CN104877670A - 一种基于罗丹明衍生物的atp荧光探针的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的制备方法和应用，该ATP荧光探针的结构式为：本发明提供了一种结构简单的基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的制备方法，这是第一个用无背景干扰的罗丹明内酰胺衍生物实现对生物相关阴离子ATP检测的荧光探针。在这个体系中，ATP诱导罗丹明内酰胺结构开环，产生强烈荧光，当加入20当量的ATP时，荧光强度增强47倍，表现出很高的灵敏度。并且，该荧光探针对ATP表现出很好的选择性，不受其他磷酸根离子(如ADP，AMP，PO₄ ^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO^4-，P₂O₇ ^4-和P₃O₁₀ ^5-)的干扰。此外，该探针还可以应用于检测与ATP相关的蛋白激酶的活性。

Description

一种基于罗丹明衍生物的 ATP 荧光探针的制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的制备方法和应用。

背景技术

罗丹明是一个构造荧光增强型探针分子的理想染料(文献1：X. Chen, T. Pradhan, F. Wang, J.S. Kim, J. Yoon, Chem. Rev. 2012, 112: 1910-1956；文献2：H.N. Kim, M.H. Lee, H.J. Kim, J.S. Kim, J. Yoon, Chem. Soc. Rev., 2008, 37: 1465-1472.)，近年来，既有颜色改变又有很好的荧光响应的罗丹明荧光探针的发展引起了广泛关注。正如我们所知，罗丹明内酰胺衍生物本身是无色和无荧光的，而诱导内酰胺结构开环后，将会呈现粉红色和强烈的荧光发射。到目前为止，已发展了大量基于罗丹明衍生物的荧光探针用于阳离子的检测，这些阳离子包括Cu²⁺ (文献1：J.F. Zhang, Y. Zhou, J. Yoon, Y. Kim, S.J. Kim, J.S. Kim, Org. Lett., 2010, 12: 3852-3855；文献2：Y. Zhao, X-B Zhang, Z-X Han, L. Qiao, C-Y Li, L-X Jian, G-L Shen, R-Q Yu, Anal. Chem., 2009, 81: 7022-7030)，Hg²⁺（文献1：J. Du, J. Fan, X. Peng, P. Sun, J. Wang, H. Li, S. Sun, Org. Lett., 2010, 12: 476-479；文献2: W. Lin, X. Cao, Y. Ding, L. Yuan, L. Long, Chem. Commun., 2010, 46: 3529-3531；文献3：X. Zhang, Y. Xiao, X. Qian, Angew. Chem., Int. Ed., 2008, 47: 8025-8029），Zn²⁺（文献1：S.H. Mashraqui, T. Khan, S. Sundaram, R. Betkar and M. Chandiramani, Chem. Lett. 2009, 38: 730-731；文献2：Z.-X. Han, X.-B. Zhang, Z. Li, Y.-J. Gong, X.-Y. Wu, Z. Jin, C.-M. He, L.-X. Jian, J. Zhang, G.-L. Shen and R.-Q. Yu, Anal. Chem. 2010, 82: 3108-3113.），Fe³⁺ (文献1：Y. Xiang and A. Tong, Org. Lett. 2006, 8: 1549-1552；文献2：M.H. Lee, T.V. Giap, S.H. Kim, Y.H. Lee, C. Kang and J.S. Kim, Chem. Commun. 2010, 46: 1407-1409.)，Pb²⁺ (文献1：J.Y. Kwon, Y.J. Jang, Y.J. Lee, K.M. Kim, M.S. Seo, W. Nam and J. Yoon, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127: 10107-10111.)，Cr³⁺ (文献1：K. Huang, H. Yang, Z. Zhou, M. Yu, F. Li, X. Gao, T. Yi and C. Huang, Org. Lett. 2008, 10: 2557-2560.文献2：Z. Zhou, M. Yu, H. Yang, K. Huang, F. Li, T. Yi and C. Huang, Chem. Commun. 2008, 3387–3389.)，Ag⁺ (文献1：A. Chatterjee, M. Santra, N. Won, S. Kim, J.K. Kim, S.B. Kim, K.H. Ahn, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131: 2040-2041.)，Au⁺/Au³⁺ (文献1：M.J. Jou, X. Chen, K.M.K. Swamy, H.N. Kim, H-J. Kim, S. Lee, J. Yoon, Chem. Commun., 2009, 46: 7218-7220;文献2：O.A. Egorova, H. Seo, A. Chatterjee, K.H. Ahn, Org. Lett., 2010, 12: 401-403.)和 Pd²⁺(文献1：M.E. Jun, K.H. Ahn, Org. Lett., 2010, 12: 2790-2793.)。然而，检测阴离子的荧光探针却非常少，而且主要集中在一些常规阴离子，如CN^- (文献1：X. Lou, L. Qiang, J. Qin, Z. Li, Appl. Mater. Interfaces, 2009, 1: 2529-2535.)， P₂O₇ ^4- (文献1：C.R. Lohani, J. Kim, S. Chung, J. Yoon, K. Lee,Analyst, 2010, 135: 2079-2084.)和 CH₃COO^- (文献1：J. Wu, H.J. Kim, M.H. Lee, J.H. Yoon, J.H. Lee, J.S. Kim, Tetrahedron Lett., 2007, 48: 3159-3162; 文献2：Z. Hu, X. Wang, Y. Feng, L. Ding, M. Li, C. Lin, Chem. Commun., 2011, 47: 1622-1624.)。

在许多生物进程中，ATP作为生物阴离子扮演着关键性的角色，因此，ATP的选择性检测变得尤为重要，已经变成目前研究的重要课题。近几十年来，针对ATP检测的荧光探针多是基于蒽（文献1：H.N. Kim, J.H. Moon, S.K. Kim, J.Y. Kwon, Y.J. Jang, J.Y. Lee and J. Yoon, J. Org. Chem. 2011, 76: 3805-3811；文献2：X. Huang, Y. Lu, Y. He and Z. Chen，Eur. J. Org. Chem. 2010, 1921-1927.)、氧杂蒽（文献1：A. Ojida, I. Takashima, T. Kohira, H. Nonaka and I. Hamachi, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130: 12095-12101；文献2：Y. Kurishita, T. Kohira, A. Ojida and I. Hamachi, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132: 13290-13299.）、萘酐（文献1：A.J. Moro, P.J. Cywinski, S. Korsten and G.J. Mohr, Chem. Commun. 2010, 46: 1085-1087.）、芘（文献1：Z. Xu, N.J. Singh, J. Lim; J. Pan, H.N. Kim, S. Park, K.S. Kim, J. Yoon, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131: 15528-15533）、聚二乙炔（文献1：H. Jeon, S. Lee, Y. Li, S. Park and J. Yoon, J. Mater. Chem. 2012, 22: 3795-3799）、苝酰亚胺（文献：L. Yan, Z. Ye, C. Peng and S. Zhang, Tetrahedron 2012, 68: 2725-2727.）和1-（6-二甲胺基萘-2-基）乙酮（文献1：A.S. Rao, D. Kim, H. Nam, H. Jo, K.H. Kim, C. Ban, K.H. Ahn, Chem. Commun., 2012, 48: 3206-3208）等荧光染料。然而，基于这些染料的荧光探针大多表现出灵敏度不高，或者不能排除ATP类似物（如ADP、AMP）的干扰。一个有效提高灵敏度的方法是降低背景信号，所以无背景干扰的罗丹明内酰胺衍生物是理想的荧光基团，已被广泛运用于荧光探针的研究。然而，据我们所知，到目前为止，还未发现基于罗丹明内酰胺衍生物的荧光探针用于ATP的检测。由此可见，发明一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针具有非常重要的意义。

罗丹明衍生物用作检测ATP的一个荧光分子探针。在这个传感体系中，ATP诱导罗丹明内酰胺结构高效开环产生强烈的荧光，这有利于提高荧光探针的灵敏度。尤其是，该荧光探针对ATP表现出很好的选择性，不受其他磷酸根离子的干扰。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种高灵敏度，高选择性的基于罗丹明衍生物结构新颖的ATP荧光探针。

本发明的技术方案是，一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针，其结构式如下：

。

一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的制备方法。步骤如下：在含有40～60 mL无水乙醇的100 mL圆底烧瓶中加入罗丹明B，完全溶解后溶液呈现紫红色，搅拌下逐滴加入二乙烯三胺到上述反应体系中，罗丹明B和二乙烯三胺的摩尔比为1:20～1:24，在磁力搅拌下，60～80 ℃下回流20～28 h，反应完全后，室温下冷却，经过减压蒸馏除去部分溶剂进行浓缩，然后向浓缩液中加入10～30 mL蒸馏水，用20～50 mL二氯甲烷萃取两次，合并有机相，用旋转蒸发仪去除溶剂，用体积比为12:1～5:1的二氯甲烷和乙醇的混合液为淋洗剂，硅胶柱色谱分离提纯，得到ATP荧光探针。

一种基于罗丹明衍生物的荧光探针的性能研究。首先，研究了该探针的荧光光谱性质，加入ATP之前，荧光探针没有荧光发射峰，说明探针分子处于内酰胺闭环结构；随着ATP的加入，在580 nm处出现了罗丹明的最大发射峰，并且随着ATP浓度的增大，探针分子的荧光强度不断增强，当加入20当量的ATP时，荧光强度增强47倍，说明该探针可以高灵敏的对生物相关阴离子ATP进行检测。其次，还研究了探针的紫外吸收光谱，在没有加入ATP时，探针在560 nm处没有吸收带，加入ATP之后，在560 nm处出现吸收峰，并且随着ATP浓度增加，吸收峰强度增强，同时伴随着溶液从无色变成粉红色。接着，研究了探针的选择性，检测了探针与ATP，磷酸盐（ADP, AMP, PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^-, P₂O₇ ^4-和P₃O₁₀ ^5-）和常见阴离子（SO4^2-, NO^3-, CO₃ ^2-, AcO^-和citrate）的荧光响应情况。加入其他的阴离子，荧光强度都没有明显的改变，就连与ATP结构极为相似的ADP，荧光也没有变化；而相同的条件下加入ATP，在580 nm处出现一个很强的荧光发射峰，由此可见，荧光探针对ATP有较好的选择性。最后，研究了pH值对荧光探针测定ATP的影响和荧光探针对ATP的响应时间，当pH值在6.0到8.0之间时，不影响荧光探针对ATP的测定，该荧光探针响应迅速，响应时间在2分钟以内。

一种基于罗丹明衍生物的荧光探针的应用，将该荧光探针应用于检测与ATP相关的蛋白激酶的活性。蛋白激酶A能催化其特殊底物肯普肽发生磷酸化，在这个过程中需要消耗等量的ATP，通过检测磷酸化反应后剩余的ATP的量来定量蛋白激酶A的活性。

附图说明

图1为ATP荧光探针的合成路线。

图2为ATP荧光探针与不同浓度的ATP作用后的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。ATP荧光探针的浓度均为10 µM，ATP浓度分别为：0，0.10，0.20，0.50，2.00，5.00，20.0，50.0，100.0，200.0 µM。荧光激发波长为520 nm。插图为探针对ATP浓度的线性响应图。

图3为ATP荧光探针与不同浓度的ATP作用后的紫外可见吸收光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为吸光度。ATP荧光探针的浓度均为10 μM，ATP浓度分别为：0，2.0，5.0，20.0，50.0，100.0，200.0 µM。

图4为ATP荧光探针的选择性图。加入的阴离子（从左到右）分别是：（a）ATP；（b）ADP；（c）AMP；（d）PO₄ ^3-；（e）HPO₄ ^2-；（f）H₂PO₄ ^-；（g）P₂O₇ ^4-；（h）P₃O₁₀ ^5-；（i）SO₄ ^2-；（j）NO₃ ^-；（k）CO₃ ^2-；（l）AcO^-；（m）citrate。

图5为pH对ATP荧光探针的影响图。

图6为荧光探针在不同ATP浓度下（0.02，0.2，0.5，1.0 µM），荧光强度随时间变化的关系曲线图。

图7为在浓度为10 µM 的ATP荧光探针中加入不同的阴离子（100 µM）后颜色（上）及荧光（下）的改变图。其中Mx是SO₄ ^2-，NO₃ ^-，CO₃ ^2-，AcO^- 和citrate的混合溶液。

图8为蛋白激酶（250 nM）催化有机磷酸化反应的实时荧光监测图。蛋白激酶加入后，每隔10分钟测一次荧光光谱。

图9为加入不同浓度的蛋白激酶(50，100，150，200，250 nM)后探针的实时荧光图，图中箭头表示蛋白激酶的加入点。

图10为荧光强度的变化值与蛋白激酶浓度的线性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

ATP荧光探针的合成

在含有50 mL无水乙醇的100 mL圆底烧瓶中加入罗丹明B（2.0 g，4.2 mmol），完全溶解后溶液呈现紫红色，搅拌下逐滴滴加二乙烯三胺（10 mL，92 mmol）到上述反应体系中，在磁力搅拌，80 ℃下回流24 h。当反应液由紫红色逐渐变为黄褐色时，薄层色谱法（TLC）检测反应进程，反应完全后，室温下冷却，经过减压蒸馏除去部分溶剂进行浓缩，然后向浓缩液中加入20 mL的蒸馏水，用30 mL的二氯甲烷萃取两次，合并有机相，用旋转蒸发仪去除溶剂，粗产品用体积比为10:1的二氯甲烷和乙醇的混合液为淋洗剂，柱层析色谱分离提纯得粉色固体产物0.15 g，产率为6.4 %。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.08 (m, 1H), 6.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.36 (s, 2H), 6.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.35-3.18 (m, 10H), 2.71 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 8.0 Hz, 12H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 167.9, 153.6, 153.3, 148.7, 132.2, 131.3, 129.0, 128.9, 128.0, 127.9, 123.7, 122.7, 108.1, 105.7, 97.9, 64.9, 51.7, 51.3, 50.5, 39.2, 29.7, 12.6. MS (TOF) m/z 528.3. Anal. calcd. for C₃₂H₄₁N₅O₂: C, 72.83; H, 7.83; N, 13.27. Found: C, 72.88; H, 7.82; N, 13.25. 结果表明，所得产物结构正确。

实施例2：

荧光探针与ATP作用的溶液配制

将一定量的荧光探针溶解在H₂O/EtOH （10:1，v/v）的混合溶液中，得到浓度为1.0×10^-4 mol∙L^-1 探针的备用溶液。将一定量的ATP溶解在水中，倒入500 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度线，得到浓度为1.0×10^-2 mol∙L^-1的ATP。将1.0×10^-2 mol∙L^-1的ATP水溶液用二次蒸馏水逐渐稀释得到1.0×10^-3-1.0×10^-8 mol∙L^-1的ATP水溶液。将1.0 mL 探针的备用溶液和1.0 mL的ATP水溶液加入到10 mL的容量瓶中，用缓冲溶液定容后，得到浓度为1.0×10^-5 mol∙L^-1 的荧光探针和1.0×10^-3-1.0×10^-8 mol∙L^-1的ATP混合待测溶液。

实施例3：

荧光探针与ATP作用的荧光光谱性质的测定

用pH值为7.0的缓冲溶液为溶剂测定了荧光探针与ATP作用的荧光光谱，结果如图2。荧光探针的浓度为10 µM，ATP的浓度依次为0，0.10，0.20，0.50，2.00，5.00，20.0，50.0，100.0，200.0 µM，激发波长固定为520 nm，发射波长范围为530~650 nm，狭缝宽度为10 nm/10 nm。从图2可以看出，加入ATP之前，荧光探针没有荧光发射峰，说明探针分子处于内酰胺闭环结构。随着ATP的加入，在580 nm处出现了罗丹明的发射峰，并且随着ATP浓度的增大，探针分子的荧光强度不断增强，当加入200.0 µM的ATP时，荧光强度增强至未加入ATP时的47倍。如图2的插图所示，荧光强度跟ATP的浓度呈现线性关系，线性范围是1.0×10^{− 7}~2.0×10^{− 4} M，检测限是2.5×10^-8 M。所用的荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 55荧光分光光度计。

实施例4：

荧光探针与ATP作用的紫外可见吸收光谱性质的测定

图3为荧光探针与不同浓度的ATP作用后的紫外可见吸收光谱图，ATP的加入量依次为0，2.0，5.0，20.0，50.0，100.0，200.0 µM。从图3中可以看出，没有加入ATP时，探针在560 nm处没有吸收峰，加入ATP之后，在该处出现吸收峰，并且随着ATP浓度增加，吸收峰强度增强，同时伴随着溶液从无色变成粉红色。这是因为探针分子的结构发生了变化，结构从罗丹明的闭环形式转变为开环形式。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为Perkin Elmer Lambda 25型紫外可见分光光度计。

实施例5：

荧光探针对ATP测定的选择性

在浓度为10 µM的荧光探针溶液中加入其他常见阴离子（200 µM）前后的荧光强度变化。从图4中可以看出，加入其他的阴离子，荧光强度都没有明显的改变，就连与ATP结构极为相似的ADP，荧光也没有变化；而相同的条件下加入ATP，在580 nm处出现一个很强的荧光发射峰。这些结果表明，荧光探针对ATP有较好的选择性。

实施例6：

溶液pH值对荧光探针测定ATP的荧光性质的影响

我们考察了pH值对荧光探针测定ATP的荧光强度的影响。我们研究的pH范围为2.0~10.0，荧光探针的浓度为10 µM，ATP的浓度为100 µM。实验结果如图5所示，当pH ＜ 6，荧光探针随着pH的降低荧光强度增大，这是因为在酸性条件下，探针发生质子化，使得罗丹明处于开环结构；当pH ＞ 6，由于罗丹明处于闭环结构，随着pH的变化，荧光强度基本不变。然而，加入ATP之后，在pH ＜ 8，荧光强度基本不变，这是因为在酸性条件下的质子化或与ATP的结合作用，都能使得罗丹明处于开环结构。综上所述，当pH值在6.0到8.0之间时，不影响荧光探针对ATP的测定，这非常有利于该探针用于实际样品中ATP的测定。

实施例7：

荧光探针与ATP作用的响应时间的测定

为了研究荧光探针对ATP的响应时间，我们考察了荧光探针在不同ATP浓度下（0.02，0.2，0.5，1.0 µM）的荧光光谱的变化情况，其结果如图6。从图中可以看出，该探针对ATP的响应时间不到2分钟，满足在实际样品中进行实时监测时对响应时间的要求。从图6我们还可以看出，荧光强度一旦达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，会出现一个平台，这表明此荧光探针光稳定性好。

实施例8：

荧光探针加入不同阴离子后颜色（上）和荧光（下）的变化

图7（上）为在荧光探针溶液中加入不同阴离子后在日光灯下的照片；图7（下）为在荧光探针溶液中加入不同阴离子后在365 nm紫外光照射下的照片。从图7可以看出，加入其他的阴离子，既无荧光改变也无颜色改变；而相同的条件下加入ATP，荧光探针的溶液有很强烈的红色荧光，并伴随明显的颜色变化，溶液从无色变成粉红色。

实施例9：

荧光探针的实际应用

蛋白激酶A能催化其特殊底物肯普肽（Leu-Arg-Arg-Ser-Leu-Gly, kemptide）的Ser残基磷酸化，在这个过程中需要消耗等量的ATP，通过检测磷酸化反应后剩余的ATP的量来定量蛋白激酶A的活性。图8为探针的荧光发射峰强度随着磷酸化反应时间的变化而变化的荧光图，从图中可以看出，探针的荧光强度随着磷酸化反应时间的增加而减弱，这是因为肯普肽的磷酸化反应要消耗ATP。图9是不同浓度的蛋白激酶A消耗ATP的过程中体系的实时荧光图，可见随着蛋白激酶A浓度增加，消耗的ATP增多，体系中剩余的ATP减少，荧光强度的变化增快。图10是不同浓度的蛋白激酶A催化反应后荧光强度的变化值与蛋白激酶A浓度之间的关系，荧光强度的变化值与酶浓度成反比，由此可以实现对蛋白激酶的定量检测。

Claims (4)

1.一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针，其结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的制备方法，其特征在于它的具体制备步骤为：在含有40～60 mL无水乙醇的100 mL圆底烧瓶中加入罗丹明B，完全溶解后溶液呈现紫红色，搅拌下逐滴加入二乙烯三胺到上述反应体系中，罗丹明B和二乙烯三胺的摩尔比为1:20～1:24，在磁力搅拌下，60～80 ℃下回流20～28 h，反应完全后，室温下冷却，经过减压蒸馏除去部分溶剂进行浓缩，然后向浓缩液中加入10～30 mL蒸馏水，用20～50 mL二氯甲烷萃取两次，合并有机相，用旋转蒸发仪去除溶剂，用体积比为12:1～5:1的二氯甲烷和乙醇的混合液为淋洗剂，硅胶柱色谱分离提纯，得到ATP荧光探针。

3.根据权利要求1所述的一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的性能研究，其特征在于：1）该荧光探针用无背景干扰的罗丹明内酰胺衍生物对生物相关的阴离子ATP进行检测；2）在这个体系中，ATP诱导罗丹明内酰胺结构开环，产生强烈的荧光，并且当加入20当量的ATP时，荧光强度增强47倍，表现出很高的灵敏度；3）该荧光探针对ATP表现出很好的选择性，不受其他磷酸根离子的干扰，如ADP，AMP，PO4^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，P₂O₇ ^4-和P₃O₁₀ ^5-；4）当pH值在6.0到8.0之间时，荧光探针对ATP的测定不受pH的影响；5）该荧光探针与ATP作用迅速，响应时间在2分钟以内。

4.根据权利要求1所述的一种基于罗丹明衍生物的ATP荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针应用于检测与ATP相关的蛋白激酶的活性。