CN105154071A

CN105154071A - 一种荧光探针及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105154071A
Application number: CN201510677189.2A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 李平; 张雯; 肖海滨
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明公开了一种荧光探针及其制备方法与应用，其结构式如下式Ⅰ所示：荧光探针的制备方法，包括如下步骤：将对硝基苯甲醛，2,5-二甲基吡嗪和催化剂混合得到混合液，将混合液加热至150-180℃，反应，得到PY-NO2；在PY-NO2中加入多硫化钠，反应，得到PY-NH2；将PY-NH2、咖啡酸、三乙胺、HOBT和EDC.HCL加入到二氯甲烷和DMF的混合溶剂中得到混合液；所述混合液在惰性气体的保护下，搅拌，得到双光子荧光探针的粗产品，纯化后，得到双光子荧光探针纯品。本发明的荧光探针的化学稳定性，光物理稳定性好；在酸性、中性和碱性中对O₂ ^˙-都能响应敏感，测定灵敏度较高，且响应时间极短。

Description

一种荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

有机体寿命受多重复杂因素的影响，例如细胞机制和环境。大量证据表明细胞能量代谢与ROS密切相关。然而，到目前为止，关于ROS的作用方面还没有一致的观点。许多研究发现ROS参与到细胞损伤中因此加速老化过程。但是，也有许多人发现ROS信号转导的作用会延缓与老化相关的疾病或者是老化本身。这些争议存在是由缺少理想的工具用于精确监测生物体系中ROS变化的困难引起的。考虑到O₂ ^˙-是第一个产生的ROS而且能够转化成其他ROS，灵敏、瞬时的在活体中示踪O₂˙^-对于理清O₂ ^˙-与寿命的关系有着重要作用。荧光成像的检测方法提供了高的时空分辨率，同时对细胞损伤小，所以越来越多的被认为是一种检测生物活性小分子的有力工具。然而具有更好的光学性能的用于可视化活体中O₂ ^˙-的荧光探针仍然非常缺少。

双光子荧光显微镜(TPFM)在活体成像领域有着广泛的应用前景，其中包括生物传感，肿瘤学，神经科学以及胚胎学，因为TPFM应用了两个能量更低的光子激发从而增加了组织的穿透深度和减少了光损伤。因此，大量的TP荧光探针被成功的应用于检测活细胞和活体中的生物活性小分子。为了研究复杂环境中O₂ ^˙-水平对有机体寿命的影响，迫切需要建构能够动态成像O₂ ^˙-变化的TP荧光探针，同时该探针还需要具有良好的选择性，高的TP吸收截面积以及深的穿透深度。但是，目前满足要求的用于可视化活组织和完整有机体中O₂ ^˙-的TP荧光探针仍然非常缺少。因此为了解决上述问题，新的成像O₂ ^˙-荧光探针的光学性能需要大大提高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针具有灵敏度、选择性好以及光稳定性好的优点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种荧光探针，其结构式如下式Ⅰ所示：

上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)PY-NO2(2,5-二(4’-硝基苯乙烯基)吡嗪)的制备：

将对硝基苯甲醛，2,5-二甲基吡嗪和催化剂混合得到混合液，将混合液加热至150-180℃，反应，得到PY-NO2；

2)2,5-二(4’-氨基苯乙烯基)吡嗪(PY-NH2)的制备：

在步骤1)得到的PY-NO2中加入多硫化钠，反应，得到PY-NH2；

3)荧光探针的制备：

将PY-NH2、咖啡酸、三乙胺、1-羟基苯并三唑(HOBT)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)加入到二氯甲烷和DMF的混合溶剂中得到混合液；所述混合液在惰性气体的保护下，搅拌，得到荧光探针的粗产品，纯化后，得到荧光探针纯品。

优选的，步骤1)中，所述2,5-二甲基吡嗪、对硝基苯甲醛和催化剂三者的物质的量之比为1：(1-2.5)：(1-2.5)。

进一步优选的，所述2,5-二甲基吡嗪、对硝基苯甲醛和催化剂三者的物质的量之比为1：2：2。

优选的，步骤1)中，所述催化剂为邻苯二甲酸酐、苯甲酸酐或乙酸酐。这些催化剂不但可以有效地提高2,5-二甲基吡嗪和对硝基苯甲醛的反应速率，还可以有效提高原料的转化率。

优选的，步骤1)中，所述混合液是在加热回流的条件下反应的，回流的时间为10-15h。

优选的，步骤1)中，所述PY-NO2的纯化方法，包括如下步骤：将步骤1)中反应得到的PY-NO2粗产品用氯仿或二氯甲烷溶解，洗去PY-NO2粗产品中的催化剂后，有机层通过硅胶柱色谱分离后，得到PY-NO2纯品。

进一步优选的，洗去PY-NO2粗产品中催化剂的溶液为饱和氢氧化钠溶液、饱和碳酸钠溶液或饱和氢氧化钾溶液。这些饱和溶液可以彻底地除去PY-NO2粗产品中的催化剂，使得到的PY-NO2更纯净。

优选的，步骤2)中，PY-NO2与多硫化钠的物质的量之比为1：1-1：10。

优选的，步骤2)中，PY-NO2与多硫化钠的混合物在95％的乙醇溶液中回流3-5h，回流温度为78℃，制得PY-NH2。95％的乙醇溶液的沸点为78℃，可以保证在加热反应的过程中，反应物的温度维持在78℃，既保证了反应速率，又减少了反应产生的副产物。

优选的，步骤3)中，所述PY-NH2，咖啡酸，三乙胺，HOBT和EDC.HCL五者的物质的量比为1:(2-3.5)：(2-3.5)：(2-3.5)：(2-3.5)。其中，HOBT、EDC.HCL是反应催化剂，作用是活化咖啡酸的羧基。

优选的，步骤3)中，PY-NH2和混合溶剂的比例为1mmol：(8-30)ml。

优选的，步骤3)中，所述混合溶剂中，DMF和CH₂Cl₂的体积比为1：2-6。该组分配比的混合溶剂可以充分溶解反应物，使反应顺利进行。

优选的，步骤3)中，荧光探针粗产品的纯化方法，包括如下步骤：将得到的粗产品进行浓缩，将浓缩后的粗产品进行薄层色谱分离，洗脱剂为甲醇、甲苯和乙酸乙酯混合液，其中，甲醇、甲苯和乙酸乙酯的体积比为1：6-10：2-6。该洗脱剂可以有效地将荧光探针洗脱下来，而不会将其他杂质洗脱下来，而且这种洗脱剂易与产物分离，保证了洗脱后的产品的纯度。

进一步优选的，所述洗脱剂中甲醇、甲苯和乙酸乙酯的体积比为1：8：4。

本发明的荧光探针，单光子激发波长为400nm，双光子激发波长为800nm，最大发射波长为520nm。

上述的荧光探针在检测细胞内或活体内的超氧阴离子中的应用。

上述的荧光探针检测细胞或活体内超氧阴离子的方法为：用含有荧光探针的溶液孵育细胞或活体，孵育设定时间后，洗去多余荧光探针分子，然后进行激光共聚焦显微成像。

优选的，所述溶液为生理盐水、缓冲范围内包括pH值为7.4的缓冲液或水溶性有机溶剂。

优选的，所述缓冲溶液的浓度为0.01-0.05mol/L。

优选的，所述含有荧光探针的溶液中的荧光探针的浓度为1-10μmol/L。该浓度的荧光探针可以对细胞或活体进行较好地成像。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的荧光探针的化学稳定性，光物理稳定性好；本发明的荧光探针在酸性、中性和碱性等较宽的pH范围内对O₂ ^˙-都能响应敏感，与O₂ ^˙-反应后的荧光强度至少可以增强5倍，测定灵敏度较高，且响应时间极短。

(2)本发明的荧光探针对O₂ ^˙-有很好的选择性，过氧化氢(H₂O₂)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、次氯酸根(OCl^-)、单线态氧(¹O₂)、过氧化亚硝酰(ONOO^-)、羟基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)，以及金属离子Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Cu⁺与Zn²⁺对检测没有干扰；探针分子细胞渗透性好，对细胞没有毒副作用，适于细胞内O₂ ^˙-浓度变化的检测。

(3)本发明的荧光探针对O₂ ^˙-的响应为可逆反应，可逆反应可以实现动态、实时的观察O₂ ^˙-的变化。

(4)本发明的荧光探针的合成步骤简单，容易纯化。

附图说明

图1为本发明的探针Ⅰ的双光子荧光强度和O₂ ^˙-变化的关系，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；

图2为本发明的探针Ⅰ的荧光强度和不同浓度的O₂ ^˙-的滴定曲线，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度，右上的小图横坐标为O₂ ^˙-浓度，纵坐标为荧光强度；

图3为本发明的探针Ⅰ的选择性示意图。10μM本发明的探针Ⅰ对不同的活性氧和活性氮60min内的荧光响应(20mMH₂O₂，200μMTBHP，200μMNaClO，200μM¹O₂，33μMONOO^–，200μM^.OH，200μMNO以及O₂ ^˙-20μM)，图标为不同的测试时间(0到60min)。

图4为本发明的探针Ⅰ对HepG2细胞内O₂ ^˙-的双光子原位成像。其中，图中，b，d为2-甲基雌二醇刺激后肝癌细胞成像；c,e为加入O₂ ^˙-抗坏血酸后的荧光成像。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：PY-NH2的合成

步骤如下：

2,5-二(4’-氨基苯乙烯基)吡嗪(PY-NH2)：250mL三口烧瓶中加入对硝基苯甲醛(7.55g，0.05mol)、2,5-二甲基吡嗪(3.24g，0.01mol)和邻苯二甲酸酐(7.40g，0.05mol)。加热至180℃，回流15h后，冷却至室温，用50mL氯仿溶解。溶液用5％氢氧化钠溶液萃取后，有机层通过硅胶柱色谱分离(淋洗液为正己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到PY-NO2。在PY-NO2中加入10ml多硫化钠，在乙醇溶液中回流3h，得到PY-NH2。

PY-NH2.¹HNMR(400MHz,DMSO):δ8.55(s,4H),δ8.43(s,2H),δ7.56(d,J＝16.0,2H),δ7.35(d,J＝8.0,4H),δ6.99(d,J＝16.0,2H),δ6.59(d,J＝8.0,4H)；¹³CHNMR(400MHz,DMSO):δ150.27,144.11,142.27,134.29,129.08,129.01,118.95,114.31；MSdata,m/zcalcdfor[C₂₀H₁₈N₄+H]315.1565,found315.1600.

实施例2：荧光探针的合成

PY-CA的合成步骤如下：250mL三口烧瓶中加入PY-NH2(0.314g，1.0mmol)，咖啡酸(0.525g，3.0mmol)，三乙胺(1.0mL)，HOBT(0.636g，3.0mmol)和EDC(0.576g，3.0mmol)到二氯甲烷(8.0mL)和DMF(1.2mL)的混合溶剂中。在氩气的保护下，混合液于室温搅拌过夜，得到粗产品。通过旋转蒸发掉部分溶剂后，产物进行薄层色谱分离(硅胶GF₂₅₄)，洗脱剂为甲苯/甲醇/乙酸乙酯＝4/0.5/2，得到黄色产物。

实施例3：荧光探针的合成

PY-CA的合成步骤如下：250mL三口烧瓶中加入PY-NH2(1.0mmol)，咖啡酸(2.0mmol)，三乙胺(1.0mL)，HOBT(2.0mmol)和EDC(3.5mmol)到二氯甲烷(8.0mL)和DMF(3.0mL)的混合溶剂中。在氩气的保护下，混合液于室温搅拌过夜，得到粗产品。通过旋转蒸发掉部分溶剂后，产物进行薄层色谱分离(硅胶GF₂₅₄)，洗脱剂为甲苯/甲醇/乙酸乙酯＝6/1/4，得到黄色产物。

PY-CA.¹HNMR(400MHz,DMSO):δ8.30(s,2H),δ8.16(d,J＝8.0,4H),δ7.92(d,J＝8.0,4H),δ7.9278(d,J＝16.0,2H),δ7.63(d,J＝8.0,4H),δ7.47(d,J＝16.0,2H),δ7.45(d,J＝16.0,2H),δ7.43(s,4H),δ7.37(d,J＝16.0,2H),δ7.35(s,4H)；¹³CHNMR(400MHz,DMSO):δ164.38,162.96,143.24,132.48,132.03,129.58,129.13,128.26,127.94,125.96,124.34,120.20,110.08,113.40,110.72,110.19,106.87；MSdata,m/zcalcdfor[C₃₈H₃₀N₄O₆+H]639.2165,found639.2265.

实施例4效果实验

(1)探针Ⅰ对O₂ ^˙-的响应性实验

使用实施例1合成的探针Ⅰ评价其对O₂ ^˙-的响应性

将10μM的实施例1合成的探针Ⅰ加入到Tris缓冲，pH7.4，单光子激发波长为400nm,双光子激发波长为800nm,最大发射波长为520nm。当加入O₂ ^˙-后，探针的单光子和双光子荧光都明显增强。测试结果如图1、图2所示。图1为荧光光谱，图2为滴定曲线。由图1和图2可知，探针Ⅰ对O₂ ^˙-变化响应敏感，可以作为O₂ ^˙探针使用。

(2)探针Ⅰ对细胞内O₂ ^˙-的荧光成像

HepG2细胞(选自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)由高糖的DMEM培养液(Gibco)培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，同一皿细胞中循环加入刺激剂2-甲基雌二醇(1.0μg/mL)和还原剂抗坏血酸1.0mM。图4中，a室温下只用10μM探针孵育细胞10分钟；b和d10μM探针孵育后的细胞，用-甲基雌二醇(1.0μg/mL)孵育30分钟；c,e-甲基雌二醇刺激的后的细胞，再用1.0mM的抗坏血酸孵育30分钟。f在加入10μM探针之前，用2-ME刺激的细胞用10μM钛铁清除剂孵育30分钟。双光子激发波长为800nm，收集发射为500-550nm。可以看到探针能够对细胞中O₂ ^˙-进行可视化研究。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种荧光探针，其特征在于：其结构式如下式Ⅰ所示：

2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)PY-NO2的制备：

2)PY-NH2的制备：

在步骤1)得到的PY-NO2中加入多硫化钠，反应，得到PY-NH2；

3)荧光探针的制备：

将PY-NH2、咖啡酸、三乙胺、HOBT和EDC.HCL加入到二氯甲烷和DMF的混合溶剂中得到混合液；所述混合液在惰性气体的保护下，搅拌，得到荧光探针的粗产品，纯化后，得到荧光探针纯品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述2,5-二甲基吡嗪、对硝基苯甲醛和催化剂三者的物质的量之比为1：(1-2.5)：(1-2.5)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述催化剂邻苯二甲酸酐、苯甲酸酐或乙酸酐。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述PY-NO2的纯化方法，包括如下步骤：将步骤1)中反应得到的PY-NO2粗产品用氯仿或二氯甲烷溶解，洗去PY-NO2粗产品中的催化剂后，有机层通过硅胶柱色谱分离后，得到PY-NO2纯品。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，PY-NO2与多硫化钠的混合物在95％的乙醇溶液中回流3-5h，制得PY-NH2。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，荧光探针粗产品的纯化方法，包括如下步骤：将得到的粗产品进行浓缩，将浓缩后的粗产品进行薄层色谱分离，洗脱剂为甲醇、甲苯和乙酸乙酯混合液，其中，甲醇、甲苯和乙酸乙酯的体积比为1：6-10：2-6。

8.权利要求1所述的在检测细胞内或活体内的超氧阴离子中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述述的荧光探针检测细胞或活体内超氧阴离子的方法为：用含有荧光探针的溶液孵育细胞或活体，孵育设定时间后，洗去多余荧光探针分子，然后进行激光共聚焦显微成像。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述溶液为生理盐水、缓冲范围内包括pH值为7.4的缓冲液或水溶性有机溶剂。