CN111518089B - 一种检测pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用，所述的比率型荧光探针的结构式为：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
，本发明中荧光探针的制备方法简单，产品产率高，适合大规模推广应用。该荧光探针在中性条件下的荧光很弱，加至水或有机溶剂后所得溶液为淡黄色，当随着溶液酸性强度的增大，溶液的颜色逐渐消退并变成蓝绿色，并且显示出荧光增强，该荧光探针能够检测pH 2‑7范围，且在pH值为2~4时，该荧光探针具有良好的线性比率关系，能够有效的消除背景影响，提高的检测的灵敏度和准确度。

Description

一种检测pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种检测pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
生物体内H+的浓度作为pH大小的指标，其大小在生物体内环境中起到了至关重要的作用，比如说在细胞生长、凋亡、自噬等一系列细胞生理活动中都有H+的调节作用。pH值作为细胞内新陈代谢的重要参数之一，在维持细胞生长、增殖、凋亡及信号传导等正常生理过程中起着关键性作用。在真核细胞内，各个细胞器之间的pH值也存在差异，比如说溶酶体和细胞核内的pH在4.0-6.0之间，呈现弱酸性，而在线粒体中pH在8.0左右，呈弱碱性。
pH 值的检测方法主要有比色分析法、电化学法和其他方法。与这些方法相比，荧光显微镜显示出了优越的性能，选择合适的荧光探针，可以在微米级上标记细胞内pH值。活细胞的动态pH值变化可以在荧光显微镜下原位实时显示。 为了实现细胞内pH荧光成像，人们构建了多种荧光探针，它们具有不同的响应位点和荧光机制。
近年来，作为卓越的检测技术，荧光探针因为它的高选择性、高敏感性及实时成像性，已经越来越引起人们的高度关注，被广泛应用于各种物质的检测。通常情况下，荧光探针检测物质是依靠于荧光强度的增加或消减，因此探针的浓度、仪器的效率、环境等因素都会影响信号的输出。相比之下，比率型荧光探针以两个荧光信号的比值为输出信号，利用两个不同波长处荧光强度的变化，可以很好地消除这些因素。
荧光探针是检测 pH 的有效手段之一，被广泛应用于工业、环境和医学检验领域中。与电化学方法相比，该方法能够较好地消除背景干扰，而且灵敏度也有较大程度的提高，但是应用在生命领域，目前检测pH的荧光探针检测范围较低，已经报导过的探针大都是在弱酸环境下具有较好的线性关系，而对于很多强酸性环境，如胃酸、核酶、溶酶体等的检测，灵敏度则不能满足要求，因此存在不能适用的缺陷。而且这些荧光探针在生物体检测中受到的背景干扰较大，大大限制了它们的应用。因此，开发应用范围更大的比率型荧光探针检测pH是非常重要的。
发明内容
针对现有技术中存在的检测pH的荧光探针在强酸下检测灵敏度低、背景干扰大的缺陷，本发明提供了一种检测pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针可在pH在2~4时展现出良好的线性比率关系，灵敏度高，便于识别，且制备方法简单、产率高，适于大规模推广应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种检测pH的比率型荧光探针，探针的分子式为C52H50N7O6 +，结构式CS-NA如下所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明中，所述的检测pH的比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将化合物1和炔丙胺加入到乙醇中，加热反应，反应结束后将反应液倒入冰水中，DCM萃取，经柱层析提纯后得化合物2；
（2）将化合物2和N-（2-氨基乙基）吗啉溶解到乙二醇单甲醚中，加热反应，反应液用稀盐酸溶液洗涤，经柱层析提纯得化合物3；
（3）将化合物4和环己酮加入到硫酸中，加热反应，将反应液倒入到冰水当中，滴加高氯酸，析出固体，将固体用乙醇重结晶得化合物5；
（4）将化合物5和对叠氮苯甲醛加入到冰醋酸中，加热反应，反应液使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经柱层析提纯得化合物6；
（5）将化合物3和化合物6加入到氯仿中，溴化亚铜作为催化剂，滴入三乙胺，室温下反应，经柱层析后得化合物CS-NA；
pH的比率型荧光探针合成路线如下：
Figure 174359DEST_PATH_IMAGE002
。
优选地，步骤（1）中化合物1和炔丙胺的摩尔比为1：1.5；步骤（2）中化合物2和N-（2-氨基乙基）吗啉的摩尔比为1：1.2；步骤（3）中化合物4和环己酮的摩尔比为1：3；步骤（4）中化合物5和对叠氮苯甲醛的摩尔比为1：1.5；步骤（5）中化合物3和化合物6、溴化亚铜、三乙胺的摩尔比为1：1.1：3：2。
优选地，步骤（1）中所述的加热反应条件为80℃下12小时；步骤（2）中所述的加热反应条件为110℃反应12小时；步骤（3）中所述的加热反应条件为90℃下12小时；步骤（4）中所述的加热反应条件为90℃下12小时；步骤（5）中所述的反应时间为12小时。
优选地，步骤（1）所述的柱层析提纯方法为：旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比5:1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离；步骤（2）中所述的柱层析提纯方法为：用二氯甲烷萃取除去水相，旋转蒸馏除去溶剂，用少量二氯甲烷溶解固体，用体积比20：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离；步骤（4）中所述的柱层析提纯方法为：用二氯甲烷萃取除去水相，旋转蒸馏除去溶剂，用少量二氯甲烷溶解固体，用体积比5：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离；步骤（5）中所述的柱层析提纯方法为：旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比10:1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离。
优选地，步骤（3）中所述硫酸的质量份数为36%，所述高氯酸的质量分数为70%。
在本发明中，所述的检测pH的比率型荧光探针的应用，用于检测不同体系中的pH。
优选地，所述的体系包括水体系、有机溶剂体系或生物体系。
本发明所述的该荧光探针基于PET机理实现对pH的检测。当荧光探针未与H+结合时，及溶液pH呈中性时该荧光探针中吗啉环能够将其处于最高能级的电子转入到激发态下荧光基团的空的电子轨道，从而导致荧光猝灭；当吗啉环与H+结合后，降低了吗啉环的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回原基态轨道，从而增强了荧光基团的荧光发射。具体表现为荧光探针在中性条件下的荧光很弱，加至水或有机溶剂后所得溶液为淡黄色，当随着溶液酸性强度的增大，溶液的颜色逐渐消退并变成蓝绿色，并且显示出荧光增强。因此，以荧光增强、颜色发生明显改变的方式检测pH。该荧光探针能够检测pH 2-7范围，在pH为7时，该探针在525 nm处有较弱荧光，当随着溶液的酸性增强，该探针溶液变成逐渐从淡黄色变成蓝绿色，并且在525 nm处显著增强。
有益效果
（1）本发明检测pH的荧光探针对pH检测灵敏度高，而且现象明显，便于识别。
（2）本发明检测pH的荧光探针的制备方法简单，制备的产品产率高，适合大规模推广应用。
（3）本发明针对生物体的检测具有高选择性，比率型荧光探针能够有效的消除背景影响，且在pH值为2~4时，该荧光探针具有良好的线性比率关系，拓宽其在强酸环境中的使用范围，减少其他因素的干扰，提高的检测的灵敏度和准确度。
附图说明
图1为CS-NA的质谱图；
图2为实施例2中荧光探针在300-800 nm范围内的紫外吸收光谱图；
图3为实施例2中不同pH条件下荧光探针420 nm激发波长下的荧光光谱图；
图4为实施例2中不同pH条件下荧光探针420 nm和580 nm激发波长下的比率pH响应线性拟合。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
（1）将0.276 g化合物1（6-溴-1H,3H-苯并[de]异色胺-1,3-二酮）与0.08 g炔丙胺加入到20ml乙醇中，在80℃下反应12小时，TLC监测反应进程，反应结束后，将反应液旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比5:1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得化合物2；
（2）将0.156 g化合物2和0.078 g N-(2-氨基乙基)吗啉在8ml乙二醇单甲醚中溶解，在110℃下反应12小时，TLC监测反应进程，反应液用质量分数为10％的稀盐酸洗涤，将反应完成得到反应液用二氯甲烷萃取除去水相，再用旋转蒸馏除去溶剂，使用少量二氯甲烷溶解固体，用体积比20：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到化合物3，产量为0.13g，产率为72％。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.40(d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.57 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 8.1Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.85 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 3.69 (s, 4H), 3.31 (d, J =13.5 Hz, 2H), 2.74 (s, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.17 – 1.95 (m, 1H), 1.14 (s, 1H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 164.02, 163.24, 149.73, 135.02, 131.57, 129.95,126.42, 124.89, 120.48, 116.00, 104.61, 90.27, 88.51, 79.17, 69.92, 67.04,59.80, 55.99, 53.13, 38.85, 29.09. HRMS（ESI）计算得出。ForC21H21N3O3 [M] +:363.1583. found: 364.1649；
（3）将0.269 g化合物4（(4-(二乙氨基)-2-羟基苯基)(苯基)甲酮）和0.294环己酮加入到20ml质量分数36％的浓硫酸中，90℃下反应12小时，将反应液倒入到冰水当中，逐滴滴入10ml质量分数70%的高氯酸，析出固体，将固体用乙醇重结晶，得到化合物5；
（4）将0.188g化合物5和0.22g对叠氮基苯甲醛在10ml冰醋酸中90℃下冷凝回流反应12小时，TLC监测反应，将反应完成得到的溶液用二氯甲烷萃取除去水相，再用旋转蒸馏出去溶剂，使用少量二氯甲烷溶解固体，用体积比5：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到化合物6，产量为0.17g，产率为67％。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 212.74,175.28, 169.90, 166.60, 161.79, 155.90, 151.84, 150.43, 143.60, 138.67,134.40, 134.00, 131.02, 130.57, 130.55, 129.35, 129.30, 128.65, 123.65,123.64, 122.58, 118.85, 101.15, 97.17, 47.75, 44.51, 29.72, 27.17, 23.14,22.29, 12.47.
（3）将0.072化合物3和0.11g化合物6加入到10ml氯仿中，0.086g溴化亚铜作为催化剂，滴加3-4滴三乙胺，通过Click反应制备探针CS-NA，TLC监测反应进程，将反应完成得到的溶液旋转蒸馏除去溶剂，将固体于二氯甲烷中溶解，用体积比10:1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到CS-NA所示化合物，所述的CS-NA的质谱图如图1所示。1H NMR(400 MHz, MeOD) δ 8.30 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.75 – 7.65 (m, 1H), 7.52 (d, J= 6.5 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 7.21 (d, J = 31.1 Hz, 3H), 6.93 (d,J = 9.3 Hz, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 6.21 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 4.14(d, J = 7.2 Hz, 3H), 3.57 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 2.84 (s, 3H), 2.16 (d, J =20.5 Hz, 1H), 1.84 – 1.44 (m, 4H), 1.38 – 1.22 (m, 18H), 1.18 – 0.73 (m, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.06, 167.37, 164.48, 163.78, 156.16, 152.53,152.19, 149.67, 149.40, 145.00, 137.68, 137.22, 135.56, 134.88, 134.49,131.76, 131.50, 131.48, 130.59, 130.56, 129.95, 129.26, 128.52, 128.33,128.14, 127.63, 126.34, 124.96, 124.83, 123.79, 123.47, 122.93, 121.35,120.46, 120.23, 110.04, 108.84, 104.54, 97.31, 66.93, 55.92, 53.07, 44.52,41.05, 38.93, 35.02, 29.67, 29.26, 27.16, 23.09, 22.30, 12.51.HRMS（ESI）计算得出。For C52H50N7O6 [M] +: 868.3817. Found: 868.3798。
合成路线如下：
Figure 357078DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2
（1）荧光探针与H+的滴定实验
使用PBS溶液和盐酸配制不同梯度的pH溶液，加入初始浓度为1mM的荧光探针，使溶液中荧光探针的浓度为10 μM，溶液的pH梯度分别是2、3、3.5、4、5、6、7，静置0.5 h使不同梯度的pH溶液与荧光探针充分反应；
用紫外分光光度计测试300-800 nm范围内的紫外吸收光谱图，结果如图2所示，吸收波长分别在425 nm和575nm，为荧光光谱滴定实验提供前期实验基础。
（2）荧光探针与H+的滴定实验
使用PBS溶液和盐酸配制不同梯度的pH溶液，加入初始浓度为1mM的荧光探针，使溶液中荧光探针的浓度为10 μM。溶液的pH梯度分别是2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，静置0.5 h使不同梯度的pH溶液与荧光探针充分反应。
用荧光光谱仪测试不同pH条件下的荧光光谱，荧光光谱的激发波长为420 nm、580nm，发射波长为525 nm、675 nm，检测波长为525 nm、675 nm，结果如图3所示，由图3可知，随着pH的增大，525nm处荧光强度逐渐减弱，675 nm处荧光强度逐渐减弱；
以pH为横坐标，荧光强度比值I525/I675为纵坐标绘制工作曲线，在pH在2.00～4.00范围内，pH与I525/I675线性相关，相关系数为0.9932，如图4所示。因此，该荧光探针具有良好的线性比率关系，能够较好的消除生物检测中的所产生的背景影响。

Claims (8)

1.一种检测pH的比率型荧光探针，其特征在于，探针的分子式为C52H50N7O6 +，结构式CS-NA如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种权利要求1所述的检测pH的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将化合物1和炔丙胺加入到乙醇中，加热反应，反应结束后将反应液倒入冰水中，DCM萃取，经柱层析提纯后得化合物2；
（2）将化合物2和N-（2-氨基乙基）吗啉溶解到乙二醇单甲醚中，加热反应，反应液用稀盐酸溶液洗涤，经柱层析提纯得化合物3；
（3）将化合物4和环己酮加入到硫酸中，加热反应，将反应液倒入到冰水中，加高氯酸，析出固体，固体用乙醇重结晶得化合物5；
（4）将化合物5和对叠氮苯甲醛加入到冰醋酸中，加热反应，反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，经柱层析提纯得化合物6；
（5）将化合物3和化合物6加入到氯仿中，溴化亚铜作为催化剂，加入三乙胺，室温下反应，经柱层析后得荧光探针CS-NA；
pH比率型荧光探针合成路线如下：
Figure 52487DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中化合物1和炔丙胺的摩尔比为1：1.5；步骤（2）中化合物2和N-（2-氨基乙基）吗啉的摩尔比为1：1.2；步骤（3）中化合物4和环己酮的摩尔比为1：3；步骤（4）中化合物5和对叠氮苯甲醛的摩尔比为1：1.5；步骤（5）中化合物3和化合物6、溴化亚铜、三乙胺的摩尔比为1：1.1：3：2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的加热反应条件为80℃下12小时；步骤（2）中所述的加热反应条件为110℃下12小时；步骤（3）中所述的加热反应条件为90℃下12小时；步骤（4）中所述的加热反应条件为90℃下12小时；步骤（5）中所述的反应时间为12小时。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的柱层析提纯方法为：旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比5:1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离；步骤（2）中所述的柱层析提纯方法为：用二氯甲烷萃取除去水相，旋转蒸馏除去溶剂，少量二氯甲烷溶解固体，用体积比20：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离；步骤（4）中所述的柱层析提纯方法为：用二氯甲烷萃取除去水相，旋转蒸馏除去溶剂，少量二氯甲烷溶解固体，用体积比5：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离；步骤（5）中所述的柱层析提纯方法为：旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比10:1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述硫酸的质量份数为36%，所述高氯酸的质量分数为70%。
7.一种权利要求1所述的比率型荧光探针在制备检测不同体系pH试剂中的应用。
8.根据权利要求7中的应用，其特征在于，所述的体系包括水体系、有机溶剂体系或生物体系。
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