CN110734450A - 一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种硫化氢荧光探针及其制备与应用，荧光探针分子式为C27H25NO9；荧光探针的制备包括步骤：荧光素与氢氧化钠反应后，再与对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯反应得到化合物4，将化合物4与N‑苯基双(三氟甲磺酰)亚胺反应得到化合物3，将化合物3与联硼酸频那醇酯反应得到化合物2，将化合物2水解后，再与亚硝酸叔丁酯反应得到硫化氢荧光探针。该探针在纯水溶液中对硫化氢的检测表现出较高的选择性。

Description

一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及硫化氢荧光探针制备技术，尤其是一种硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的无色、易燃的有毒气体。然而，研究表明，硫化氢是继一氧化氮、一氧化碳之后排名第三的气体信号分子。作为气体信号分子，内源性的硫化氢在生物体的生理和病理过程中具有重要的作用，比如控制细胞生长、保护心脑血管和刺激血管生成，还可以作为体内的一种抗氧化剂。从另外一个角度来讲，如果体内的硫化氢浓度紊乱，则会引起痴呆症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等各种疾病。因此，发展灵敏度高、选择好的检测硫化氢的方法对研究硫化氢在生物体内的作用机理是一项非常有意义的工作。
虽然一些传统方法，如比色法、电化学法、气相色谱法和金属诱导硫化物沉淀法等，可用于检测硫化氢，但这些方法通常需要样品预处理和破坏细胞或组织，在生物学研究中受到限制。与传统检测方法相比，荧光成像技术由于具有操作简单，灵敏度高、选择性好等优点，已成为研究生物体内活性分子的重要方法。因此，近年发展了许多检测硫化氢的荧光探针，这些探针的设计主要利用硫化氢与铜离子络合，硫解二硝基苯醚，亲核性和还原性等性质。由于硝基对荧光团具有很强的淬灭作用，能有效降低背景信号。因此，基于硝基还原的荧光增强型硫化氢探针可以有效减少体系自身环境的干扰从而提供更加可信的荧光信号。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种选择性好、快速简便的硫化氢荧光探针，还相应提供该硫化氢荧光探针的制备方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种硫化氢荧光探针，所述硫化氢荧光探针为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-硝基-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(1)：
Figure BDA0002232598620000021
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)荧光素与氢氧化钠反应生产荧光素二钠盐化合物后，再与对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯反应，得到3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(4)：
Figure BDA0002232598620000022
(2)步骤(1)所得的3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺反应，得到3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(3)：
Figure BDA0002232598620000023
(3)步骤(2)所得的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与联硼酸频那醇酯反应，得到3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(2)：
Figure BDA0002232598620000024
(4)步骤(3)所得的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮水解后，再与亚硝酸叔丁酯反应，得到式(1)所示的化合物。
优选的，所述步骤(1)的具体过程为：
将荧光素加入到氢氧化钠的甲醇溶液中，室温搅拌至荧光素完全溶解。溶解后减压蒸馏除去溶剂，残留物真空干燥即得到荧光素二钠盐化合物。将荧光素二钠盐化合物溶解在对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加热至90℃反应36小时后，减压蒸馏除去溶剂，用5％的碳酸氢钠溶液稀释后，用乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂即得到棕色油状化合物。将其用甲醇溶解后，加入2M的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应2小时后，减压蒸馏除去溶剂，用水稀释后，用浓盐酸调pH为2左右，用乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮。
优选的，所述荧光素与对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯的摩尔比为1∶5.0～10.0。
优选的，所述步骤(2)的具体过程为：
在双口瓶中加入3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮和N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水四氢呋喃和N,N-二异丙基乙胺。然后，氩气保护下室温搅拌反应过夜，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮。
优选的，所述3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺的摩尔比为1∶1.0～2.0。
优选的，所述步骤(3)的具体过程为：
在双口瓶中加入3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，联硼酸频那醇，1,1′-双(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(II)二氯甲烷复合物和醋酸钾，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水1,4-二氧六环。然后，加热至80℃氩气保护下反应过夜，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮。
优选的，所述3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与联硼酸频那醇酯的摩尔比为1∶1.5～2.0。
优选的，所述步骤(4)的具体过程为：
将3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮溶解在四氢呋喃和水的混合液中，然后向其中加入高碘酸钠，室温搅拌反应2小时后，加入1M的盐酸，室温继续搅拌反应5小时，TLC检测原料消失，反应液用乙酸乙酯萃取三次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂即得到黄色中间体，真空干燥后，加入无水1,4-二氧六环和亚硝酸叔丁酯，然后加热至80℃搅拌反应过夜，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-硝基-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮。
优选的，所述3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与亚硝酸叔丁酯的摩尔比为1∶10.0～20.0。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的硫化氢荧光探针或上述的制备方法制得的硫化氢荧光探针的应用，将所述硫化氢荧光探针与磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用荧光强度的变化来检测硫化氢的存在与否。
优选的，所述待测溶液中无硫化氢时，所述反应溶液无荧光发射，当加入硫化氢(以硫化钠作为前体)后，所述反应溶液518nm处的荧光明显增强。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的一种硫化氢荧光探针是以硝基为识别单元的荧光探针，实践表明，本发明的荧光探针分子在对硫化氢进行检测时表现出了较高的选择性。
2、本发明还提供了上述硫化氢荧光探针的制备方法。
3、本发明还提供了上述硫化氢荧光探针的应用。
附图说明
图1为实施例1的式(1)所示的化合物(即硫化氢荧光探针)的合成路线图。
图2为实施例1制备的式(4)所示的化合物的1H NMR图谱。
图3为实施例1制备的式(4)所示的化合物的13C NMR图谱。
图4为实施例1制备的式(3)所示的化合物的1H NMR图谱。
图5为实施例1制备的式(3)所示的化合物的13C NMR图谱。
图6为实施例1制备的式(2)所示的化合物的1H NMR图谱。
图7为实施例1制备的式(2)所示的化合物的13C NMR图谱。
图8为实施例1制备的式(1)所示的化合物的1H NMR图谱。
图9为实施例1制备的式(1)所示的化合物的13C NMR图谱。
图10为实施例1制备的式(1)所示的化合物的HRMS图谱。
图11为pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物与硫化氢反应前后518nm处荧光强度的影响示意图。
图12中(a)为最佳测试条件下实施例1的式(1)所示的化合物与硫化氢反应的荧光光谱变化示意图，(b)为实施例1的式(1)所示的化合物与硫化氢反应时518nm处荧光强度的变化示意图。
图13中(a)为实施例1的式(1)所示的化合物与不同浓度硫化氢反应的荧光光谱变化示意图，(b)为实施例1的式(1)所示的化合物518nm处荧光强度随硫化氢浓度的变化示意图。
图14为实施例1制备的式(1)所示的化合物与各种分析物反应前后518nm处荧光强度的变化示意图(灰色柱代表探针只经标注的分析物处理，黑色柱代表探针经标注的分析物处理后，再添加硫化氢)。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种本发明的硫化氢荧光探针，名称为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-硝基-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，分子式为C27H25NO9，结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002232598620000061
上述本实施例的硫化氢荧光探针的制备方法，其合成路线如图1所示，包括以下步骤：
(1)合成结构式如式(4)所示的3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮：
反应式如式(2)：
Figure BDA0002232598620000063
具体过程为：将荧光素(6g,18mmol)加入到氢氧化钠(1.44g,36mmol)的甲醇(150mL)溶液中，室温搅拌至荧光素完全溶解。溶解后减压蒸馏除去溶剂，残留物真空干燥即得到荧光素二钠盐化合物(6.76g,定量)。将荧光素二钠盐化合物溶解在对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯(28.6g,90mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(150mL)溶液中，加热至90℃反应36小时后，减压蒸馏除去溶剂，用5％的碳酸氢钠溶液(60mL)稀释后，用乙酸乙酯(150mL)萃取三次，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂即得到棕色油状化合物。将其用甲醇溶解后，加入2M的氢氧化钠水溶液(30mL)，室温搅拌反应2小时后，减压蒸馏除去溶剂，用水(40mL)稀释后，用浓盐酸调pH为2左右，用乙酸乙酯(150mL)萃取三次，有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，产率25％。
式(4)所示的化合物的1H NMR图谱如图2所示，1H NMR(400MHz,d6-acetone,ppm)δ8.98(s,1H),8.00-7.98(d,J＝7.6Hz,1H),7.83-7.79(t,J＝7.2Hz,1H),7.76-7.72(t,J＝7.6Hz,1H),7.29-7.27(d,J＝7.6Hz,1H),6.89(s,1H),6.77-6.76(d,J＝2.4Hz,1H),6.73-6.72(d,J＝1.2Hz,2H),6.68-6.66(d,J＝8.8Hz,1H),6.65-6.62(dd,J＝8.8Hz,J＝2.0Hz,1H),4.24-4.21(t,J＝4.8Hz,2H),3.85-3.83(t,J＝4.8Hz,2H),3.67-3.64(m,2H),3.61-3.56(m,4H),3.47-3.45(m,2H),3.27(s,3H)。
式(4)所示的化合物的13C NMR图谱如图3所示，13C NMR(100MHz,d6-acetone,ppm)δ169.5,161.7,160.3,154.0,153.3,136.1,130.8,130.1,123.0,127.8,125.4,124.9,113.4,113.0,112.6,111.6,103.4,102.2,83.5,72.6,71.4,71.2,71.1,70.1,68.8,58.8。
(2)合成结构式如式(3)所示的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮：
Figure BDA0002232598620000071
反应式如式(3)：
Figure BDA0002232598620000072
具体过程为：在双口瓶中加入3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮(957mg,2mmol)和N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺(786mg,2.2mmol)，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水四氢呋喃(10mL)和N,N-二异丙基乙胺(0.4mL,2.4mmol)。然后，氩气保护下室温搅拌反应过夜，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，产率65％。
式(3)所示的化合物的1H NMR图谱如图4所示，1H NMR(400MHz,d6-acetone,ppm)δ8.05-8.03(d,J＝7.6Hz,1H),7.86-7.83(m,1H),7.80-7.77(t,J＝7.6Hz,1H),7.54-7.53(d,J＝2.4Hz,1H),7.39-7.38(d,J＝7.6Hz,1H),7.26-7.23(dd,J＝8.8Hz,J＝2.4Hz,1H),7.14-7.12(d,J＝8.8Hz,1H),6.97(s,1H),6.81(s,2H),4.26-4.24(t,J＝4.4Hz,2H),3.86-3.84(t,J＝4.8Hz,2H),3.67-3.65(m,2H),3.61-3.56(m,4H),3.47-3.45(m,2H),3.27(s,3H)。
式(3)所示的化合物的13C NMR图谱如图5所示，13C NMR(100MHz,d6-acetone,ppm)δ169.1,162.1,153.5,152.9,152.7,151.0,136.5,131.4,131.3,130.0,127.2,125.8,124.9,121.4,118.0,113.9,111.9,111.4,102.4,81.9,72.7,71.5,71.3,71.1,70.1,69.0,58.8。
(3)合成结构式如式(2)所示的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮：
Figure BDA0002232598620000081
反应式如式(4)：
Figure BDA0002232598620000082
具体过程为：在双口瓶中加入3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮(610.5mg,1mmol)，联硼酸频那醇酯(380.8mg,1.5mmol)，1,1′-双(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(II)二氯甲烷复合物(81.6mg,0.1mmol)和醋酸钾(294.4mg,3mmol)，抽换气三次后，在氩气保护下加入无水1,4-二氧六环(10mL)。然后，加热至80℃氩气保护下反应过夜，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，产率60％。
式(2)所示的化合物的1H NMR图谱如图6所示，1H NMR(400MHz,d6-acetone,ppm)δ8.03-8.01(d,J＝7.6Hz,1H),7.83-7.79(m,1H),7.77-7.74(m,1H),7.66(s,1H),7.47-7.46(m,1H),7.30-7.28(d,J＝7.2Hz,1H),6.94-6.93(d,J＝2.0Hz,1H),6.91-6.89(d,J＝8.0Hz,1H),6.80-6.78(d,J＝8.8Hz,1H),6.77-6.74(m,1H),4.25-4.22(t,J＝4.8Hz,2H),3.86-3.84(t,J＝4.8Hz,2H),3.67-3.65(m,2H),3.61-3.56(m,4H),3.47-3.45(m,2H),3.27(s,3H),1.35(s,12H)。
式(2)所示的化合物的13C NMR图谱如图7所示，13C NMR(100MHz,d6-acetone,ppm)δ169.4,161.9,154.1,153.1,151.6,136.3,131.0,130.3,129.9,128.3,127.2,125.6,124.8,123.8,123.1,113.3,112.2,102.4,85.1,82.6,72.7,71.5,71.3,71.1,70.2,68.9,58.8,25.2。
(4)合成结构式如式(1)所示的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-硝基-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮：
反应式如式(5)：
Figure BDA0002232598620000091
具体过程为：将3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮(294.2mg,0.5mmol)溶解在四氢呋喃和水的混合液(10mL，v/v＝1:1)中，然后向其中加入高碘酸钠(534.7mg,2.5mmol)，室温搅拌反应2小时后，加入1M的盐酸(20mL)，室温继续搅拌反应5小时，TLC检测原料消失，反应液用乙酸乙酯(20mL)萃取三次，有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂即得到黄色中间体，真空干燥后，加入无水1,4-二氧六环(5mL)和亚硝酸叔丁酯(0.6mL,5mmol)，然后加热至80℃搅拌反应过夜，反应完毕后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物，随后用硅胶色谱柱提纯，得到产物为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-硝基-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，产率20％。
式(1)所示的化合物的1H NMR图谱如图8所示，1H NMR(400MHz,d6-acetone,ppm)δ8.18-8.17(d,J＝2.0Hz,1H),8.07-8.05(d,J＝7.6Hz,1H),7.98-7.95(dd,J＝8.8Hz,J＝2.0Hz,1H),7.87-7.83(m,1H),7.81-7.77(m,1H),7.39-7.37(d,J＝7.6Hz,1H),7.24-7.22(d,J＝8.8Hz,1H),7.01-7.00(d,J＝2.0Hz,1H),6.86-6.83(m,2H),4.27-4.25(t,J＝4.4Hz,2H),3.87-3.85(m,2H),3.67-3.65(m,2H),3.61-3.56(m,4H),3.47-3.45(m,2H),3.27(s,3H)。
式(1)所示的化合物的13C NMR图谱如图9所示，13C NMR(100MHz,d6-acetone,ppm)δ169.1,162.2,153.6,152.7,152.2,150.0,136.6,131.4,130.7,123.0,126.9,126.9,125.9,124.9,119.1,114.1,113.4,111.6,102.5,81.6,72.7,71.5,71.3,71.1,70.2,69.1,58.8。
式(1)所示的化合物的HRMS图谱如图10所示，HRMS(ESI)for C27H26NO9 +([M+H]+):calcd:508.1602,found:508.1595。
上述本实施例制得的硫化氢荧光探针的应用，将PBS,pH＝7.4的缓冲溶液2mL加入比色皿中，加入本实施例制得的硫化氢荧光探针混合均匀后，再加入待测溶液进行测试，该待测溶液中无硫化氢时，所述反应溶液无荧光发射，当加入硫化氢(以硫化钠作为前体)后，所述反应溶液518nm处的荧光明显增强。
上述本实施例制得的硫化氢荧光探针的应用研究：
1、pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物与硫化氢反应前后518nm处荧光强度的影响
取实施例1合成的式(1)所示的化合物溶于二甲基亚砜中，制成2mmol/L的储备液。当pH值不同时，在室温下以480nm为激发光测量式(1)所示的化合物的荧光性质，结果如图11所示。实验结果表明，式(1)所示的化合物518nm处荧光强度在pH值3到11范围内不受影响。而式(1)所示的化合物对硫化氢有响应的pH值介于6.5和10.5之间，pH值7.4和9.5之间响应最明显。
2、式(1)所示的化合物与硫化氢反应的荧光光谱研究
在最佳测试条件下，即10mM PBS,pH＝7.4，研究式(1)所示的化合物与硫化氢反应的荧光光谱性质，结果如图12所示。图12中(a)为式(1)所示的化合物与硫化氢反应的荧光光谱图，(b)为式(1)所示的化合物与硫化氢反应时518nm处荧光强度随时间的变化。
3、式(1)所示的化合物检测硫化氢的灵敏度研究
图13中(a)为式(1)所示的化合物与不同浓度硫化氢(0–100μM)反应的荧光光谱变化，(b)为式(1)所示的化合物518nm处荧光强度随硫化氢浓度的变化。从图13(a)可知，硫化氢浓度越高会使荧光强度变化越大。由图13(b)可以推算出式(1)所示的化合物对硫化氢的检测限为1μM。
4、式(1)所示的化合物对硫化氢的选择性研究
图14为式(1)所示的化合物与各种分析物，包括阴离子如叠氮盐(N3 -)、醋酸盐(AcO-)，活性硫如硫氰酸盐(SCN-)、亚硫酸盐(SO3 2-)、硫代硫酸盐(S2O3 2-)、焦亚硫酸盐(S2O5 2-)，活性氧如过氧化氢(H2O2)、次氯酸(ClO-)、过氧叔丁醇(tBuOOH)、超氧阴离子(O2 -)，活性氮如一氧化氮(NO)、亚硝酸盐(NO2 -)、硝酸盐(NO3 -)，生物硫醇如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、硫辛酸(lipoic acid)和硫化氢(H2S)，反应前后518nm处荧光强度进行研究。结果证明，式(1)所示的化合物对硫化氢的检测具有高度的选择性。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (8)

1.一种硫化氢荧光探针，其特征在于：所述硫化氢荧光探针为3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-硝基-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(1)：
Figure FDA0002232598610000011
2.一种如权利要求1所述的硫化氢荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)荧光素与氢氧化钠反应生产荧光素二钠盐化合物后，再与对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯反应，得到3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(4)：
Figure FDA0002232598610000012
(2)步骤(1)所得的3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺反应，得到3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(3)：
Figure FDA0002232598610000013
(3)步骤(2)所得的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与联硼酸频那醇酯反应，得到3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式如式(2)：
(4)步骤(3)所得的3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮水解后，再与亚硝酸叔丁酯反应，得到式(1)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，荧光素与对甲苯磺酸三缩乙二醇单甲醚酯的摩尔比为1∶5.0～10.0。
4.根据权利要求2所述的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，3'-羟基-6'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺的摩尔比为1∶1.0～2.0。
5.根据权利要求2所述的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(三氟甲磺酰氧基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与联硼酸频那醇酯的摩尔比为1∶1.5～2.0。
6.根据权利要求2所述的硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，3'-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-6'-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧环戊硼烷-2-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-3-酮与亚硝酸叔丁酯的摩尔比为1∶10.0～20.0。
7.一种如权利要求1所述的硫化氢荧光探针或权利要求2～6任一项所述的制备方法制得的硫化氢荧光探针的应用，其特征在于：将所述硫化氢荧光探针与磷酸缓冲盐溶液混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用荧光强度的变化来检测硫化氢的存在与否。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述待测溶液中无硫化氢时，所述反应溶液无荧光发射，当加入硫化氢后，所述反应溶液518nm处的荧光明显增强。
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