CN105647518A - 一种检测过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用，检测过氧化氢的荧光探针，其结构式如下：其中，R1-R5中任意1个或2个为吸电子基团。本发明的荧光探针响应基团新颖、选择性好、灵敏度高；该探针激发发射波长在近红外，对组织损伤小且穿透力强，能用于活体成像。制备方法是，将3-氨基苯酚与Cy.7.Cl进行取代反应后得到Cy-Ph-NH2，然后经过retro-Knoevenagel反应得到P-NH2，最后与苯乙醛酸的衍生物经取代反应得到产物P-R，即为检测过氧化氢的荧光探针。本发明合成方法简单，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种新响应基团、选择性好的近红外染料荧光探针，其合成方法及其在检测细胞内过氧化氢的应用，属于检测技术领域。
背景技术
细胞内绝大部分过氧化氢是由线粒体呼吸链产生，首先氧气(O2)被还原生成O2 ·，随后O2 ·经超氧化物歧化酶(SODs)的歧化作用转变成过氧化氢。
在生物体中，过氧化氢是一种主要的活性氧，在细胞信号传导过程中扮演重要的角色。过氧化氢不仅能产生其他活性氧，而且是其他活性氧发生氧化反应时的产物。细胞受到刺激会产生活性氧爆发，这会影响到几类能调控细胞增殖和凋亡的信号蛋白，例如激活细胞有丝分裂的蛋白激酶家族(MAP)、转绿因子1(AP-1)、蛋白质络氨酸磷酸酶(pTps)、离子通道和G蛋白。过氧化氢在细胞中的生物化学作用非常复杂，现在普遍认为过氧化氢是细胞信号传导的第二信使分子，细胞内ROS尤其是过氧化氢含量的相对稳定是维持细胞活性所必需的，因此过氧化氢在信号通路中起着非常重要的作用。
许多与人类衰老相关的疾病，比如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病均与氧化应激有关，氧化应激是活性氧不受调控过量产生的结果，而细胞内氧化还原化学反应的紊乱会进一步损害组织和器官。在机体中，过氧化氢是一种主要的氧代谢产物，也是氧化应激的标志物。因此，准确检测细胞内过氧化氢的含量是非常重要的。
目前，过氧化氢的检测技术有荧光法、电化学法、生物发光法、化学发光法等。荧光法由于其操作简单、灵敏度高等优点受到了越来越多的关注。
近年来，用于检测过氧化氢的大多数探针是以硼酸(NaamaKarton-Lifshin,EhudSegal,LioraOmer,MoshePortnoy,RonitSatchi-Fainaro,andDoronShaba,J.Am.Chem.Soc.,2011,133,10960–10965；LinYuan,WeiyingLin,ShengZhao,WenshaGao,BinChen,LongweiHe,andSasaZhu,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,13510-13523)或硼酸酯(DuangkhaeSrikun,EvanW.Miller,DylanW.Domaille,andChristopherJ.Chang,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,4596-4597；Dickinson,B.C.；Huynh,C.；Chang,C.J.,J.Am.Chem.Soc.,2010,132,5906)作为过氧化氢的响应基团，但是已有文章(ThomasF.Brewer,FranciscoJ.Garcia,CarlS.Onak,KateS.Carroll,andChristopherJ.Chang,Annu.Rev.Biochem.,2015,84:765-790.)报道，ONOO-会对这类响应基团造成干扰，另外近几年发表的几篇文章(SikoraA,ZielonkaJ,LopezM,JosephJ,KalyanaramanB,FreeRadic.Biol.Med.,2009,47:1401–7；ZielonkaJ,SikoraA,HardyM,JosephJ,DrankaBP,KalyanaramanB.,Chem.Res.Toxicol.,2012,25:1793–99；JiZhou,YangLi,JiaoningShen,QiangLi,RuiWang,YufangXuandXuhongQian,RSCAdv.,2014,4,51589–51592)中详细的介绍了以硼酸或硼酸酯作为响应基团的探针也能与ONOO-、ClO-发生反应并引起探针荧光的变化，而且与ONOO-的反应速度要远远快于与过氧化氢反应的速度。因此，以硼酸或硼酸酯作为响应基团的探针对过氧化氢的选择性尚待提高。
另外，TetsuoNagano利用一种新的响应基团设计合成了一种过氧化氢荧光探针(MasahiroAbo,YasuteruUrano,KenjiroHanaoka,TakuyaTerai,ToruKomatsu,andTetsuoNagano,J.Am.Chem.Soc.,2011,133,10629–10637)，虽然该探针具有灵敏度高的优点，但是ONOO-、TBHP会对探针造成不同程度的干扰，并且该探针的激发发射波长不在近红外，不能用于活体成像。
总的来说，以上探针都存在选择性不好的问题，而且大多数探针的激发发射波长不在近红外，这会限制探针在生物体中的应用。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用，设计了合成了一种新的过氧化氢近红外荧光探针，成功的提高了探针对过氧化氢的选择性，并应用到生物体成像中。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种检测过氧化氢的荧光探针，其结构式如下：
其中，R1-R5中任意1个或2个为吸电子基团。
本发明的荧光探针响应基团新颖、选择性好、灵敏度高；该探针激发发射波长在近红外，对组织损伤小且穿透力强，能用于活体成像。
优选的，所述吸电子基团为-NO2、-CN、-SO3H或-CF3。该荧光探针效果更好。
一种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，将3-氨基苯酚与Cy.7.Cl进行取代反应后得到Cy-Ph-NH2，然后经过retro-Knoevenagel反应得到P-NH2，最后与苯乙醛酸的衍生物经取代反应得到产物P-R，即为检测过氧化氢的荧光探针。
本发明合成方法简单，适于工业化生产。
其反应过程如下：
其中，R1-R5中任意1个或2个为吸电子基团。
优选的，所述吸电子基团为-NO2、-CN、-SO3H或-CF3。
优选的，其反应步骤为：
(1)将二碳酸二叔丁酯(Boc)2O与3-氨基苯酚溶解在溶剂中加热反应后得到Ph-Boc；
(2)将Cy.7.Cl、氢化钠和步骤(1)得到的Ph-Boc溶解在溶剂中反应后得到Cy-Ph-Boc；
(3)将Cy-Ph-Boc溶解在溶剂中，冰浴后，加入三氟乙酸后，加热反应后得到Cy-Ph-NH2；
(4)将Cy-Ph-NH2、氢化钠溶解在溶剂中加热回流后得到P-NH2；
(5)将苯乙醛酸的衍生物溶解在溶剂中，滴入DMF，加入草酰氯加热反应后得到苯乙醛酰氯的衍生物；
(6)将P-NH2、三乙胺溶解在溶剂中，滴加苯乙醛酰氯的衍生物，反应后得到产物P-R，即为检测过氧化氢的荧光探针。
利用Boc对氨基进行保护，更有利于反应的进行，提高了产品产率，简化纯化步骤。
其反应过程如下：
进一步优选的，所述步骤(1)的反应温度为75-85℃，反应时间为4-6h；
所述步骤(2)的反应温度为20-30℃，反应时间为2-3h；
所述步骤(3)的冰浴时间为1-2h，反应温度为20-30℃，反应时间为5-8h；
所述步骤(4)的反应温度为85-95℃，反应时间为4-6h；
所述步骤(5)的反应温度为40-50℃，反应时间为1-2h；
所述步骤(6)的反应温度为20-30℃，反应时间为1-2h。该条件下得到的产品产率和纯度更高。
进一步优选的，所述步骤(1)的溶剂为无水乙醇，所述步骤(2)和(4)的溶剂为DMF，所述步骤(3)的溶剂为二氯甲烷，步骤(5)和(6)的溶剂为超干二氯甲烷。
更进一步优选的，所述步骤(1)中3-氨基苯酚、(Boc)2O、无水乙醇的用量比例为1:2-3:30-40，(g:g:mL)；
所述步骤(2)中Cy.7.Cl、氢化钠、Ph-Boc、DMF的用量比例为1:0.1-0.2:0.7-1:15-20，(g:g:g：mL)；
所述步骤(3)中Cy-Ph-Boc、二氯甲烷、三氟乙酸的用量比例为0.2-0.4:6-10:1，(g:mL:mL)；
所述步骤(4)中Cy-Ph-NH2、氢化钠、DMF的用量比例为1:0.03-0.05:12-20，(g:g:mL)；
所述步骤(5)中4-硝基苯乙醛酸、超干二氯甲烷、草酰氯、DMF的用量比例为1:80-100:1-1.5:0.5-0.8，(g:mL:mL:mL)；
所述步骤(6)中P-NH2、三乙胺、4-硝基苯乙醛酰氯、超干二氯甲烷的用量比例为1-1.5：0.1-0.5:1:130-150，(g:mL:g:mL)。提高原料的转化率，降低成本。
进一步优选的，所述步骤(2)和(4)的产物纯化方法为直接色谱分离；所述步骤(3)和(6)的产物纯化方法为先用饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷萃取，然后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，最后进行色谱分离。
更进一步优选的，所述步骤(2)的色谱分离洗脱剂是石油醚、二氯甲烷和无水乙醇体积比为20-30:20-30:1的混合液；
所述步骤(3)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为10-20:1的混合液；
所述步骤(4)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为40-60:3的混合液；
所述步骤(6)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为90-110:3的混合液。进一步提高产品的纯度。
一种上述检测过氧化氢的荧光探针在检测过氧化氢中的应用。
一种检测过氧化氢的方法，其步骤为：
(1)将上述检测过氧化氢的荧光探针溶解在生理盐水、缓冲液或培养液中，配制成储备液储存待用；
(2)加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
一种检测活细胞内过氧化氢的方法，其步骤为：
(1)将含有上述检测过氧化氢的荧光探针的缓冲溶液5-10μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育10-30分钟；
(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加了检测物后，再次孵育10分钟，进行成像。
本发明的优点是：
1.响应基团新颖，选择性好。
2.合成简单，该响应基团的普适性好。
3.最大激发发射位于近红外区域，穿透力强，损伤小，干扰小，能用于活体组织中的检测。
4.灵敏度高，可以检测到细胞、活体内内源性的过氧化氢。
附图说明
图1是本发明的探针P-NO2的荧光强度和过氧化氢浓度变化的关系；横坐标为波长(nm)，纵坐标为740nm处的荧光强度；
图2是本发明的探针P-NO2的荧光强度和过氧化氢浓度的工作曲线；横坐标为过氧化氢浓度，纵坐标为704nm处的荧光强度；
图3是本发明的探针P-NO2对各种活性氧、活性氮、巯基、常见氨基酸的响应情况；
图4是本发明的探针P-NO2对人肝癌细胞(HepG2)外源性过氧化氢的激光共聚焦显微成像；a为细胞成像图，b为亮场图，c为a与b的叠加图；
图5是本发明的探针P-NO2对人肝癌细胞(HepG2)内源性过氧化氢的激光共聚焦显微成像。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)3-氨基苯酚(436mg)、(Boc)2O(1.04g)溶解在无水乙醇(15mL)中，80℃回流5h，旋干，得白色固体(Ph-Boc)。
质谱表征：
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-H]＝208.0968,[2M-H]＝417.2020,Found208.1114，417.2035.
(2)将Cy.7.Cl(200mg)、氢化钠(19.2mg)和步骤(1)得到的Ph-Boc(163mg)、溶解在DMF(3mL)中，25℃反应2h，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V石油醚：V二氯甲烷：V无水乙醇＝25:25:1)，旋干，得绿色固体(Cy-Ph-Boc)。
质谱表征：
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝684.4159,Found684.4198.
(3)将Cy-Ph-Boc(200mg)溶解在二氯甲烷(3mL)中，冰浴1h，然后滴加三氟乙酸(1mL)，25℃反应6h。饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V二氯甲烷：V无水乙醇＝15:1)，旋干，得绿色固体(Cy-Ph-NH2)。
质谱表征：
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝584.3635,Found584.3668.
(4)将Cy-Ph-NH2(162.2mg)、氢化钠(6.72mg)溶解在DMF(2mL)中，90℃回流4h。旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V二氯甲烷:V无水乙醇＝50:3)，旋干，得蓝绿色固体(P-NH2)。
核磁及质谱表征：
1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝1.31(s,3H),1.70(s,6H),1.81(s,2H),2.65(s,2H),2.70(s,2H),4.25-4.27(d,J＝8Hz,2H),6.23-6.26(d,J＝12Hz,1H),6.67(s,1H),6.73-6.75(d,J＝8Hz,1H),6.93(s,2H),7.30(s,1H),7.39-7.41(d,J＝8Hz,1H),7.46(s,2H),7.65(s,2H),8.41-8.44(d,J＝12Hz,1H).
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝397.2274,Found397.2276.
(5)将4-硝基苯乙醛酸(39mg)溶解在超干二氯甲烷(2mL)中，滴加2滴DMF，加入草酰氯(53μL)，40℃回流1h，旋干，得淡黄色固体4-硝基苯乙醛酰氯。
(6)将P-NH2(52mg)、三乙胺(11.6μL)溶解在超干二氯甲烷(5mL)中，将4-硝基苯乙醛酰氯逐滴滴入，25℃反应1h。饱和碳酸氢钠水溶液与二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V二氯甲烷：V无水乙醇＝100:3。)，旋干，得蓝色固体(P-NO2)。
核磁及质谱表征：
1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝1.39(s,3H),1.76(s,6H),1.85(s,2H),2.70(s,2H),2.75(s,2H),4.47-4.49(d,J＝8Hz,2H),6.63-6.67(d,J＝16Hz,1H),7.47(s,2H),7.54-7.57(t,J＝8Hz,1H),7.60-7.62(d,J＝8Hz,1H),7.72-7.74(d,J＝8Hz,2H),7.80-7.81(d,J＝4Hz,1H),8.07(s,1H),8.33-8.35(d,J＝8Hz,2H),8.41-8.43(d,J＝8Hz,2H),8.59-8.63(d,J＝16Hz,1H),11.54(s,1H).
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝574.2336,[M+CH3OH-I]+＝606.2598,Found574.2365,606.2617.
合成过程如下：
实施例2
(1)3-氨基苯酚(2.18g)、(Boc)2O(5.2g)溶解在无水乙醇(75mL)中，80℃回流5h，旋干，得白色固体(Ph-Boc)。
质谱表征：
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-H]＝208.0968,[2M-H]＝417.2020,Found208.1114，417.2035.
(2)将Cy.7.Cl(0.8g)、氢化钠(76.8mg)和步骤(1)得到的Ph-Boc(0.625g)、溶解在DMF(12mL)中，25℃反应2h，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V石油醚：V二氯甲烷：V无水乙醇＝25:25:1)，旋干，得绿色固体(Cy-Ph-Boc)。
质谱表征：
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝684.4159,Found684.4198.
(3)将Cy-Ph-Boc(0.450mg)溶解在二氯甲烷(6.75mL)中，冰浴1h，然后滴加三氟乙酸(2.25mL)，25℃反应6h。饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V二氯甲烷：V无水乙醇＝15:1)，旋干，得绿色固体(Cy-Ph-NH2)。
质谱表征：
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝584.3635,Found584.3668.
(4)将Cy-Ph-NH2(0.2g)、氢化钠(8mg)溶解在DMF(2mL)中，90℃回流4h。旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V二氯甲烷:V无水乙醇＝50:3)，旋干，得蓝绿色固体(P-NH2)。
核磁及质谱表征：
1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝1.31(s,3H),1.70(s,6H),1.81(s,2H),2.65(s,2H),2.70(s,2H),4.25-4.27(d,J＝8Hz,2H),6.23-6.26(d,J＝12Hz,1H),6.67(s,1H),6.73-6.75(d,J＝8Hz,1H),6.93(s,2H),7.30(s,1H),7.39-7.41(d,J＝8Hz,1H),7.46(s,2H),7.65(s,2H),8.41-8.44(d,J＝12Hz,1H).
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝397.2274,Found397.2276.
(5)将4-硝基苯乙醛酸(78mg)溶解在超干二氯甲烷(4mL)中，滴加4滴DMF，加入草酰氯(106μL)，40℃回流1h，旋干，得淡黄色固体-4-硝基苯乙醛酰氯。
(6)将P-NH2(0.104g)、三乙胺(23.2μL)溶解在超干二氯甲烷(10mL)中，将4-硝基苯乙醛酰氯逐滴滴入，25℃反应1h。饱和碳酸氢钠水溶液与二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V二氯甲烷：V无水乙醇＝100:3。)，旋干，得到蓝色固体(P-NO2)。
核磁及质谱表征：
1HNMR(400MHz,DMSO):δ＝1.39(s,3H),1.76(s,6H),1.85(s,2H),2.70(s,2H),2.75(s,2H),4.47-4.49(d,J＝8Hz,2H),6.63-6.67(d,J＝16Hz,1H),7.47(s,2H),7.54-7.57(t,J＝8Hz,1H),7.60-7.62(d,J＝8Hz,1H),7.72-7.74(d,J＝8Hz,2H),7.80-7.81(d,J＝4Hz,1H),8.07(s,1H),8.33-8.35(d,J＝8Hz,2H),8.41-8.43(d,J＝8Hz,2H),8.59-8.63(d,J＝16Hz,1H),11.54(s,1H).
HRMS(ESI-):m/zcalcdfor[M-I]+＝574.2336,[M+CH3OH-I]+＝606.2598,Found574.2365,606.2617。
实施例3
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将4-硝基苯乙醛酸改为4-腈基苯乙醛酸。
实施例4
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将4-硝基苯乙醛酸改为4-磺酸基苯乙醛酸。
实施例5
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将4-硝基苯乙醛酸改为4-三氟甲基苯乙醛酸。
实施例6
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将4-硝基苯乙醛酸改为1-腈基-4-硝基苯乙醛酸。
实施例7
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将4-硝基苯乙醛酸改为2-磺酸基-4-硝基苯乙醛酸。
实施例8
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将4-硝基苯乙醛酸改为2-磺酸基-5-硝基苯乙醛酸。
效果试验：
1.分别用10.0μM实施例1的探针P-NO2对0,3,7,11,16,21,24,31,40,50μM的H2O2进行荧光响应测试，得到探针P-NO2的荧光强度和过氧化氢浓度变化的关系。实验条件：激发/发射波长＝670/704nm，50mMPBS/CH3OH(pH7.4,50:1,v/v)，37℃下孵育10min。横坐标为波长(nm)，纵坐标为704nm处的荧光强度。探针激发波长为670nm，发射波长为704nm，测试结果显示如图1，在704nm处荧光随着过氧化氢浓度增大逐渐增强，说明本探针可以用于过氧化氢的检测。
2.本发明实施例1的探针P-NO2的荧光强度和过氧化氢浓度的工作曲线。横坐标为过氧化氢浓度，纵坐标为704nm处的荧光强度。测试结果显示如图2，说明在过氧化氢浓度为1μM-50μM的范围内，探针荧光强度与过氧化氢浓度之间有较好的线性关系。
3.本发明实例1的探针P-NO2对活性氧、活性氮、巯基和常见氨基酸的响应情况，如图3所示，其中超氧阴离子的浓度为30μΜ，GSH、Cys的浓度为5mM，其余待测物浓度均为100μM。测试结果，说明该探针对过氧化氢具有较好的选择性。
4.本发明实施例1的探针P-NO2对人肝癌细胞(HepG2)外源性过氧化氢的激光共聚焦显微成像。
HepG2细胞由高糖的DMEM培养液培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，然后加入50μMH2O2孵育10分钟，再加入10μM探针的PBS缓冲液，然后进行激光共聚焦显微成像。测试结果显示如图4，图a为细胞成像图，能观察到明显的荧光，图b为亮场图，图c为图a和图b的叠加图。细胞在整个实验过程中保持良好的细胞活性。
5.本发明实施例1的探针P-NO2对人肝癌细胞(HepG2)内源性过氧化氢的激光共聚焦显微成像。
测试结果显示如图5，图a是未经刺激的HepG2细胞与10μM探针孵育10分钟的细胞成像图，能观察到微弱的荧光，图b是以100nM鱼藤酮刺激细胞30分钟后，再与10μM探针孵育细胞10分钟的细胞成像图，能观察到荧光明显增强，图c是以100nM鱼藤酮刺激细胞30分钟后，然后以20mMNAC清除细胞内过氧化氢一个小时后，再与10μM探针孵育10分钟的细胞成像图，与图b相比，能观察到荧光明显变弱。细胞在整个实验过程中保持良好的细胞活性。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测过氧化氢的荧光探针，其特征是，其结构式如下：
其中，R1-R5中任意1个或2个为吸电子基团。
2.如权利要求1所述的一种检测过氧化氢的荧光探针，其特征是，所述吸电子基团为-NO2、-CN、-SO3H或-CF3。
3.一种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，将3-氨基苯酚与Cy.7.Cl进行取代反应后得到Cy-Ph-NH2，然后经过retro-Knoevenagel反应得到P-NH2，最后与苯乙醛酸的衍生物经取代反应得到产物P-R，即为检测过氧化氢的荧光探针。
4.如权利要求3所述的一种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，其反应步骤为：
(1)将二碳酸二叔丁酯(Boc)2O与3-氨基苯酚溶解在溶剂中加热反应后得到Ph-Boc；
(2)将Cy.7.Cl、氢化钠和步骤(1)得到的Ph-Boc溶解在溶剂中反应后得到Cy-Ph-Boc；
(3)将Cy-Ph-Boc溶解在溶剂中，冰浴后，加入三氟乙酸后，加热反应后得到Cy-Ph-NH2；
(4)将Cy-Ph-NH2、氢化钠溶解在溶剂中加热回流后得到P-NH2；
(5)将苯乙醛酸的衍生物溶解在溶剂中，滴入DMF，加入草酰氯加热反应后得到苯乙醛酰氯的衍生物；
(6)将P-NH2、三乙胺溶解在溶剂中，滴加苯乙醛酰氯的衍生物，反应后得到产物P-R，即为检测过氧化氢的荧光探针。
5.如权利要求4所述的一种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的反应温度为75-85℃，反应时间为4-6h；
所述步骤(2)的反应温度为20-30℃，反应时间为2-3h；
所述步骤(3)的冰浴时间为1-2h，反应温度为20-30℃，反应时间为5-8h；
所述步骤(4)的反应温度为85-95℃，反应时间为4-6h；
所述步骤(5)的反应温度为40-50℃，反应时间为1-2h；
所述步骤(6)的反应温度为20-30℃，反应时间为1-2h。
6.如权利要求4所述的一种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤(1)的溶剂为无水乙醇，所述步骤(2)和(4)的溶剂为DMF，所述步骤(3)的溶剂为二氯甲烷，步骤(5)和(6)的溶剂为超干二氯甲烷；
所述步骤(1)中3-氨基苯酚、(Boc)2O、无水乙醇的用量比例为1:2-3:30-40，g:g:mL；
所述步骤(2)中Cy.7.Cl、氢化钠、Ph-Boc、DMF的用量比例为1:0.1-0.2:0.7-1:15-20，g:g:g：mL；
所述步骤(3)中Cy-Ph-Boc、二氯甲烷、三氟乙酸的用量比例为0.2-0.4:6-10:1，g:mL:mL；
所述步骤(4)中Cy-Ph-NH2、氢化钠、DMF的用量比例为1:0.03-0.05:12-20，g:g:mL；
所述步骤(5)中4-硝基苯乙醛酸、超干二氯甲烷、草酰氯、DMF的用量比例为1:80-100:1-1.5:0.5-0.8，g:mL:mL:mL；
所述步骤(6)中P-NH2、三乙胺、4-硝基苯乙醛酰氯、超干二氯甲烷的用量比例为1-1.5：0.1-0.5:1:130-150，g:mL:g:mL。
7.如权利要求4所述的一种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，其特征是，所述步骤(2)和(4)的产物纯化方法为直接色谱分离；所述步骤(3)和(6)的产物纯化方法为先用饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷萃取，然后有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，最后进行色谱分离；
所述步骤(2)的色谱分离洗脱剂是石油醚、二氯甲烷和无水乙醇体积比为20-30:20-30:1的混合液；
所述步骤(3)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为10-20:1的混合液；
所述步骤(4)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为40-60:3的混合液；
所述步骤(6)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为90-110:3的混合液。
8.一种权利要求1或2所述的检测过氧化氢的荧光探针在检测过氧化氢中的应用。
9.一种检测过氧化氢的方法，其特征是，其步骤为：
(1)将权利要求1或2所述的检测过氧化氢的荧光探针溶解在生理盐水、缓冲液或培养液中，配制成储备液储存待用；
(2)加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
10.一种检测活细胞内过氧化氢的方法，其特征是，其步骤为：
(1)将含有权利要求1或2所述的检测过氧化氢的荧光探针的缓冲溶液5-10μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育10-30分钟；
(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加了检测物后，再次孵育10分钟，进行成像。
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