CN111393401A - 一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途 - Google Patents
一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途，该荧光探针分子结构如图1所示；本发明还公开了所述基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子的制备方法，以及在检测水体样品或生物细胞内的心肌黄酶中的用途。本发明荧光探针分子合成方法易合成，收率高。
Description
技术领域
本发明属于检测微量物质的有机功能材料，涉及荧光探针分子及制备方法和用途。
背景技术
心肌黄酶(DTD)是一种广泛分布在几乎所有动物的身体组织中的一种细胞质黄素蛋白酶，是一种在大多数健康组织中以低水平存在的解毒酶，但暴露在产生活性氧物质的醌(例如，某些食物中发现的醌，污染物和香烟烟雾)中后经常过量表达。一方面，它利用NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ)作为电子供体，还原各种醌类物质，制止醌类自由基及制止醌类自由基引发生成超氧阴离子O2 -，阻止或减少产生自由基，保护细胞免受损伤，这种影响使其被认为是一种保护酶。另一方面，在许多人类实体癌中过度表达，包括前列腺癌，乳腺癌，结肠癌，胰腺癌和头颈癌。有证据表明心肌黄酶可稳定蛋白质p53，提高缺氧诱导因子1α(HIF1-a)的功效，并增加癌细胞的转移能力。因此心肌黄酶的基础研究和临床诊断具有重大意义。
荧光探针被视为生物科学基础研究、开发新药物及临床诊断的强大工具。但目前有关心肌黄酶的探针研究工作还不多见。
发明内容
发明目的是提供一种灵敏性高、选择性良好的基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子及制备方法和用途。
本发明采用如下技术方案实现：
一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子，该荧光探针分子包括如下结构式：
一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子制备方法，该方法包括以下步骤内容：
步骤(1)：化合物5的制备：冰浴0℃-2℃条件下，圆底烧瓶中加入浓硫酸，将环己酮用滴液漏斗滴加搅拌均匀；2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸分批加入，搅拌；混合物在85℃-95℃加热回流2小时(优选的90℃)，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，加入70％高氯酸；待析出沉淀后抽滤，用水洗涤滤饼，干燥后得黑色固体：化合物5；
步骤(2)：化合物4的制备：将步骤(1)所述化合物5溶解于冰乙酸中，加入4-羟基苯甲醛，氮气保护下85℃-95℃加热回流过夜(优选的90℃)，除去溶剂，得紫色固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂A分离提纯得到化合物4；
步骤(3)：化合物2的制备：将三甲基氢醌和3,3-二甲基丙烯酸加入到甲基磺酸中，于75℃-85℃下搅拌反应3小时(优选的80℃)，冷却后加入冰水搅拌，萃取混合物，合并有机相，蒸干溶剂，重结晶黄色粗产品，得到纯净的白色晶体为化合物2；
步骤(4)：化合物3的制备：将步骤(3)所述化合物2加入到水和乙腈的混合液中，搅拌使其溶解，再加入N-溴代琥珀酰亚胺，搅拌30分钟后，蒸干溶剂中的乙腈，剩余的液体用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸馏去掉溶剂，得到的黄色固体为化合物3；
步骤(5)：化合物1：基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子的制备：将步骤(4)所述的化合物3、步骤(2)所述的化合物4和4-二甲氨基吡啶溶于无水二氯甲烷中，室温反应1小时后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，反应过夜；除去溶剂，得紫色固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂B分离提纯，得到基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子。
进一步为，本发明该方法步骤(2)所述洗脱剂A为甲醇与二氯甲烷的混合物，其体积比为1:100；步骤(5)所述洗脱剂B为甲醇与二氯甲烷的混合物，其体积比为1:50。
进一步为，本发明该方法步骤(1)所述所述环己酮和2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸的摩尔比为1.5-2:1(优选的2:1)。
进一步为，本发明该方法步骤(2)所述所述化合物5、4-羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.5-2(优选的1:1.5)；
进一步为，本发明该方法步骤(3)所述所述三甲基氢醌和3,3-二甲基丙烯酸的摩尔比为1:1-1.5(优选的1:1)；
进一步为，本发明该方法步骤(4)所述化合物2与N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.05-1.2(优选的1:1.05)。
进一步为，本发明该方法步骤(5)所述所述化合物3与化合物4、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1:0.5-1:1.5-2(优选的1:1:0.5:1.5)。
基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子制备方法的中间产物，本发明所述的中间产物为上述任一方法中制备的化合物2或化合物3或化合物4或化合物5。
基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子的应用，该应用为在检测水体样品或生物细胞内的心肌黄酶中的用途。
本发明的有益效果是：
1、本发明荧光探针分子能提供与特定的生物酶——心肌黄酶相结合的分子，使心肌黄酶还原探针结构中的对苯二醌基团，释放出荧光团罗丹明衍生物，改变探针分子的荧光，从而选择性识别和检测液相体系中的心肌黄酶。该探针分子结构清晰、荧光团光性质稳定、选择性好、对其它常见氨基酸类、金属离子和活性氧自由基具有抗干扰性(图6)。
2、本发明荧光探针分子合成方法为5个步骤，易合成，收率高。
3、本发明荧光探针分子能够检测一定比例水溶液中的心肌黄酶以及荧光成像细胞内的心肌黄酶，与心肌黄酶反应前后，其荧光强度在一定水溶液、细胞中增长约3倍，灵敏度高。
4、本发明荧光探针分子穿透细胞的渗透性好，对癌细胞本身毒副作用大(图9)，可以实现细胞内心肌黄酶的荧光检测。
5、本发明荧光探针分子的荧光团发光范围为近红外，发射波长为630nm。
6、本发明荧光探针分子物理化学性质稳定性好。
基于以上优势，该荧光探针分子可作为一种生物科学基础研究、开发新药物及临床诊断的工具，应用前景良好。
附图说明
图1为本发明荧光探针分子的合成路线。
图2为本发明荧光探针分子的1H-NMR谱图。
图3为本发明荧光探针分子的13C-NMR谱图。
图4为本发明荧光探针分子的HRMS(ESI)谱图。
图5为本发明荧光探针分子在一定水溶液体系中对心肌黄酶响应荧光光谱变化图。
图6为本发明荧光探针分子在一定水溶液体系中对不同氨基酸、金属离子和活性氧自由基在630nm处荧光光谱变化图。
图7为本发明荧光探针分子在一定水溶液体系中对不同浓度心肌黄酶荧光光谱变化图。
图8为本发明荧光探针分子在630nm处荧光强度与相对应心肌黄酶浓度拟合曲线图。
图9为本发明荧光探针分子在白血病细胞HL-60、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MCF-7和结肠癌细胞SW480中的毒性试验图。
图10为本发明荧光探针分子在细胞内对外源性心肌黄酶荧光识别图。其中，a,e,i,m为明场；b,f,j,n为DAPI通道；c为只加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物的荧光图片；g为先加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物哺育1小时再加入1.8U/mL的心肌黄酶再哺育1小时的荧光图片；k为先加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物哺育1小时再加入3.6U/mL的心肌黄酶再哺育1小时的荧光图片；o为先加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物哺育1小时再加入7.2U/mL的心肌黄酶再哺育1小时的荧光图片；d,h,l,p为叠加通道。其中，图10中第2列背景为黑色，荧光样为蓝色(原始)；第3列背景为黑色，荧光样为红色(原始)；第4列背景为黑色，荧光样为蓝红混合(原始)。
图11为本发明荧光探针分子在细胞内对内源性心肌黄酶荧光识别图。其中，a,e,i,m为明场；b,f,j,n为DAPI通道；c为只加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物的荧光图片；g为先加入0.4mg/L谷胱甘肽乙酯低氧哺育2小时后再加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物哺育1小时的荧光图片；k为先加入0.8mg/L谷胱甘肽乙酯低氧哺育2小时后再加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物哺育1小时的荧光图片；o为先加入1.2mg/L谷胱甘肽乙酯低氧哺育2小时后再加入5×10-5mol/L的NADH和2.0×10-5mol/L的探针化合物哺育1小时的荧光图片；d,h,l,p为叠加通道。其中，图11中第2列背景为黑色，荧光样为蓝色(原始)；第3列背景为黑色，荧光样为红色(原始)；第4列背景为黑色，荧光样为蓝红混合(原始)。
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例包括但不限制本发明的保护范围。
具体实施方式
实施例1：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子的合成
具体合成路线见图1。
(1)化合物5的制备：冰浴条件下，圆底烧瓶中加入14mL浓硫酸，将环己酮(12.74mmol，1.32mL)用滴液漏斗滴加搅拌均匀。2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸(6.4mmol，2.0g)分批加入，搅拌。混合物在90℃加热回流2小时，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，加入70％高氯酸1.4mL。待析出沉淀后抽滤，用水洗涤滤饼，干燥后得黑色固体化合物5，产率为90％。
(2)化合物4的制备：将化合物5(1.72g，3.6mmol)溶解于冰乙酸中，加入4-羟基苯甲醛(0.53g，4.32mmol)，氮气保护下90℃加热回流过夜，除去溶剂，得紫色固体混合物，经经硅胶层析柱用甲醇：二氯甲烷体积比为1:50洗脱剂分离提纯得到紫色化合物4，产率50.6％。
(3)化合物2的制备：将三甲基氢醌1.52g(10mmol)和3,3-二甲基丙烯酸1g(10mmol)加入到甲基磺酸中，于80℃下搅拌反应3小时，冷却后将反应液加入到50mL的冰水中搅拌，得到的混合物用分别用50mL的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液、水洗涤，再次合并有机相，蒸干溶剂。得到的黄色粗产品用乙酸乙酯：正己烷＝1:2进行重结晶，得到纯净的白色晶体为化合物2，产率为75％。
(4)化合物3的制备：称取化合物2共1.58g(6.74mmol)，加入15mL的水和3mL的乙腈，搅拌使晶体溶解，再加入1.26g(7.08mmol)的NBS，在室温下搅拌30分钟。反应结束后，蒸干溶剂中的乙腈，剩余的液体分别用30mL的二氯甲烷萃取3次。合并有机相，无水硫酸钠干燥，再次减压蒸馏掉溶剂，得到的1.65g黄色固体为化合物3，产率98％。
(5)罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子1的合成：0.24g(0.5mmol)的化合物4，0.125g(0.5mmol)的化合物3，0.03g(0.25mmol)的DMAP用10mL的无水二氯甲烷溶解，搅拌1小时后加入0.145g(0.75mmol)的EDC，在室温、氮气保护下过夜。反应结束后，反应液用去离子水洗三次，合并有机相，旋干溶剂。得到的粗产物过硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100：1，得到紫色的目标化合物1共80mg，产率为22.5％。相关谱图见图2～4。其中，CDCl3为氘代三氯甲烷。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.199(d,J＝8Hz,1H),7.93(s,1H),7.90(d,J＝7.2Hz,1H),7.05(t,J＝7.6Hz,1H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.06(d,J＝8.8Hz,1H),6.99(d,J＝1.6Hz,1H),6.93(d,J＝9.2Hz,1H),6.86(q,J＝9.6Hz,1H),6.76(d,J＝6Hz,6H),3.61(q,4H),3.26(s,2H),3.14(s,4H),2.81(t,2H),2.18(s,6H),1.95(d,J＝7.6Hz,6H),1.53(s,6H),1.30(t,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)190.83,187.43,171.18,168.33,158.63,157.45,154.67,151.76,150.75,142.86,139.36,138.82,138.69,137.68,133.93,133.55,132.84,130.76,130.47,129.99,128.90,127.37,121.72,120.13,116.15,115.36,107.09,96.27,47.67,45.95,40.08,38.47,29.00,26.90,25.29,21.53,14.39,12.69,12.64,12.15.HEMS(ESI):calcd for C45H46NO7 +[M]+＝712.3269,found m/z 712.3269。
实施例2：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子对心肌黄酶荧光检测的选择性
采用CH3OH(甲醇)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将本发明荧光探针分子用CH3OH:PBS＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为2×10-5mol/L的溶液。
将样品瓶分为17组，每组样品瓶分别加入5mL浓度为2×10-5mol/L的本发明荧光探针分子的CH3OH:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它16组分别加入50μL浓度为0.01mol/L的Co2+,Ni2+,Fe3+,K+,Pb2+,HSO3 -,NO3 -,H2O2,H2S,ClO-,Cys,Hcy,Ala,Cys,NADH,DTD。待测液配制好后，马上转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为570nm，发射波长为630nm。本发明荧光探针分子对心肌黄酶荧光选择性检测如图6所示。可见本发明荧光探针分子在630nm处仅对心肌黄酶有明显的荧光增强现象(约3倍增强)，表明本发明荧光探针分子对心肌黄酶表现出一定的荧光选择性。
实施例3：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子对心肌黄酶的荧光滴定
采用CH3OH(甲醇)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将本发明荧光探针分子用DMSO:PBS＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到1000mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为2×10-5mol/L的溶液。
3mg心肌黄酶(DTD)，用100μL的去离子水溶解，配制成浓度为900U/mL的心肌黄酶水溶液。
将样品瓶分为21组，每组样品瓶分别加入0μL-40μL浓度为900U/mL的心肌黄酶水溶液，再使用浓度为2×10-5mol/L的本发明荧光探针分子的CH3OH:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液定容至5mL，再使测试体系中心肌黄酶浓度为0U/mL～7.2U/mL。待测液配制好后，转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为10×10nm。图7为本发明荧光探针分子在水溶液体系中随心肌黄酶浓度变化的荧光光谱图。表明随着心肌黄酶的不断加入，荧光强度不断增加，当酶的浓度为7.2U/mL达到饱和。
实施例4：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子对心肌黄酶的定量荧光检测
采用CH3OH(甲醇)：PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将本发明荧光探针分子用DMSO:PBS＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到400mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为5×10-6mol/L的溶液。
3mg心肌黄酶(DTD)，用100μL的去离子水溶解，配制成浓度为900U/mL的心肌黄酶水溶液。
将样品瓶分为10组，每组样品瓶分别加入0μL～20μL浓度为900U/mL的心肌黄酶水溶液，再使用浓度为2×10-6mol/L的本发明荧光探针分子的CH3OH:PBS(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液定容至5mL，再使测试体系中心肌黄酶浓度为0U/mL～4U/mL。待测液配制好后，转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为10×10nm。将荧光光谱630nm处的荧光强度与相应心肌黄酶浓度进行拟合，在心肌黄酶浓度为0U/mL～4U/mL范围内得到一拟合曲线(图8)，表明本发明荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测心肌黄酶浓度。
实施例5：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子的细胞毒性试验
将白血病细胞(HL-60)、肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、乳腺癌细胞(MCF-7)和结肠癌细胞(SW480)接种到96孔板，加入用DMSO溶解的40μM的待测荧光探针分子溶液进行筛选，设置3个平行组，孵育48小时后，测定光吸收值，在492nm波长下，用多功能酶标仪读取各孔光吸收值，每组实验中顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)作为阳性化合物，最后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法计算化合物的IC50值。
我们用待测荧光探针分子溶液浓度为40μM处各种细胞的IC50值做了一个柱形图(图9)，图9可以直观地看出探针对癌细胞本身的毒性较大。
实施例6：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子在细胞内对外源性心肌黄酶的荧光识别
取四皿培养皿Hela细胞，将培养皿中的Hela细胞用PBS缓冲液(每升缓冲液中含有2.90克Na2HPO4·12H2O；0.30克NaH2PO4·2H2O)清洗三次，以除去培养液。再向这四皿培养皿Hela细胞中加入1mL PBS溶液，然后向Hela细胞中分别加入10μL 0.5mmol/L细胞核染色剂DAPI后孵育半小时。Hela细胞用PBS缓冲液洗涤3次，之后向培养皿中加入浓度为0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10μL，并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1小时。Hela细胞再次用PBS溶液洗涤3次后，分别加入浓度为900U/mL的心肌黄酶溶液0μL、10μL、20μL、40μL后继续孵育1小时，然后放置在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图10。图10c中可以看到本发明荧光探针分子自身在细胞质内有少量的荧光发射，当心肌黄酶浓度达到7.2U/mL时，细胞内发射出强烈的荧光(图10o)。该实验表明本发明荧光探针分子可以在细胞内对外源性的心肌黄酶进行荧光识别。实验所用仪器为OlympusFV-10i激光共聚焦显微镜。
实施例7：基于罗丹明衍生物的心肌黄酶检测荧光探针分子在细胞内对内源性心肌黄酶的荧光识别
取四皿培养皿Hela细胞，将培养皿中的Hela细胞用PBS缓冲液(每升缓冲液中含有2.90克Na2HPO4·12H2O；0.30克NaH2PO4·2H2O)清洗三次，以除去培养液。再向这四皿培养皿Hela细胞中加入1mL PBS溶液，然后向Hela细胞中分别加入10μL 0.5mmol/L细胞核染色剂DAPI后孵育半小时。Hela细胞用PBS缓冲液洗涤3次，之后向培养皿中分别加入浓度为10mg/mL的谷胱甘肽乙酯溶液0μL、40μL、80μL、120μL后继续低氧孵育2小时。Hela细胞再次用PBS溶液洗涤3次后，加入浓度为0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10μL，并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1小时，然后放置在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图11。图11c中可以看到本发明荧光探针分子自身在细胞质内有少量的荧光发射，当谷胱甘肽乙酯浓度达到120mg/mL时，细胞内发射出强烈的荧光(图11o)。该实验表明本发明荧光探针分子可以在细胞内对内源性的心肌黄酶进行荧光识别。实验所用仪器为OlympusFV-10i激光共聚焦显微镜。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明的配方属于数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子，其特征在于，该荧光探针分子包括如下结构式：
2.一种制备权利要求1所述荧光探针分子的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤内容：
步骤(1)：化合物5的制备：冰浴0℃-2℃条件下，圆底烧瓶中加入浓硫酸，将环己酮用滴液漏斗滴加搅拌均匀；2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸分批加入，搅拌；混合物在85℃-95℃加热回流2小时，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，加入70％高氯酸；待析出沉淀后抽滤，用水洗涤滤饼，干燥后得黑色固体：化合物5；
步骤(2)：化合物4的制备：将步骤(1)所述化合物5溶解于冰乙酸中，加入4-羟基苯甲醛，氮气保护下85℃-95℃加热回流过夜，除去溶剂，得紫色固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂A分离提纯得到化合物4；
步骤(3)：化合物2的制备：将三甲基氢醌和3,3-二甲基丙烯酸加入到甲基磺酸中，于75℃-85℃下搅拌反应3小时，冷却后加入冰水搅拌，萃取混合物，合并有机相，蒸干溶剂，重结晶黄色粗产品，得到纯净的白色晶体为化合物2；
步骤(4)：化合物3的制备：将步骤(3)所述化合物2加入到水和乙腈的混合液中，搅拌使其溶解，再加入N-溴代琥珀酰亚胺，搅拌30分钟后，蒸干溶剂中的乙腈，剩余的液体用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸馏去掉溶剂，得到的黄色固体为化合物3；
步骤(5)：化合物1：基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子的制备：将步骤(4)所述的化合物3、步骤(2)所述的化合物4和4-二甲氨基吡啶溶于无水二氯甲烷中，室温反应1小时后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，反应过夜；除去溶剂，得紫色固体混合物，经硅胶层析柱用洗脱剂B分离提纯，得到基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法步骤(2)所述洗脱剂A为甲醇与二氯甲烷的混合物，其体积比为1:100；步骤(5)所述洗脱剂B为甲醇与二氯甲烷的混合物，其体积比为1:50。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法步骤(1)所述所述环己酮和2-(4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸的摩尔比为1.5-2:1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法步骤(2)所述所述化合物5、4-羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.5-2。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法步骤(3)所述所述三甲基氢醌和3,3-二甲基丙烯酸的摩尔比为1:1-1.5。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法步骤(4)所述化合物2与N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.05-1.2。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法步骤(5)所述所述化合物3与化合物4、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1:0.5-1:1.5-2。
9.基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子制备方法的中间产物，其特征在于，所述的中间产物为权利要求2-8任一所述方法中制备的化合物2或化合物3或化合物4或化合物5。
10.基于罗丹明衍生物检测心肌黄酶的荧光探针分子的应用，其特征在于：该应用为在检测水体样品或生物细胞内的心肌黄酶中的用途。
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