧磷(17.5g，115mmol)，搅拌30分钟后，加入环己酮(5g，50mmol)，于90℃反应6h。反应完成冷却至室温，溶液倒入冰水混合物中，抽滤得黄色固体(3.2g，14.27％)，无需纯化直接下一步。
2.化合物2 3-(2,3,3-三甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2g，12.5mmol)加入反应瓶中，加入20mL甲苯，抽充氮气并室温搅拌5分钟，加入3-溴丙酸(1.91g，12.5mmol)，120℃搅拌回流15h，避光操作。反应完成减压蒸馏除去甲苯，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得紫色略偏白固体(0.34g，8.25％)，无需纯化直接下一步。
3.化合物3丁基3-((E)-2–((E)-2-(3–((E)-2-(1-(3-丁氧基-3-氧代丙基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-2-氯化环丁烷-2-烯-1-亚基)亚乙基)-3,3-二甲基二氢-1-基)丙酸
将化合物1(0.36g，2mmol)和化合物2(1.17g，5mmol)加入反应瓶中，抽充氮气，氮气保护条件下加入20mL正丁醇和20mL甲苯，110℃搅拌回流8h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得绿色略带金色固体(0.62g，41.18％)，无需纯化直接下一步。
4.化合物4丁基(E)-3-(2-(2-(6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将1,3-苯二酚(138mg，1.25mmol)和碳酸钾(174mg，1.26mmol)加入反应瓶中，加入20mL的无水乙腈和20ml无水二氯甲烷，抽充氮气，室温搅拌10min后，加入化合物3(300mg，0.5mmol)，70℃搅拌反应4h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(70mg，11.44％)。
5.化合物5丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将化合物4(100mg，0.22mmol)和2,4-二硝基氟苯(46mg，0.25mmol)加入反应瓶中，加入10ml的N,N-二甲基甲酰胺和1ml的无水二氯甲烷，抽充氮气，60℃反应6h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(10mg，6.85％)，其质谱和核磁如图10和图11所示。MS(ESI,m/z):[M+H]+,664.2653。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.63(d,J＝14.5Hz,1H),8.45(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.53–7.40(m,4H),7.28(s,1H),7.11(d,J＝17.0Hz,3H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.95(t,J＝6.7Hz,2H),3.12(s,2H),2.93(s,2H),2.75(s,2H),1.97(s,3H),1.77(s,6H),1.47(dt,J＝14.5,6.8Hz,2H),1.27–1.23(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例2
丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
1.化合物1(E)-2-氯-3-(羟基亚甲基)环己-1-烯-1-甲醛
将20mL N,N-二甲基甲酰胺和50mL二氯甲烷加入三颈反应瓶中，抽充氮气，冰浴条件下滴加三氯氧磷(17.5g，115mmol)，搅拌30分钟后，加入环己酮(5g，50mmol)，于80℃反应6h。反应完成冷却至室温，溶液倒入冰水混合物中，抽滤得黄色固体(4.2g，18.72％)，无需纯化直接下一步。
2.化合物2 3-(2,3,3-三甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2g，12.5mmol)加入反应瓶中，加入50mL乙腈，抽充氮气并室温搅拌5分钟，加入3-溴丙酸(15.3g，100mmol)，120℃搅拌回流15h，避光操作。反应完成减压蒸馏除去甲苯，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得紫色略偏白固体(2.114g，12.22％)，无需纯化直接下一步。
3.化合物3丁基3-((E)-2–((E)-2-(3–((E)-2-(1-(3-丁氧基-3-氧代丙基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-2-氯化环丁烷-2-烯-1-亚基)亚乙基)-3,3-二甲基二氢-1-基)丙酸
将化合物1(0.36g，2mmol)和化合物2(1.17g，5mmol)加入反应瓶中，抽充氮气，氮气保护条件下加入20mL正丁醇和20mL甲苯，120℃搅拌回流8h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得绿色略带金色固体(0.71g，46.41％)，无需纯化直接下一步。
4.化合物4丁基(E)-3-(2-(2-(6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将1,3-苯二酚(138mg，1.25mmol)和碳酸钾(174mg，1.26mmol)加入反应瓶中，加入20mL的无水乙腈和7ml无水二氯甲烷，抽充氮气，室温搅拌10min后，加入化合物3(300mg，0.5mmol)，70℃搅拌反应4h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(76mg，12.42％)
5.化合物5丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将化合物4(100mg，0.22mmol)和2,4-二硝基氟苯(46mg，0.25mmol)加入反应瓶中，加入9ml的N,N-二甲基甲酰胺和1ml的无水二氯甲烷，抽充氮气，50℃反应6h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(13mg，8.9％)。MS(ESI,m/z):[M+H]+,664.2653。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.63(d,J＝14.5Hz,1H),8.45(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.53–7.40(m,4H),7.28(s,1H),7.11(d,J＝17.0Hz,3H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.95(t,J＝6.7Hz,2H),3.12(s,2H),2.93(s,2H),2.75(s,2H),1.97(s,3H),1.77(s,6H),1.47(dt,J＝14.5,6.8Hz,2H),1.27–1.23(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例3
丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
1.化合物1(E)-2-氯-3-(羟基亚甲基)环己-1-烯-1-甲醛
将20mL N,N-二甲基甲酰胺和20mL二氯甲烷加入三颈反应瓶中，抽充氮气，冰浴条件下滴加三氯氧磷(17.5g，115mmol)，搅拌30分钟后，加入环己酮(5g，50mmol)，于80℃反应6h。反应完成冷却至室温，溶液倒入冰水混合物中，抽滤得黄色固体(6.3g，28.1％)，无需纯化直接下一步。
2.化合物2 3-(2,3,3-三甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2g，12.5mmol)加入反应瓶中，加入50mL乙腈，抽充氮气并室温搅拌5分钟，加入3-溴丙酸(11.47g，75mmol))，100℃搅拌回流15h，避光操作。反应完成减压蒸馏除去甲苯，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得紫色略偏白固体(1.88g，13.96％)，无需纯化直接下一步。
3.化合物3丁基3-((E)-2–((E)-2-(3–((E)-2-(1-(3-丁氧基-3-氧代丙基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-2-氯化环丁烷-2-烯-1-亚基)亚乙基)-3,3-二甲基二氢-1-基)丙酸
将化合物1(0.36g，2mmol)和化合物2(1.17g，5mmol)加入反应瓶中，抽充氮气，氮气保护条件下加入20mL正丁醇和15mL甲苯，130℃搅拌回流8h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得绿色略带金色固体(0.86g，56.21％)，无需纯化直接下一步。
4.化合物4丁基(E)-3-(2-(2-(6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将1,3-苯二酚(138mg，1.25mmol)和碳酸钾(174mg，1.26mmol)加入反应瓶中，加入20mL的无水乙腈，抽充氮气，室温搅拌10min后，加入化合物3(300mg，0.5mmol)，70℃搅拌反应4h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(89mg，14.54％)。
5.化合物5丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将化合物4(100mg，0.22mmol)和2,4-二硝基氟苯(46mg，0.25mmol)加入反应瓶中，加入9ml的N,N-二甲基甲酰胺和1ml的无水二氯甲烷，抽充氮气，40℃反应6h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(16mg，10.96％)。MS(ESI,m/z):[M+H]+,664.2653。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.63(d,J＝14.5Hz,1H),8.45(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.53–7.40(m,4H),7.28(s,1H),7.11(d,J＝17.0Hz,3H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.95(t,J＝6.7Hz,2H),3.12(s,2H),2.93(s,2H),2.75(s,2H),1.97(s,3H),1.77(s,6H),1.47(dt,J＝14.5,6.8Hz,2H),1.27–1.23(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例4
丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
1.化合物1的合成方法与实施例3中完全一致
2.化合物2 3-(2,3,3-三甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2g，12.5mmol)加入反应瓶中，加入50mL乙腈，抽充氮气并室温搅拌5分钟，加入3-溴丙酸(11.47g，75mmol)，120℃搅拌回流15h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得紫色略偏白固体(1.95g，14.48％)，无需纯化直接下一步。
3.化合物3丁基3-((E)-2–((E)-2-(3–((E)-2-(1-(3-丁氧基-3-氧代丙基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-2-氯化环丁烷-2-烯-1-亚基)亚乙基)-3,3-二甲基二氢-1-基)丙酸
将化合物1(0.36g，2mmol)和化合物2(1.17g，5mmol)加入反应瓶中，抽充氮气，氮气保护条件下加入20mL正丁醇和11mL甲苯，120℃搅拌回流8h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得绿色略带金色固体(0.96g，62.75％)，无需纯化直接下一步。
4.化合物4丁基(E)-3-(2-(2-(6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将1,3-苯二酚(138mg，1.25mmol)和碳酸钾(174mg，1.26mmol)加入反应瓶中，加入20mL的无水乙腈，抽充氮气，室温搅拌10min后，加入化合物3(300mg，0.5mmol)，60℃搅拌反应4h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(93mg，15.2％)。
5.化合物5丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将化合物4(100mg，0.22mmol)和2,4-二硝基氟苯(46mg，0.25mmol)加入反应瓶中，加入8ml的N,N-二甲基甲酰胺和1ml的无水二氯甲烷，抽充氮气，30℃反应6h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(17mg，11.64％)。MS(ESI,m/z):[M+H]+,664.2653。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.63(d,J＝14.5Hz,1H),8.45(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.53–7.40(m,4H),7.28(s,1H),7.11(d,J＝17.0Hz,3H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.95(t,J＝6.7Hz,2H),3.12(s,2H),2.93(s,2H),2.75(s,2H),1.97(s,3H),1.77(s,6H),1.47(dt,J＝14.5,6.8Hz,2H),1.27–1.23(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例5
丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
1.化合物1、2、3的合成方法与实施例4中完全一致
2.化合物4丁基(E)-3-(2-(2-(6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将1,3-苯二酚(138mg，1.25mmol)和碳酸钾(174mg，1.26mmol)加入反应瓶中，加入20mL的无水乙腈，抽充氮气，室温搅拌10min后，加入化合物3(300mg，0.5mmol)，50℃搅拌反应4h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(100mg，16.34％)。
3.化合物5丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将化合物4(100mg，0.22mmol)和2,4-二硝基氟苯(46mg，0.25mmol)加入反应瓶中，加入10ml的N,N-二甲基甲酰胺，抽充氮气，50℃反应6h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(19mg，13.01％)。MS(ESI,m/z):[M+H]+,664.2653。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.63(d,J＝14.5Hz,1H),8.45(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.53–7.40(m,4H),7.28(s,1H),7.11(d,J＝17.0Hz,3H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.95(t,J＝6.7Hz,2H),3.12(s,2H),2.93(s,2H),2.75(s,2H),1.97(s,3H),1.77(s,6H),1.47(dt,J＝14.5,6.8Hz,2H),1.27–1.23(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例6
丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
1.化合物1(E)-2-氯-3-(羟基亚甲基)环己-1-烯-1-甲醛
将20mL N,N-二甲基甲酰胺和20mL二氯甲烷加入三颈反应瓶中，抽充氮气，冰浴条件下滴加三氯氧磷(17.5g，115mmol)，搅拌30分钟后，加入环己酮(5g，50mmol)，于80℃反应6h。反应完成冷却至室温，溶液倒入冰水混合物中，抽滤得黄色固体(6.3g，28.1％)。
2.化合物2 3-(2,3,3-三甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2g，12.5mmol)加入反应瓶中，加入50mL乙腈，抽充氮气并室温搅拌5分钟，加入3-溴丙酸(11.47g，75mmol)，120℃搅拌回流15h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得紫色略偏白固体(1.95g，14.48％)，无需纯化直接下一步。
3.化合物3丁基3-((E)-2–((E)-2-(3–((E)-2-(1-(3-丁氧基-3-氧代丙基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-2-氯化环丁烷-2-烯-1-亚基)亚乙基)-3,3-二甲基二氢-1-基)丙酸
将化合物1(0.36g，2mmol)和化合物2(1.17g，5mmol)加入反应瓶中，抽充氮气，氮气保护条件下加入20mL正丁醇和11mL甲苯，120℃搅拌回流8h，避光操作。反应完成旋除溶剂，加入大量无水乙醚沉降，抽滤得绿色略带金色固体(0.96g，62.75％)，无需纯化直接下一步。
4.化合物4丁基(E)-3-(2-(2-(6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将1,3-苯二酚(138mg，1.25mmol)和碳酸钾(174mg，1.26mmol)加入反应瓶中，加入20mL的无水乙腈，抽充氮气，室温搅拌10min后，加入化合物3(300mg，0.5mmol)，50℃搅拌反应4h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱层析(100-200目)得蓝紫色固体(100mg，16.34％)。
5.化合物5丁基(E)-3-(2-(2-(6-(2,4-二硝基苯氧基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-1-基)丙酸
将化合物4(100mg，0.22mmol)和2,4-二硝基氟苯(46mg，0.25mmol)加入反应瓶中，加入8ml的N,N-二甲基甲酰胺和1ml的无水二氯甲烷，抽充氮气，30℃反应6h，避光操作。反应完成后旋除溶剂，硅胶柱0100层析(100-200目)得蓝紫色固体(21mg，14.38％)。MS(ESI,m/z):[M+H]+,664.2653。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.63(d,J＝14.5Hz,1H),8.45(d,J＝6.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.53–7.40(m,4H),7.28(s,1H),7.11(d,J＝17.0Hz,3H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.95(t,J＝6.7Hz,2H),3.12(s,2H),2.93(s,2H),2.75(s,2H),1.97(s,3H),1.77(s,6H),1.47(dt,J＝14.5,6.8Hz,2H),1.27–1.23(m,2H),0.84(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例7本发明的化合物的光学性质、细胞、动物模型实验及结果：
1.化合物光谱测定实验
化合物吸收光谱和荧光光谱分别由Shimadzu UV-2550紫外光谱仪，EdinburghLFS-920荧光光谱仪测定。测定荧光光谱时样品和标准物使用同一扫面速度，同一激发狭缝和发射狭缝，所得数据用同一方法进行处理。测试浓度为1×10-5M。图1为化合物3-5的吸收光谱和荧光光谱。测试条件为(10mM PBS,pH＝7.4,37℃,10％DMSO)。可以看出化合物5最大吸收峰出现在600nm处(图1左图)，荧光发射峰出现在710nm处(图1右图)，它的荧光强度比化合物4弱很多，初步表明化合物5结构上已经连有2,4-二硝基-氟苯。
2.化合物5的选择性实验
化合物5吸收光谱和荧光光谱分别由Shimadzu UV-2550紫外光谱仪，EdinburghLFS-920荧光光谱仪测定。测定荧光光谱时样品和标准物使用同一扫面速度，同一激发狭缝和发射狭缝，所得数据用同一方法进行处理。化合物5的测试浓度为1×10-5M，其他响应物质的测试浓度为1×10-4M。测试条件为(10mM PBS,pH＝7.4,37℃,10％DMSO)。图2为化合物5和响应物质充分反应后的吸收光谱(图2(1))和荧光光谱(图2(2))，以及取荧光强度最大值做的柱状图(图2(3))，其中1-20分别代表1.化合物5，2.苯丙氨酸，3.丙氨酸，4.脯氨酸，5.甘氨酸，6.H2O2，7.赖氨酸，8.SO4 -，9.NA2S，10.ClO-，11.牛磺酸，12.色氨酸，13.天冬酰胺，14.天门冬氨酸，15.CH3COO-，16.缬氨酸，17.组氨酸，18.Hcy，19.GSH，20.Cys)。可以看出化合物5对Cys、Hcy和GSH的选择性高于其他几种物质，而对Cys的选择性又高于Hcy及GSH。所以从荧光强度的变化能够区分Cys与Hcy和GSH。
3.化合物5的动力学实验
化合物5吸收光谱和荧光光谱分别由Shimadzu UV-2550紫外光谱仪，EdinburghLFS-920荧光光谱仪测定。测定荧光光谱时样品和标准物使用同一扫面速度，同一激发狭缝和发射狭缝，所得数据用同一方法进行处理。化合物5的测试浓度为1×10-5M，Cys、Hcy和GSH的测试浓度为1×10-4M。测试条件为(10mM PBS,pH＝7.4,37℃,10％DMSO)。将化合物5的溶液与Cys、Hcy和GSH溶液分别混合后，每隔10min检测一下，当荧光强度变化趋于稳定后停止检测。从图3(2)中可以看出化合物5与Cys在反应10min左右就有明显的荧光增强效果，充分反应后荧光强度有很大的增强，在反应150min左右荧光变化趋于稳定。从图4(2)中可以看出化合物5与GSH在反应10min左右有荧光增强效果，充分反应后荧光强度有较大的增强，在反应150min左右荧光变化趋于稳定。图5(2)中可以看出化合物5与Hcy在反应10min左右荧光有增强，充分反应后荧光强度有更大的改变，在反应150min左右荧光变化趋于稳定。对比图3(2)、图4(2)和图5(2)，可以看出化合物5与Cys充分反应后的荧光强度比与GSH、Hcy反应后的荧光强度增强更多，表明化合物5对Cys有更强的响应性。
4.化合物5对Cys的滴定实验
化合物吸收光谱和荧光光谱分别由Shimadzu UV-2550紫外光谱仪，EdinburghLFS-920荧光光谱仪测定。测定荧光光谱时样品和标准物使用同一扫面速度，同一激发狭缝和发射狭缝，所得数据用同一方法进行处理。化合物5的测试浓度为1×10-5M，Cys的测试浓度为0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、40.0μM、60.0μM、80.0μM、100.0μM、120.0μM、140.0μM、160.0μM。测试条件为(10mM PBS,pH＝7.4,37℃,10％DMSO)。从图6(2)中可以看出，在Cys浓度为0.1μM时，化合物5的荧光强度有变化了，说明化合物5可以对0.1μM的Cys有响应，说明化合物5的灵敏度很高。
5.细胞毒性实验
将A549、MCF-7和L02细胞培养在添加10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL)的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(1)将处于对数生长期的A549、MCF-7和L02细胞用0.25％胰酶消化液处理，制成浓度为4×105的细胞悬液，向96孔细胞培养板中加入100μL细胞悬液培养过夜。
(2)待细胞贴壁后加入浓度梯度化合物5，其中化合物5用培养基配置成2倍于所需浓度的溶液，分别向对应的孔中加入100μL，纯培养基组为阴性对照。将加好化合物的96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2恒温、饱和湿度的条件下孵育16h。
(3)96孔细胞培养板取出，倒置显微镜观察细胞状态后每孔加入20μL浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续孵育4h。
(4)取出96孔细胞培养板，将培养基从孔中吸出，每孔加入150μL的DMSO溶液，置摇床上低速振荡20min。
(5)将96孔细胞培养板放入酶标仪中检测。
图7为化合物5的细胞毒性试验结果(其中图7(1)为A549细胞毒性试验，图7(2)为MCF-7细胞毒性试验，图7(3)为L02细胞毒性实验)，在浓度不超过20μM/L时表现很好的生物相容性，为其进一步的生物应用奠定了基础。
6.化合物5对硫化物响应的细胞实验
将处于对数生长期的L02、A549和MCF-7细胞用0.25％胰酶消化液处理，调整细胞悬液浓度至5×105个细胞左右。每种细胞铺五组共聚焦皿，加入850μL培养基及50μL细胞悬液培养过夜。倒置显微镜观察，当整个细胞占据培养皿的70％～80％空间时对不同组别进行不同处理。第一组(Probe)共聚焦皿里加入化合物5溶液及Hoechst 33342染液各100μL，放入培养箱培养30min，之后用PBS洗涤细胞三次，最后通过LCFM(FV 1000，Olympus，Japan)检测细胞中化合物5荧光信号。第二组(NEM+Probe)共聚焦皿里加入NEM(N-乙基马来酰亚胺)孵育30min，用PBS洗涤三次，加入化合物5溶液及Hoechst 33342染液各100μL，放入培养箱培养30min，用PBS洗涤细胞三次，最后通过LCFM(FV 1000，Olympus，Japan)检测细胞中化合物5荧光信号。第三(NEM+Cys+Probe)、四(NEM+Hcy+Probe)、五(NEM+GSH+Probe)组共聚焦皿里加入NEM(N-乙基马来酰亚胺)孵育30min，用PBS洗涤三次，再分别加入相同浓度的Cys、Hcy和GSH孵育30min，用PBS洗涤三次，加入化合物5溶液及Hoechst 33342染液各100μL，培养30min，用PBS洗涤细胞三次，最后通过LCFM(FV 1000，Olympus，Japan)检测细胞中化合物5荧光信号。图8为化合物5的细胞共聚焦成像结果，从8(1)、8(2)、8(3)(其中8(1)为L02细胞组、8(2)为A549细胞组、8(3)为MCF-7细胞组)中可以看出化合物5与细胞共孵育后，在细胞质中出现很强的荧光信号，表明化合物5对细胞内的Cys、Hcy和GSH有响应性。三种细胞的第三(NEM+Cys+Probe)组细胞的荧光强度高于第四(NEM+Hcy+Probe)、五(NEM+GSH+Probe)两组，表明化合物5对Cys的响应性更高，说明化合物5在细胞内可以很好地区分Cys与Hcy及GSH。
7.小动物活体成像实验
通过在小鼠腋窝皮下注射EAC肿瘤细胞(～5×106个)，建立荷瘤小鼠模型。当EAC肿瘤生长到4～5mm的直径时，对小鼠进行瘤内注射30μM/L的100μL化合物5溶液，对照组是注射100μL的PBS后注射30μM/L的100μL化合物5溶液。使用660nm近红外光作为激发光，在不同时间点用近红外小动物成像系统采集小鼠体内荧光信号。图9为不同时间点成像结果，从图中可以看出与对照组(图9(2))相比实验组(图9(1))在肿瘤部位有着逐渐增强的荧光。小动物活体成像实验表明化合物5对肿瘤部位的硫化物有响应(图9(1))。

Claims (10)

1.式(I)所述化合物：
其中R1选自C1-6的直链烷基；n为4-10。
2.根据权利要求1所述化合物，其特征在于R1选自C1-4的直链烷基，优选甲基、乙基或丙基；n为4、5或6。
3.权利要求1或2所述式(I)化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
其中，R1独立的选自C1-6的直链烷基；优选的，R1选自C1-4的直链烷基，更优选甲基、乙基或丙基；n的取值在4-10范围内，优选数值4、5或6。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于化合物1的合成步骤中，采用氮气保护，所采用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，或N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的混合溶剂；当选用混合溶剂时，N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的体积比为1：1-2.5，优选体积比为1：1；所述环己酮与三氯氧磷的摩尔比为1：1-5，优选为1：2.3；反应温度为70～100℃，优选反应温度为80℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于化合物2或化合物2’的合成步骤中，采用氮气保护，所采用的溶剂为无水乙腈或甲苯，优选无水乙腈；2,3,3-三甲基-3H-吲哚和R1COOCnH2n+1的物质的量之比为1：1-10；优选物质的量之比为1：6；反应温度为110～130℃，优选反应温度为120℃。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于化合物3的合成步骤中，所采用的溶剂优选正丁醇和甲苯的混合溶剂，正丁醇和甲苯的体积比为7-1：1，优选体积比为7：4；化合物1和化合物2的摩尔比为1：1-5，优选的摩尔比为1：2.5；化合物1和化合物2’的摩尔比为1：1-5，优选的摩尔比为1：2.5；反应温度为110～130℃，优选反应温度为120℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于化合物4的合成步骤中，所采用的溶剂为无水乙腈或无水乙腈与无水二氯甲烷的混合溶液，优选无水乙腈；当采用无水乙腈和无水二氯甲烷的混合溶液时，无水乙腈和无水二氯甲烷的体积比为4-1：1，优选为3：1；所采用的碱为碳酸钾或三乙胺，优选碳酸钾；化合物3和1,3-苯二酚的物质的量之比为1：1-4，优选物质的量之比为1：2.5；反应温度为30～80℃，优选反应温度为50℃。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于化合物5的合成步骤中，所采用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺与无水二氯甲烷的混合溶液，优选N,N-二甲基甲酰胺；当采用N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的混合溶液时，N,N-二甲基甲酰胺和无水二氯甲烷的体积比为10-5:1，优选为8:1；化合物4和2,4-二硝基氟苯的物质的量之比优选1:1-2，优选物质的量之比为1：1.1；反应温度为30～60℃，优选反应温度为30℃。
9.一种包含权利要求1中式(I)所示化合物的组合物或诊断试剂盒。
10.权利要求1中式(I)所示化合物或权利要求9中所述组合物或诊断试剂盒在硫化物检测中的应用。
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